인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Biology

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Summary

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

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Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

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Abstract

모델링 인간의 약물 독성의 진전에도 불구하고, 많은 화합물 unpredicted 부작용으로 인해 임상 실험 중에 실패합니다. 임상 연구의 비용은 실질적으로 있으며, 따라서 더 예측 독성학 화면은 개발 및 약물 개발 (Greenhough 외 2010) 초기에 배치되는 중요합니다. 인간 hepatocytes 약물 독성 평가에 대한 현재 황금 표준 모델을 대표하지만, 변수 함수를 전시 제한된 리소스입니다. 따라서, 불후의 세포 라인과 동물 조직 모델의 사용은 정기적으로 자신의 풍부한로 인해 고용하고 있습니다. 두 소스가 유익한 있지만, 그들은 가난한 기능, 종의 다양성 및 / 또는 문화에 불안정 (Dalgetty 외 2009)에 의해 제한됩니다. Pluripotent 줄기 세포 (PSCs)은 세포와 같은 인간 hepatocyte의 매력적인 대안 소스 (HLCs) (Medine 외 2010)입니다. PSCs 자기 갱신과 성인에있는 모든 체세포 유형 분화 수 있으며, 따라서 대표차별화된 세포의 가능성이 무진장 소스. 우리는 자동화 및 산출 기능 인간 HLCs (; 플레쳐 외 2008; Hannoun 외 2010; 페인 외 2011 헤이 헤이 외 2011 외 2008) 의무, 고효율, 간단하게 절차를 개발하였습니다. 우리는 우리의 기술은 약물 발견, 질병 모델링, 엑스트라 물질 장치의 건설과 가능성을 기반으로 세포 이식 요법에 대한 HLCs의 확장 생산으로 이어질 것이라 생각합니다.

Protocol

1. 초기 모든 화학 주식 준비와 문화 plasticware의 코팅

모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다.

  1. 인간의 기본적인 Fibroblast의 성장 인자 (hbFGF)의 준비
    1. 0.22 μm의 필터를 통해 PBS 및 필터에서 10 % BSA 솔루션을 준비합니다.
    2. 10 % BSA 용액에서 0.2 % BSA 솔루션을 준비합니다.
    3. 10 ML 0.2 % BSA solution/100의 μg의 hbFGF을 추가합니다.
    4. 사전 서부 유럽 표준시 0.22 μm의 필터를 통해 5 ML 10 % BSA 솔루션을 필터링하여 필터링합니다. 10 ML BSA 씻어 폐기하십시오.
    5. 미리 씻은 필터를 통해 hbFGF을 필터링합니다.
    6. -20 ° C.에 살균 eppendorfs 및 저장소에 나누어지는 hbFGF
  2. 인간 Activin 증권 솔루션에게의 준비
    1. 주사기 및 서부 유럽 표준시 미리 필터에 0.2 % BSA 1 ML을 추가합니다.
    2. 100 μg / ML의 재고 농도 0.2 % BSA에 Activin을 희석.
    3. Activi를 필터링N 무균 eppendorfs의 솔루션과 나누어지는, -20 ° C.에 저장
  3. 마우스 Wnt3a 주식 솔루션의 준비
    1. 10 μg / ML의 재고 농도 Wnt3a의 2 μg의 약병에 PBS 200 μl를 추가합니다.
    2. -20 ° C.에 살균 eppendorfs과 가게에서 나누어지는
  4. 인간 HGF 증권 솔루션 (1000X)의 준비
    1. 10 μg / ML의 재고 농도로 PBS에서 HGF를 희석.
    2. 멸균 eppendorfs에서 HGF 솔루션과 나누어지는, -20 ° C.에 상점을 필터
  5. Oncostatin M 증권 솔루션 (1000X)의 준비
    1. 20 μg / ML의 재고 농도로 PBS에서 OSM을 희석.
    2. 멸균 eppendorfs의 OSM 솔루션과 나누어지는, -20 ° C.에 상점을 필터
  6. Matrigel과 문화의 코팅 plasticware
    1. 4 밤새 Matrigel의 10 ML 주식 병을 녹여 ° 얼음과 다음 KO - DMEM 10 ML을 추가할에 C. 냉장 pipettes 및 저장 1을 사용 잘 혼합-20 ° C.에 ML의 aliquots
    2. 4 Matrigel의 나누어지는 ° C 이상에서 2 시간 또는 젤의 형성을 피하기 위해 야간 위해를 녹여.
    3. matrigel로 추위 KO - DMEM 5 ML 추가 피펫과 잘 섞는다.
    4. 추위 KO - DMEM과 피펫을 사용하여 혼합과 15 ML까지합니다.
    5. (표은 (i)) 코팅으로 판 또는 술병에 matrigel 추가
플레이트 / 플라스크 볼륨 / 음 또는 술병
12 잘 플레이트 물론 당 0.5 ML
6 - 잘 플레이트 물론 당 1 ML
25cm 2 플라스크 플라스크 당 2 ML

