הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאמר זה יתמקד דור האנדודרם הכבד האנושי אנושי אוכלוסיות תאים גזע עובריים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

למרות ההתקדמות רעילות התרופה דוגמנות אדם, תרכובות רבים נכשלים במהלך הניסויים הקליניים, בשל תופעות לוואי צפויות. העלות של מחקרים קליניים הם משמעותיים, ולכן חיוני יותר מסכי הרעלים חזוי מפותחים לפרוס בשלב מוקדם של פיתוח התרופה (Greenhough et al 2010). Hepatocytes האדם מייצגים את המודל הנוכחי זהב סטנדרטי להערכת רעילות התרופה, אבל הם משאב מוגבל כי התערוכה פונקציה משתנה. לכן, השימוש של שורות תאים ורקמות הנציח במודלים של בעלי חיים מועסקים באופן קבוע בשל השפע שלהם. בעוד שני מקורות מידע, הם מוגבלים על ידי פונקציה עניים, השתנות המינים ו / או חוסר יציבות של תרבות (Dalgetty et al 2009). בתאי גזע pluripotent (PSCs) הם מקור חלופה אטרקטיבית של hepatocyte אדם כמו תאים (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs מסוגלים התחדשות עצמית והבחנה לכל סוגי תאים סומטיים נמצא המבוגר ובכך מייצגיםמקור פוטנציאלי בלתי נדלה של תאים מובחנים. פיתחנו הליך פשוט, יעיל ביותר, מקובל אוטומציה התשואות HLCs אדם תפקודית (Hay et al 2008; פלטשר et al 2008; חנון et al 2010; פיין et al 2011 ו Hay et al 2011). אנו מאמינים כי הטכנולוגיה שלנו יוביל לייצור להרחבה של HLCs עבור גילוי תרופות, מחלות דוגמנות, בניית חוץ הגשמי מכשירים סלולריים ואולי טיפולים להשתלה מבוסס.

Protocol

1. הכנה ראשונית של כל מניות הכימיה ציפוי של תרבות plasticware

כל השלבים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.

  1. הכנה של האדם גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים (hbFGF)
    1. הכן 10% פתרון BSA ב PBS ולסנן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
    2. מתוך הפתרון BSA 10% להכין פתרון 0.2% BSA.
    3. הוסף 10 מ"ל 0.2% BSA hbFGF solution/100 מיקרוגרם.
    4. טרום רטוב 0.22 מיקרומטר לסנן לפי פתרון סינון 5 מ"ל BSA 10% דרך המסנן. מחק את 10 מ"ל BSA לשטוף.
    5. סינון hbFGF דרך מסנן מראש הדיחה את.
    6. HbFGF Aliquot ב eppendorfs סטרילי לאחסן ב -20 ° C.
  2. הכנת Activin האדם פתרון במלאי
    1. הוסף 1 מ"ל של 0.2% BSA לתוך מזרק מראש מסנן רטוב.
    2. לדלל את Activin ב BSA 0.2% ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
    3. סנן את פעילויותיוn פתרון aliquot ב eppendorfs סטרילי, לאחסן ב -20 ° C.
  3. הכנת פתרון במלאי Wnt3a עכבר
    1. הוסף 200 μl של PBS על בקבוקון 2 מיקרוגרם של Wnt3a ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
    2. Aliquot ב eppendorfs סטרילי לאחסן ב -20 ° C.
  4. הכנת פתרון HGF האדם במלאי (1000x)
    1. לדלל את HGF ב PBS ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
    2. סנן הפתרון HGF ו aliquot ב eppendorfs סטרילי, לאחסן ב -20 ° C.
  5. הכנת פתרון M במלאי Oncostatin (1000x)
    1. לדלל את OSM ב PBS ריכוז מלאי של 20 מיקרוגרם / מ"ל.
    2. סנן הפתרון aliquot OSM וב eppendorfs סטרילי, לאחסן ב -20 ° C.
  6. ציפוי של תרבות plasticware עם Matrigel
    1. להפשיר את 10 המניות מ"ל בקבוק Matrigel לילה ב 4 ° C על הקרח ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של KO-DMEM. מערבבים היטב באמצעות טפטפות מקורר ומאחסנים 1aliquots מ"ל ב -20 ° C.
    2. הפשירי aliquot של Matrigel על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות או למשך הלילה, כדי למנוע היווצרות של ג'ל.
    3. הוסף 5 מ"ל של קר KO-DMEM כדי matrigel, ומערבבים היטב עם טפטפת.
    4. בצע עד 15 מ"ל עם קר KO-DMEM ומערבבים בעזרת פיפטה.
    5. הוסף matrigel הצלחת או הבקבוק להיות מצופה (לוח (i))
צלחת / Flask נפח / טוב או Flask
12 גם צלחת 0.5 מ"ל לכל טוב
6 גם צלחת 1 מ"ל לכל טוב
25cm 2 בקבוק 2 מ"ל לכל בקבוק