표 1. hESC 문화에 대한 일반적인 코팅 plasticware에 대한 matrigel의 추천 권.

    1. 4 코팅 강판이나 술병은 밤새 품어 ° C 또는 방사용하기 전에 1 시간 tempature.
    2. matrigel 코팅되었습니다 접시 또는 flasks는 최대 일주 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 그들은 분명 그들이 코팅된되었던 날짜 표시되어야합니다. 일주일 이내에 사용하지 않는 접시 또는 flasks 폐기하십시오.
      1. 전에 사용은 코팅 문화 컨테이너는 조직 문화 후드 내부 실내 온도까지 올 수 있습니다.
      2. 바로 전에 matrigel을 기음 사용하고 잘 또는 술병에 세포 현탁액을 추가할 수 있습니다.

2. hESC의 문화와 특성의 정기 점검

  1. hESC 라인의 인공 호흡
    1. 액체 질소 저장에서 hESCs를 제거하고 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 녹여.
    2. 따뜻한 매체의 몇 ML를 포함하는 무균 튜브에 조심스럽게 세포 현탁액을 전송합니다.
    3. 펠렛 원심 분리하여 세포를 5 분 대한 @ 저속 (1000 RPM).
    4. 뜨는 매우 부드럽게 resus을 기음따뜻한 ES 매체와 MEF 피더 레이어에 접시 밖으로 세포를 pend.
    5. 신선한 ES 매체와 subconfluence, 세포에 매일 Refeed 세포는 세포가 passaging 필요합니다.
  2. 정기 hESC 유지 보수
    ES 세포는 접시 또는 matrigel 코팅 flasks에서 재배됩니다. 세포가 매일 검사하고 공급해야합니다 :
    1. 오염, 세포 형태학 및 합류에 대한 현미경 검사.
    2. 지출 매체 기음.
    3. 신선한 마우스 배아 Fibroblast - 에어컨 중간 (MEF - CM) + 인간의 bFGF (최종 농도가 4 NG / ML) 또는 기타 혈청 무료 미디어 6의 적절한 볼륨을 추가합니다.
  3. collagenase와 Passaging 세포
    hESC 라인 (H1, H9와 RCM - 1) 1시 3분 분할 비율에 passaging 다음 모든 5~7일 합류에 도달할 것입니다. 기질의 존재에 조기 통과 hESCs는 느리게 성장하고 matrigel에 시간이 중요한 요소가 될 수 있습니다. 인간 ESCs은 더 이상 14 이상 남아있을 수 없습니다매트릭스 저하로 인해 동일한 matrigel과 세포 subconfluent하는 경우이 인스턴스에 통과 1:1 또는 1시 2분 분할 비율에 세포를해야 할 수도 있습니다 일.

    효소 배양
    1. 모든 단계는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다.
    2. 섹션 1.6 당 만반의 준비를 새로운 matrigel 코팅 접시 또는 플라스크가 있는지 확인합니다.
    3. 세포에 원하는 분할 비율을 결정합니다. 요인은 분할 비율을 결정에 관련된 :
      1. 식민지의 낮은 숫자로 기질의 높은 수준 : 작은 크기로 잘 돌아 passaged 수 있습니다이나 기질을 제거하기 때문에 hESC의 성장을 촉진, 기질 비율 식민지 증가합니다 1시 1분을 passaged 수 있습니다.
      2. 충분히 큰 hESC의 식민지가있는 경우 식민지의 수에 따라 큰 식민지와 기질의 높은 수준, 1시 1분 또는 1시 2분을 passaged 수 있습니다.
      3. 약간의 하위 버전과의 호환과 함께 전형적인 성장 hESCsOMA 여부 기질 및 / 또는 일부 차별화는 1시 2분 또는 3 passaged 수 있습니다.
      4. 잘 또는 술병에서 미디어를 기음.
      5. 이 MLS PBS (- MgCl 2, CaCl - 2) 한 번 씻으십시오.
      6. collagenase의 적절한 볼륨을 (200 U / ML KO - DMEM에 희석) 추가 37 품어 ° C를 2-5 분. 2 분 이후는 현미경 (1 분 간격)에 따라 정기적으로 검사하십시오. 시점에서 차별화된 세포가 떠 시작하고 식민지는 세포가 passaged 준비하는 가장자리 리프트 시작합니다.
    hESCs 근근이 살아가고 및 풀링
      1. collagenase를 기음.
      2. 이 MLS PBS (- MgCl 2, CaCl - 2) 한 번 씻으십시오.
      3. 분할 비율에 따라, 육체적으로 잘 또는 술병의 표면에서 세포를 제거하는 세포 스크레이퍼를 사용하여 MEF - CM의 적절한 볼륨을 추가, 다음 세대를 씹다tly 10 ML의 피펫을 사용하여 2-3 시간을 위, 아래 pipetting하여. hESCs가 세포의 대단히 짧은 시간에 보관하고 다른 하나의 세포로 깨진하지 않는 것이 중요합니다.
    hESCs를 Replating
      1. 새로운 matrigel 코팅 flasks이나 우물에 나타나는 세포 현탁액을 Replate.
      2. 최대 6 잘 접시의 우물 4 ML에 MEF - CM의 볼륨을 확인합니다.
      3. 식민지 판 / 플라스크 세포 replating과 차별화에 영향을 미치는 조직 문화의 중심에 정착하는 경향으로 보육 선동에 전지를 배치하면 조직 문화 컨테이너는 심지어 식민지 가능한 배포되도록합니다.
  4. 유동세포계측법으로 hESC 인구의 일상 특성
    1. hESC의 인구는 같은 10월 3일 / 4, 육차원속의 10-60과 SSEA - 4와 같은 줄기 세포 마커를 위해 한 달에 한 번 유동세포계측법를 통해 심사하고 있습니다.
    2. hESC단세포 정지는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Invitrogen)과 5 분 치료를 아래와 같이 인구들은 기판에서 제거됩니다.
    3. 1x10 6 셀 / 0.1 % BSA 및 0.1 %의 나트륨 azide와 보충 PBS에 ML에서 단일 세포를 Resuspend.
    4. 40 분 적절한 항체 4 ° C에서 셀 준비를 품어.
    5. PBS는 언바운드 항체를 제거하고 100 μL의 최종 볼륨 resuspend 및 유동세포계측법에 의한 분석 0.1 % BSA 및 0.1 %의 나트륨 azide와 보충과 함께 두 번 세포를 씻으십시오.
    6. 30000-40000 "라이브"이벤트에 대한 데이터는 488 - nm의 레이저를 갖춘 FACS 구경 cytometer를 사용하여 각 샘플에 대한 인수 및 CellQuest 소프트웨어 (Becton 디킨슨, 산호세, CA)를 사용하여 분석하고 있습니다. 흠없는 세포는 컨트롤로 포함되어 있습니다. 부스러기와 함께 죽고 apoptotic 세포는 앞으로 산란과 측면 산란 매개 변수에 전자 라이브 게이트를 사용하여 분석에서 제외되었습니다.