טבלה 1. כרכים מומלצים של matrigel עבור plasticware ציפוי אופייני לתרבות hESC.

    1. דגירה את הצלחת בקבוק מצופה או לילה ב 4 ° C או חדרtempature שעה 1 לפני השימוש.
    2. צלחות או צלוחיות אשר היו מצופים matrigel ניתן לאחסן 4 ° C עד 1 בשבוע. הם צריכים להיות מסומן בבירור עם התאריך שהם מצופים. מחק כל הצלחות צלוחיות או לא בשימוש בתוך שבוע.
      1. לפני השימוש לאפשר את המיכל תרבות מצופה לעלות לטמפרטורת החדר בתוך ברדס בתרבית רקמה.
      2. מיד לפני השימוש לשאוב matrigel ולהוסיף את ההשעיה תא לבאר או בקבוק.

2. תחזוקה שוטפת של תרבויות hESC ואפיון

  1. החייאה של קווי hESC
    1. הסר hESCs מ אחסון חנקן נוזלי ובמהירות להפשיר בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
    2. מעבירים את ההשעיה תא בקפידה צינור סטרילי המכיל כמה מ"ל של מדיום חם.
    3. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה @ מהירות נמוכה 5min (1000 סל"ד).
    4. לשאוב את resus supernatant ובעדינות רבהpend את התאים לתוך המדיום ES חם על צלחת שכבה מזין MEF.
    5. תאים Refeed יומיומי עם המדיום ES טריים על subconfluence, התאים, התאים דורשים passaging.
  2. HESC תחזוקה שגרתיות
    תאים ES מגודלים צלחות או צלוחיות מצופה matrigel. התאים צריכים להיבחן והאכילה יומי:
    1. בדוק מתחת למיקרוסקופ על מורפולוגיה, תא זיהום מפגש.
    2. לשאוב את המדיום בילו.
    3. הוספת נפח מתאים של טרי בינוני עכבר עובריים פיברובלסטים אילף (MEF-CM) + האדם bFGF (ריכוז סופי 4 ng / mL) או אמצעי תשלום בסרום 6.
  3. תאים Passaging עם collagenase
    קווי hESC (H1, H9 ו RCM-1) יגיע מפגש כל 5-7 ימים הבאים passaging ביחס לפצל 01:03. HESCs מעבר מוקדם בנוכחות stroma לגדול לאט את הזמן על matrigel יכול להפוך לגורם חשוב. ESCs אדם לא צריך להיות שמאל יותר מ 14ימים matrigel אותו בשל השפלה מטריקס במקרה זה ייתכן שיהיה צורך למעבר התאים ביחס 1:01 או 1:02 פיצול אם התאים הם subconfluent.