3. Differenti간장 endoderm로 hESCs의 ation

  1. 간장 endoderm로 hESCs의 차별 화를위한 미디어 준비. 모든 미디어 준비는 무균 조건 하에서 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다.
    1. RPMI의 준비 : endoderm의 차별 화를위한 B27 마중물 매체
      1. RPMI - B27 매체 혼합 RPMI 1640 (500 ML)와 B27 (50x, 10 ML)에 대한
      2. 구성 요소를 섞어 소용돌이.
      3. 4 진공 저장, 아래 필터 장치 및 필터 ° C.에 모든 구성 요소를 추가합니다
    2. hepatocyte 차별 화를위한 SR - DMSO 매체의 준비
      1. SR - DMSO 매체에 대한 80 % KO - DMEM, 20 % KO - SR, 0.5 % L - 글루타민, 1 %가 아닌 필수 아미노산, β - 메르 캅 토 에탄올 0.1mM 1 %의 DMSO를 섞는다.
      2. 4 vacum 아래 솔루션 저장소를 필터 ° C와 필요한 경우에는 -20 ° C에서 나누어지는하고 저장합니다.
      3. 4 ML 당 우물 6 잘 판, 그리고 T25 플라스크 당 6 ML을 사용합니다.
    3. hepa에 대한 L15 성숙 매체의 준비tocyte 성숙
      1. 에 대한 L - 15 매체 혼합 500 ML Leibovitz L - 15 중간, tryptose 인산 수프 (최종 농도 8.3 %), 열 inactivated 태아 소 혈청 (최종 농도 8.3 %), 10 μm의의 하이드로코티손 21 - hemisuccinate, 1 μm의의 인슐린 (소 췌장 ), 1 % L - 글루타민, 0.2 % 아스코르비 산.
      2. 4 vacum 아래 솔루션 저장소를 필터 ° C와 필요한 경우에는 -20 ° C에서 나누어지는하고 저장합니다.
    4. 최종 RPMI의 준비 : B27 마중물 매체
      1. 실험 (6 판 잘 잘마다 한 ML, 그리고 T25 플라스크 당 2 ML)에 대한 마중물 매체의 필요한 볼륨을 분배.
      2. 100 NG / ML의 최종 농도를 Activin 추가합니다.
      3. 50 NG / ML의 최종 농도로 재조합 Wnt3a를 추가합니다.
      4. 잘 믹스와 언론은 이제 사용할 준비가되었습니다.
      5. 이 최종 미디어는 매일 신선한까지하여야한다.
    5. 최종 L - 15 성숙 매체의 준비
      1. 필요한 하는걸실험 (6 판 잘 잘마다 4 ML, 그리고 T25 플라스크 당 6 ML)에 L - 15 매체의 볼륨.
      2. 10 NG / ML의 최종 농도 HGF를 추가합니다.
      3. 20 NG / ML의 최종 농도 OSM을 추가합니다.
      4. 잘 믹스와 언론은 이제 사용할 준비가되었습니다.
      5. 이 최종 미디어는 매일 신선한까지하여야한다.
  2. 최종 endoderm에 마중물 hESCs
    1. 문화 hESCs (H1, H9와 RCM - 1)와 bFGF와 보충 마우스 배아 fibroblast MEF - CM과 matrigel 코팅 접시에 전파.
    2. hESCs가 프라이밍 매체와 MEF - CM (RPMI 1640 - B27 100 NG / ML Activin 50 NG / ML로 보충을 대체하여 약 30 %의 confluency 수준 -60 %를 (hESC 라인에 따라 다름)에 도달했을 때 간장 차별을 개시 Wnt3a.
    3. 세포는 3 일 (중간 24 시간마다 변경)을위한 마중물 매체 교양 있고, Activin과 Wnt3a와 최종 마중물 매체는 매일 신선한 구성되어 있습니다.
    4. 일 6.25 문화에 성숙 및 유지 보수 매체 세포 (L - 15) 9 일 (중간 매 48 시간 변경) 10 NG / ML hHGF 20 NG / ML OSM과 보충. hHGF와 OSM과 성숙 및 유지 보수 매체는 매일 신선한 구성되어 있습니다.
    5. 세포가 점차 달린 칼날 / 삼각형 모양에서 다각형 모양 (그림 2A)을 표시하는 특성 간 형태로 형태학의 변화를 나타냅니다.
    6. hepato - 세포 분화에 대한 도식 :