    אנזימים דגירה
    1. כל השלבים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.
    2. ודא שיש מנה חדשה matrigel בקבוק מצופה או מוכן כאמור בסעיף 1.6.
    3. החלט על יחס הפיצול הרצוי עבור התאים. מספר גורמים מעורבים בהחלטה לפצל את היחס:
      1. רמה גבוהה של stroma עם מספרים נמוכים של מושבות: ניתן passaged חזרה לגודל קטן יותר טוב או יכול להיות passaged 01:01 אשר להיפטר כמה stroma ובכך להגדיל את המושבה יחס stroma, לקדם צמיחה hESC.
      2. רמה גבוהה של stroma עם מושבות גדולות, תלוי במספר מושבות, יכול להיות passaged 01:01 או 01:02 אם יש מושבות hESC גדול מספיק.
      3. HESCs צומח אופייני עם str קצתסבתא או לא stroma ו / או בידול ניתן passaged 1:02 או 3.
      4. לשאוב את התקשורת מן הבאר או בקבוק.
      5. לשטוף פעם אחת עם 2 MLS PBS (-MgCl 2,-CaCl 2).
      6. הוספת נפח מתאים של collagenase (200 U / mL מדולל KO-DMEM) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות. מ 2 דקות ואילך לבחון באופן קבוע תחת המיקרוסקופ (1 דקות intervals). בנקודה התאים הבדיל מתחילים להמריא ומושבות מתחילים להרים בקצה התאים מוכנים passaged.
    אוספות ואיגום hESCs
      1. לשאוב collagenase.
      2. לשטוף פעם אחת עם 2 MLS PBS (-MgCl 2,-CaCl 2).
      3. הוספת נפח מתאים של MEF-CM בהתאם יחס הפיצול, ושימוש מגרד תא פיזית להסיר את התאים מפני השטח של טוב או בקבוק, אז triturate gently ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים בעזרת פיפטה 10 מ"ל. חשוב כי hESCs נשמרים גושים של תאים לא שבור לתוך תאים בודדים.
    Replating hESCs
      1. Replate ההשעיה התא וכתוצאה מכך על גבי צלוחיות חדש matrigel או בארות מצופה.
      2. הפוך את עוצמת הקול של MEF-CM עד 4 מ"ל במשך היטב של צלחת 6 באר.
      3. כאשר הנחת התאים להתסיס חממה מיכל בתרבית רקמה על מנת להבטיח ככל אפילו הפצה אפשרית של מושבות כמו במושבות נוטים להתיישב במרכז התרבות רקמות הצלחת / הבקבוק המשפיעים replating תא והבחנה.
  4. אפיון שגרתיות של אוכלוסיות hESC על ידי זרימת cytometry
    1. אוכלוסיות hESC נבחנים דרך cytometry זרימה אחת לחודש עבור סמנים תא גזע כגון אוקטובר 3 / 4, Tra 1-60 ו SSEA-4.
    2. hESCאוכלוסיות יוסרו מן המצע שלהם, כמו המתלים תא בודד לאחר טיפול 5 דקות עם טריפסין / EDTA (Invitrogen).
    3. Resuspend תאים בודדים בכל 1x10 6 תאים / מ"ל PBS בתוספת BSA 0.1% ו 0.1% אזיד הנתרן.
    4. דגירה ההכנות התא 4 ° C עם נוגדנים מתאימים במשך 40 דקות.
    5. שטפו פעמיים עם תאים PBS בתוספת BSA 0.1% ו 0.1% אזיד הנתרן להסיר נוגדן מאוגד ו resuspend לנפח סופי של 100 μL ולנתח ידי cytometry הזרימה.
    6. נתונים עבור 30,000-40,000 אירועים "חיים" נרכשים עבור כל דגימה באמצעות cytometer קליבר FACS מצויד לייזר 488 ננומטר ונותחו באמצעות תוכנת CellQuest (בקטון דיקינסון, בסן חוזה, קליפורניה). תאים בלא כתם כלולים שולטת. תאים אפופטוטיים המלח יחד עם פסולת הוצאו בניתוח באמצעות שער לחיות אלקטרוני על פיזור קדימה פיזור הפרמטרים בצד.

3. Differentiation של hESCs האנדודרם אל הכבד

  1. הכנת מדיה עבור בידול של hESCs האנדודרם אל הכבד. הכנת כל כלי התקשורת צריכים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.
    1. הכנת RPMI: B27 בינוני תחול על בידול האנדודרם
      1. במשך בינוני B27 RPMI, לערבב RPMI 1640 (500 מ"ל) ו - B27 (50x, 10 מ"ל)
      2. מערבולת לערבב הרכיבים.
      3. מוסיפים את כל המרכיבים ליחידה מסנן המסנן תחת חנות ואקום, בשעה 4 ° C.
    2. הכנה של מדיום SR-DMSO על בידול hepatocyte
      1. במשך בינוני SR-DMSO, לערבב 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0.5% L-גלוטמין, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו, 0.1mm β-Mercaptoethanol ו DMSO 1%.
      2. סנן את הפתרון תחת vacum, לאחסן ב 4 ° C ו aliquot ולאחסן ב -20 ° C אם נדרש.
      3. השתמש 4 מ"ל לכל צלחת יפה של 6-היטב, 6 מ"ל לכל בקבוק T25.
    3. הכנה של מדיום L15 התבגרות עבור HEPAtocyte התבגרות
      1. עבור L-15 בינוני, 500 מ"ל לערבב ליבוביץ L-15 בינוני, tryptose פוספט מרק (הריכוז הסופי 8.3%), מובטל החום העובר שור בסרום (הריכוז הסופי 8.3%), 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate, 1 מיקרומטר אינסולין (הלבלב שור ), 1% L-גלוטמין, חומצה אסקורבית 0.2%.
      2. סנן את הפתרון תחת vacum, לאחסן ב 4 ° C ו aliquot ולאחסן ב -20 ° C אם נדרש.
    4. הכנת RPMI סופי: B27 בינוני תחול
      1. לוותר על נפח הנדרש בינוני תחול לניסוי (1 מ"ל לכל צלחת יפה של 6 באר, 2 מ"ל לכל בקבוק T25).
      2. הוסף Activin לריכוז סופי של 100 ng / mL.
      3. הוסף רקומביננטי Wnt3a לריכוז סופי של 50 ng / mL.
      4. מערבבים היטב בכלי התקשורת עכשיו הוא מוכן לשימוש.
      5. מדיה זו הסופי צריך להיות מורכב טריים כל יום.
    5. הכנת הסופי בינוני L-15 התבגרות
      1. לוותר על הנדרשנפח בינוני L-15 עבור הניסוי (4 מ"ל לכל צלחת יפה של 6 באר, ו 6 מ"ל לכל בקבוק T25).
      2. הוסף HGF לריכוז סופי של 10 ng / mL.
      3. הוסף OSM לריכוז סופי של 20 ng / mL.
      4. מערבבים היטב בכלי התקשורת עכשיו הוא מוכן לשימוש.
      5. מדיה זו הסופי צריך להיות מורכב טריים כל יום.
  2. תחול hESCs כדי האנדודרם סופי
    1. תרבות hESCs (H1, H9 ו RCM-1) ולהפיץ על צלחות מצופה matrigel עם פיברובלסטים עכבר עובריים MEF-CM בתוספת bFGF.
    2. ליזום בידול הכבד כאשר hESCs להגיע לרמה confluency של כ -30% -60% (תלוי בקו hESC) על ידי החלפת MEF-CM עם המדיום תחול (RPMI 1640-B27 בתוספת 100 ng / mL Activin ו 50 ng / mL Wnt3a.
    3. התאים בתרבית בינוני תחול במשך 3 ימים (שינוי בינונית כל 24 שעות), בינוני תחול הסופי עם Activin ו Wnt3a מורכב טרי בכל יום.
    4. תרבות יום ב 8 התאים בינוני התבגרות ותחזוקה (L-15) בתוספת 10 ng / mL hHGF ו 20 ng / mL OSM עבור 9 ימים (שינוי בינוני כל 48 שעות). התבגרות ותחזוקה בינוני עם hHGF ו OSM מורכב טריים כל יום.
    5. התאים בהדרגה התערוכה שינויים מורפולוגיים מהצורה קוצים / משולש מורפולוגיה הכבד המאפיין הצגת מראה מצולע (איור 2A).
    6. Schematic עבור בידול hepato הסלולר:

4. אפיון האנדודרם נגזר hESC הכבד

  1. Immunostaining
    1. לשטוף HLCs hESC נגזר עם PBS פעמיים, 1 דקה כל לשטוף.
    2. תקן את HLCs עם PFA 4% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, (התאזה יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 ° C ו מוכתם במועד מאוחר יותר). התאים יכולים גם להיות קבוע עם מתנול קר קרח למשך 10 דקות ב -20 ° C.
    3. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד לשטוף.
    4. דגירה התאים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם אתנול 100% מכתים גרעיני (שלב זה אינו נחוץ אם קיבעון מתנול משמש).
    5. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד לשטוף.
    6. חסום את התאים עם PBS / T (0.1% tween) / BSA 10% במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
    7. הסר את חוצץ חסימת ומוסיפים את הנוגדן העיקרי בהתאמה מדולל PBS / T (0.1% tween) / BSA 1% ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, או לילה ב 4 ° C בהתרגשות.
    8. שוטפים את התאים 3 פעמים עם PBS / T (0.1% tween) / 1 BSA% בטמפרטורת החדר, 5 דקות כל אחד לשטוף.
    9. הוסף המתאים משני אלקסה פלואוריד נוגדן (1:400) מדולל PBS אל התאים דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 בחושך בהתרגשות. שוטפים את התאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד לשטוף.
    10. הר כל טוב עם MOWIOL 4-88 ו DAPI (1:1000). מכסים היטב עם פליטת כיסוי, לחיצה על coverslip בעדינות על מנת להבטיח כי כל בועות האוויר מוסרים ולאחסן ב 4 ° C בחושך.
  2. RNA בידוד מיצוי
    1. שטפו את HLCs hESC נגזר עם PBS ואת לשאוב.
    2. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט TRIZOL ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    3. גרדו את התאים ומכניסים 1.5 מ"ל Eppendorf (החנות ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר אם נדרש).
    4. הוסף 0.5 מ"ל של כלורופורם על Eppendorf ומערבבים על ידי היפוך, לוודא שזה נעשה במנדף קטר.
    5. צנטריפוגה הפתרון ב 13,000 סל"ד במשך 15 דקות 4 ° C.
    6. אסוף את השכבה במקום מימיות לתוך Eppendorf נקי, יש לוודא שאין זיהום מממשק.
    7. הוסף 1 מ"ל של isopropanol ומערבבים על ידי היפוך, להשאיר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות precipiטייט רנ"א.
    8. צנטריפוגה ב 13,000 סל"ד במשך 10 דקות 4 ° C.
    9. לשאוב supernatant ולוודא לא להפריע גלולה RNA. לשטוף עם 0.5 מ"ל של אתנול 70% ומשאירים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    10. צנטריפוגה ב 8000 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    11. לשאוב אתנול ולהשאיר לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
    12. לאחר כל אתנול התאדו, resuspend את הכדור ב 30 μl מים deionised. חנות RNA ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
    13. לכמת את ריכוז RNA באמצעות nanodrop.
  3. שעתוק לאחור PCR
    1. הגדרת התגובה באמצעות בעבר RNA בודד (200 ng), hexamers אקראי, נוקלאוטידים (10mm) transcriptase הפוכה ו חיץ בהתאמה דקה חומה 0.5 מ"ל Eppendorf.
    2. הגדרת RT שלילית, התגובה לעיל ללא transcriptase הפוכה.
    3. מניחים את צינורות לתוך Cycler תרמו, המכונה PCR, וכן להגדיר את p הבאיםrogram:
      1. 37 ° C - 5 דקות (1 מחזור)
      2. 42 ° C - 1 שעה (1 מחזור)
      3. 95 ° C - 5 דקות (1 מחזור)
    4. חנות cDNA ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר במידת הצורך.
  4. TaqMan transcriptase כמותי הפוך פולימראז שרשרת קציר תגובת התאים בנקודות זמן שונות לאורך הפרוטוקול בידול. חלץ את RNA ולבצע qPCR שעתוק לאחור באמצעות primers הבאים Assay על פי דרישה, (Applied Biosystems) פרוטוקול:
    1. אוקטובר 4 Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. אלבומין Hs00910225_m1
    4. אלפא fetoprotein Hs00173490_m1

עבור בידוד RNA ו מיצוי אנא עיין בסעיף 3.3.2

  1. שעתוק הפוך ו TaqMan qPCR
    1. קח 1 מיקרוגרם של רנ"א הפוך לתמלל את cDNA באמצעות כתב עילי של Invitrogen שעתוק III הפוכההערכה, לפי הוראות היצרן.
    2. 1 μl של cDNA המשמשים תגובה 25 TaqMan μl המורכב של primers המתאים Applied Biosystems, 18S primers לשלוט ריבוזומלי ופלטינה 2x Invitrogen של qPCR supermix UDG עם רוקס וכן נפח מתאים של מים.
    3. מערבבים היטב ומניחים 10 μl של כל דגימה לשתי בארות של צלחת או 96 או 384 qPCR היטב.
    4. לאחר כל דגימות נטענים, בתוספת בקרה נאותים), לאטום את הצלחת לנתח על מכונת Biosystems יישומית TaqMan 7900HT.
    5. תוצאות מבוטאות הביטוי היחסי על מדגם שליטה.
  1. ניתוח פונקציונלי של האנדודרם הכבד נגזר hESC ציטוכרום P450 מבחני - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. דגירה 17 יום hESC נגזר HE עם המצע הספציפי 5 שעות 37 ° C (n = 3). השתמש תרבות המדיה כמו רקמההשליטה דגירה שלילית על 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
    2. אסוף את supernatants ולבצע את assay לפי הוראות היצרן.
    3. מדדו את רמות היחסי של פעילות הבסיס, לנרמל לחלבון מ"ג כפי שנקבע על ידי Assay BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