4. hESC 파생된 간장 endoderm의 Characterisation

  1. Immunostaining
    1. PBS 두 번 1 분마다 세척과 hESC 파생된 HLCs 씻으십시오.
    2. (셀, 실온에서 20 분 4퍼센트 PFA로 HLCs을 수정의 4 ° C에서 PBS에 저장하고) 나중에 스테인드 수 있습니다. 세포는 또한 -20 ° C.에 10 분 위해 얼음 추위 메탄올로 해결할 수 있습니다
    3. PBS, 각 씻어 오분로 두 번 세포를 씻으십시오.
    4. 핵 얼룩 (메탄올 고정 사용하는 경우에는이 단계가 필요하지 않습니다)에 대한 100 % 에탄올로 상온에서 2 분 동안 전지를 품어.
    5. PBS, 각 씻어 오분로 두 번 세포를 씻으십시오.
    6. 상온에서 1 시간 동안 PBS / T (0.1 % 십대 초반) / 10 % BSA와 세포를 차단합니다.
    7. ° C 교반과 함께 4 박 차단 버퍼를 제거하고 실온에서 2 시간 동안 PBS / T (0.1 % 십대 초반) / 1% BSA와 부화에 희석 각 주 항체를 추가하거나.
    8. 세포에게 PBS / T (0.1 % 십대 초반) / 상온에서 1 % BSA 5 분마다 씻어 3 번 씻으십시오.
    9. 교반과 함께 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 셀 및 부화 PBS에 희석 적절한 보조 알렉사 형석 항체 (1:400)를 추가합니다. 세포에게 PBS로 3 회 5 분 각 씻어 씻으십시오.
    10. MOWIOL 4-88과 DAPI (1:1000)와 각 우물을 탑재합니다. 모든 공기 방울이 4 제거하고 저장되는 것을 보장하기 위해 부드럽게 coverslip을 눌러 ° C를 어둠에서 커버 슬립으로 잘 커버.
  2. RNA 분리 및 추출
    1. PBS와 대기음으로 hESC 파생된 HLCs 씻으십시오.
    2. TRIZOL 시약 1 ML을 추가하고 5 분 상온에서 부화.
    3. 1.5 ML eppendorf (-80 ° C에 저장 필요한 경우 나중에 사용하기 위해)의 세포 및 장소를 다쳤어요.
    4. eppendorf와 반전으로 섞어 클로로포름 0.5 ML을 추가, 이것이 연기 후드에서 수행되었는지 확인하십시오.
    5. 4 15 분 동안 13,000 RPM의 솔루션을 원심 ° C.
    6. 인터페이스에서 아무런 오염이없는 확인, 깨끗한 eppendorf로 수성 층과 장소를 수집합니다.
    7. 반전로 1 이소프로판올의 ML와 혼합 추가 precipi 10 분 실온에서 떠나테이트 RNA.
    8. 4 10 분 13,000 RPM에서 원심 ° C.
    9. 뜨는을 기음과 RNA 펠렛을 방해하지 않도록하십시오. 70 % 에탄올 0.5 ML로 깨끗이 씻어 5 분 상온에서 둡니다.
    10. 4 5 분 8,000 RPM에서 원심 ° C.
    11. 에탄올을 기음과 50~10분에 대한 상온에서 건조 둡니다.
    12. 일단 모든 에탄올이 증발했다 deionised 물을 30 μl의 펠렛을 resuspend. ° C 나중에 사용하기 위해 -80에서 RNA를 저장합니다.
    13. nanodrop를 사용하여 RNA 농도를 계량.
  3. 역방향 전사 PCR
    1. 이전에 격리 RNA (200 NG), 임의의 hexamers, 세포핵 (10mM) 역방향 transcriptase와 얇은 벽으로 둘러싸인 0.5 ML eppendorf에 해당 버퍼를 사용하여 반응을 설정합니다.
    2. 부정적인 RT, 반대 transcriptase없이 위의 반응을 설정합니다.
    3. 온도 자전거 타는 사람, PCR 기계에 튜브를 놓고, 다음과 같은 P을 설정rogram :
      1. 37 ° C - 5 분​​ (1 사이클)
      2. 42 ° C - 1 시간 (1 사이클)
      3. 95 ° C - 5 분​​ (1 사이클)
    4. 필요한 경우 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 cDNA를 저장합니다.
  4. 차별화 프로토콜을 통해 서로 다른 시간 지점에서 TAQMAN 양적 역방향 transcriptase 효소의 연쇄 반응의 수확은 세포. RNA를 추출 수요에 다음과 같은 primers와 분석 (응용 Biosystems) 프로토콜을 사용하여 역방향 전송 qPCR을 수행 :
    1. 10월 4일 Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. 알부민 Hs00910225_m1
    4. 알파 페토 프로테인 - Hs00173490_m1

RNA 분리 및 추출하십시오 섹션 3.3.2을 참조하십시오

  1. 역방향 전송 및 TAQMAN qPCR
    1. RNA 1 μg을 가지고 Invitrogen의 윗첨자 III 역방향 전송을 사용하여 cDNA로 고쳐 쓰다 역방향키트, 제조 업체의 지침에 따라로.
    2. 응용 Biosystems, 18S ribosomal 제어 primers와 rox와 Invitrogen의 2X 백금 qPCR supermix UDG에서 해당 primers와 물을 적절한 볼륨으로 구성된 25 μl TAQMAN 반응에 사용되는 cDNA 1 μl.
    3. 잘 믹스하거나, 96 또는 384 자 qPCR 판의 두 우물에 각 시료 10 μl를 놓습니다.
    4. 일단 모든 샘플)이로드, 플러스 적절한 제어되며, 번호판을 봉인하고 응용 Biosystems 7900HT TAQMAN 시스템에서 분석합니다.
    5. 결과는 제어 예제를 통해 상대적인 표현으로 표현됩니다.
  1. - hESC 유래 간장 Endoderm의 기능 분석 P450 Assays 시토크롬 http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf을
    1. 부화 하루 17 hESC 37 ° C (N = 3)에서 5 시간 동안 특정 기판과 조직을 파생. 로 조직 문화 미디어를 사용37 부정적인 제어 및 품어 ° C 5시간하십시오.
    2. supernatants를 수집하고 제조 업체의 지침에 따라로 분석을 수행합니다.
    3. 기초 활동의 상대적인 수준을 측정하고 분석 BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101)에 의해 결정된 당 MG 단백질에 정상화.

노트

  1. 모든 볼륨은 6 잘 플레이트 형식을 기반으로합니다. 필요한 플레이트 또는 플라스크에 대해 적절하게 볼륨을 조정합니다.
  2. 모든 프라이밍, 분화 및 성숙 매체는 사용하기 전에 진공에 따라 필터링됩니다.
  3. 프라이밍, 분화 및 성숙 매체는 4 저장된 ° C 이주보다는 더 이상을 위해. 매체가 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 실험 나누어지는 나머지 미디어 및 저장에 필요한 어느 정도 평가합니다.
  4. Matrigel은 제조 업체의 지침에 따라로 구성되어 있습니다, 1 ML의 aliquots는 사용 전까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
  5. Gro한번 만들어 져서 aliquoted wth 요소는 -20 ° C에 저장할 수 있으며 해동시 4에 저장할 수 있습니다 ° 이주보다는 더 이상을위한 C.
  6. 일반적으로 hESC 파생된 HLCs을 특성화하는 데 사용되는 차 항체 (1:250, 시그마 - 올드 리치, 세인트 루이스, MO) 알부민이다.

5. 대표 결과 :

hESCs의 Characterisation 전에 간장 차별화로 유지

연구에 사용된 H9 hESCs의 줄기 세포 상태를 특성화하기 위해 우리는 매개 변수의 번호를 공부했습니다. 세포는 hESC의 형태, 정의 식민지 (그림 1A)에서 성장 작고, 단단히 포장 세포를 전시하고 pluripotent 줄기 세포 유전자 마커, 10 - 4분의 3 및 Nanog를 (그림 1B) 표시됩니다. 우리는 H7의 hESC 라인 긍정적인 제어에 비해이 유전자의 표현에 큰 차이를 찾지 못했습니다. 또한 hESCs 인구의 90.1 %는 줄기 세포 마커 SSEA - 4 (그림 1C)에 대한 긍정적인했습니다.

그간장 endoderm에 SC 차별

인간 배아 줄기 세포가 효율적으로 체외에서 간장 endoderm (헤이 외 2008)로 구분하실 수 있습니다. 분화의 일 9시, 세포는 수확되었으며 HLCs에 hESC의 분화가 평가되었다. 이전에 보고된으로 hESCs는 깊은 형태학의 변경 일련의 전시하고, 9 일, 다각형 모양 (그림 2A)를 개발 초기 hepatocyte 형태를 전시. 또한, 9 일 시간 코스 이상의 월 4분의 3의 downregulation은 (그림 2B) 관찰되었다. 대조적으로, 간 성적 AFP와 알부민은 하루 7 일부터 상향 조절 (그림 2C)했다.

간장 Endoderm의 체외의 성숙에

간장 endoderm는 설립 절차 (헤이 외 2008)를 사용하여 체외에서 성숙되었다. 분화 문화의 최종 일에 인간의 간 마커 알부민, AFP 및 E - cadherin에 대한 immunostained되었습니다. 우리를 사용하여 HLCs의 항복 절차는 일반적으로 90 % (; Hanoun 외 2010; 페인 외 2,011 헤이 외 2008)입니다. HLCs은 알부민, 알파 페토 프로테인과 - E - Cadherin (그림 3)에 대한 긍정적인 얼룩.

그림 1
그림 1. 이 연구에서 사용되는 hESCs의 Characterisation. (A) hESC의 형태의 위상 콘트라스트 현미경 이미지 관계자는 4X와 10X 배율의 문화 관찰했다. 이미지는 (B) 교양 hESCs가 Octamer (월 4분의 3) 긍정적이고 Nanog 긍정하는 니콘 TE3000 / U 거꾸로 현미경을 사용하여 점령했다. H7 hESCs는 pluripotency 유전자 표현 레벨 컨트롤로 사용되었습니다. 상대 표현은 내생 유전자 제어에 비해 유도의 주름을 말합니다, β - 2 - microglobulin. (C) FACS의 플롯 무대 특정 배아 항원 SSEA 사를 포함하여 hESC 표면 마커 표현 수준을 보여줍니다.

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그림 2. 문화의 관찰 분화의 일 9시 hESC - 파생 간장 endoderm의 형태의 (A) 위상 콘트라스트 현미경 대표 이미지, X4와 X10 확대. 유전자 표현의 변화 (B) 특성화. 진보 undifferentiated 세포 유전자 발현의 downregulation (월 4분의 3) 및 hepatocyte 유전자 발현의 (C) Upregulation을 (알부민과 α - 페토 프로테인) 보여주는, 양적 중합 효소의 연쇄 반응에 의해 RNA가 추출되었으며 cDNA 분석했다. 상대 표현은 내생 유전자 제어, 차별화의 일 0 β - 2 - microglobulin과 비교 유도의 주름을 말합니다. P <0.05이 표시된입니다 *와 P <0.001이 일 0 hESCs에 비해 학생들이 T - 테스트로 측정 ***를 표시된 것입니다. 오차 막대 1 표준 편차를 나타냅니다.

그림 3
그림 3. 채널hESC - 파생 간장 endoderm의 aracterisation
hepatocyte 마커, 알부민, AFP 및 hESC에서 E - Cadherin (H9) 파생 간장 endoderm의 표현을 보여주는 Immunocytochemistry. 부정적인 컨트롤은 해당 면역 글로불린 G (IgG)와 이미지가 표시됩니다 대표들과 수행했다.

그림 4
그림 4. hESC (H9) 파생 HLCs는 신진 대사 활동을 나타냅니다. HLCs로 차별 일 17 H9에서 CYP3A의 신진 대사 활동 (n은 = 6) 전시.

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Discussion

우리는 인간의 HLCs의 확장 수준을 생성하는 간단한 균일한 및 체외에서 높은 재현성 모델을 개발했습니다. 우리의 모델은 외부 협력 연구소들에 의해 검증되었습니다. 우리는 일상적으로 발달 마커와 간 특정 기능 assays (대부분의 상업 사용할 수있는)의 집 도구 상자에서 우리를 사용하여 줄기 세포 파생 HLCs을 특징. 우리 과정에서 중요한 단계는 다음과 같습니다 pluripotency 줄기 세포의 유지 보수, 최종 endoderm에 줄기 세포 분화를 직접하는 기능, 간장 endoderm의 균질 문화의 사양과 능력은 체외에서 광범위한 기능을 전시 성숙 간장 endoderm를 파생합니다.

HLC 기술을 파생 줄기 세포의 대규모 배포하는 한 제한은 문화의 성숙 간장 endoderm (matrigel에 ~ 4 일)의 단기 차별화된 기능을하고 있습니다. 이러한 이유로 우리는 폴리머를 가려 냈습니다바이오 활성화 및 새로운 세포 지원을위한 라이브러리입니다. 이것은 적어도 15 일 동안 간장 기능을 유지 소설 지원 확인하게되었다. 이 기술에 대한 미래의 방향은 처음 약물 발견