הערות

  1. הכרכים כולם מבוססים על פורמט 6-גם צלחת. התאם את הכרכים בהתאם לצלחת את הבקבוק או חובה.
  2. כל מדיום, תחול התמיינות והתבגרות מסוננת תחת ואקום לפני השימוש.
  3. בינונית, תחול בידול והתבגרות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות. להעריך כמה בינוני נדרשת עבור הניסוי aliquot התקשורת שנותרו בחנות ב -20 ° C לשימוש עתידי.
  4. Matrigel מורכב לפי הוראות היצרן: 1 aliquots מ"ל ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  5. Groגורמים wth עשתה פעם למעלה aliquoted ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר מופשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות.
  6. נוגדן ראשוני משמש בדרך כלל כדי לאפיין HLCs hESC נגזר הוא אלבומין (1:250, Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי).

5. נציג תוצאות:

אפיון hESCs שמרו לפני בידול הכבד

על מנת לאפיין את תא גזע מעמדם של H9 hESCs השתמשו במחקר למדנו מספר פרמטרים. התאים הציג מורפולוגיה hESC, קטן, תאים צפופים גדל במושבות מוגדר (איור 1A) והביע תא גזע pluripotent סמנים גן, אוקטובר, 3 / 4 Nanog (איור 1B). לא מצאנו הבדלים משמעותיים בביטוי של גנים אלה לעומת שליטה קו hESC H7 חיובית. בנוסף, 90.1% מהאוכלוסייה hESCs היתה חיובית עבור הסמן בתאי גזע SSEA-4 (תרשים 1C).

הואSC בידול כדי האנדודרם הכבד

בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות מובחן ביעילות האנדודרם הכבד במבחנה (Hay et al 2008). באותו יום 9 של בידול, התאים נקצרו והבחנה של hESC כדי HLCs הוערך. כפי שדווח בעבר hESCs הציג סדרה של שינויים מורפולוגיים עמוקה, וביום 9, הציג מורפולוגיה hepatocyte מוקדם בפיתוח מראה polygonal (איור 2A). יתר על כן, downregulation של אוקטובר, 3 / 4 על 9 כמובן זמן היום נצפתה (2B איור). לעומת זאת, היו תמלילי הכבד AFP ו אלבומין מעלה מוסדר (איור 2C) מ - 7 יום ואילך.

בשנת התבגרות במבחנה של האנדודרם כבדית

האנדודרם כבדית היה התבגר במבחנה באמצעות ההליך הוקמה (Hay et al 2008). ביום האחרון של תרבויות בידול היו immunostained עבור סמנים הכבד האנושי אלבומין, AFP ו-E-cadherin. התשואה של HLCs באמצעות שלנו ההליך הוא בדרך כלל 90% (Hay et al 2008; חנון et al 2010; פיין et al 2011). HLCs מוכתם חיובית אלבומין, אלפא fetoprotein ו-E-cadherin (איור 3).

איור 1
באיור 1. אפיון hESCs השתמשו במחקר זה. (א) בניגוד שלב מיקרוסקופיה תמונות נציג מורפולוגיה hESC שנצפתה תרבות בהגדלה 10x ו 4x. התמונות שנלכדו באמצעות מיקרוסקופ TE3000 / U הפוכה ניקון (ב) hESCs בתרבית הם Octamer (אוקטובר 3 / 4) חיובי חיובי Nanog. H7 hESCs היו להשתמש כביקורת על רמות הביטוי pluripotency גן. הביטוי מתייחס יחסית קפלי אינדוקציה בהשוואה לשלוט גן אנדוגני, β-2-microglobulin. (ג) מגרשים FACS להראות משטח hESC סמן הביטוי רמות, כולל אנטיגנים ספציפיים בשלב העוברי SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
באיור 2. (א) בניגוד שלב מיקרוסקופיה נציג תמונות של hESC הנגזרות מורפולוגיה האנדודרם הכבד ביום 9 של בידול שנצפה תרבות, על x4 הגדלה x10. (ב) אפיון השינויים בביטוי הגנים. RNA הופק ואת cDNA נותח על ידי תגובת שרשרת פולימרז כמותי, מראה downregulation פרוגרסיבי של תאים שלא עברו התמיינות ביטוי גנים (אוקטובר 3 / 4) ו - (ג) upregulation של ביטוי גנים hepatocyte (אלבומין ו α-fetoprotein). הביטוי מתייחס יחסית קפלי אינדוקציה בהשוואה לשלוט גן אנדוגני, β-2-microglobulin ביום 0 של בידול. P <0.05 מצוין * ו P <0.001 מצוין *** נמדד על ידי סטודנטים מבחן t בהשוואה hESCs ביום 0. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן 1.

איור 3
באיור 3. Characterisation של האנדודרם-hESC נגזר הכבד
Immunocytochemistry מראה ביטוי של סמנים hepatocyte, אלבומין, AFP ו-E-cadherin ב hESC (H9) האנדודרם הכבד נגזר. בקרות שליליות בוצעו עם אימונוגלובולינים G המקביל (IgG) ונציגי התמונות מוצגות.

איור 4
איור 4. (H9) hESC HLCs נגזר בתערוכה הפעילות המטבולית. בגיל 17 יום, H9 הבדיל כדי HLCs הציג פעילות CYP3A מטבולית (n = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו מודל פשוט, הומוגנית לשעתקו מאוד במבחנה כדי לייצר רמות להרחבה של HLCs האדם. המודל שלנו קיבל תוקף על ידי מספר מעבדות פעולה חיצוניים. אנו שגרתי לאפיין בתאי גזע שמקורם HLCs באמצעות ארגז הכלים שלנו לבית של סמנים התפתחותי מסוים מבחני תפקודי כבד (שרובם זמינים מסחרית). שלבים קריטיים בתהליך שלנו הן: שמירה על תא גזע pluripotency; היכולת לכוון תא גזע האנדודרם בידול מוחלט, את המפרט של תרבויות הומוגניות של האנדודרם הכבד ואת היכולת להפיק האנדודרם הכבד בוגרת מציג פונקציה מגוון רחב במבחנה.

מגבלה אחת לפריסה בקנה מידה גדול של תא גזע שמקורם HLC הטכנולוגיה כבר את הפונקציה לטווח קצר מובחן של האנדודרם הכבד בוגרת בתרבות (~ 4 ימים על matrigel). ככזה יש לנו הוקרן פולימרהספריה תומכת הסלולר ביו פעיל הרומן. זה הוביל לזיהוי של תמיכה רומן אשר שומרת על תפקוד הכבד במשך לפחות 15 ימים. הכיוונים העתידיים של טכנולוגיה זו הם בתחילה יישומים תעשייתיים בתהליך גילוי סמים (Hay et al 2011). רווחי לטווח בינוני טופס בטכנולוגיה זו צפויים להיות humanised חוץ הגשמי תמיכה בכבד מכשירים לגישור או בטיפול בחולים עם מחלת כבד. רווחי לטווח ארוך מ - הטכנולוגיה הזו יכולה בטיפול התא מבוסס השתלת עבור מחלות כבד, אולם הנתונים הנוכחיים מראה כי אסטרטגיה זו דורשת מאמץ ניכר לפני שניתן יהיה להשתמש בבטחה במרפאה (פיין et al 2011).

לסיכום, המשמעות של הטכנולוגיה שלנו במבחנה הוא היכולת ליצור תרבויות הומוגני אינסופי של נאמנות גבוהה HLCs האדם ביולוגיה מיושם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

ד"ר חי נתמכה על ידי מלגה RCUK, ד"ר המערבית נתמכה על ידי מחלקת כירורגיה, ד"ר Medine נתמך על ידי מענק מהקרן Core BHF, מר בלטסאר Lucendo-Villarin נתמכה על ידי דוקטור MRC Studenship. ד"ר ג'ואו נתמכה על ידי מלגה מהממשלה הסינית.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics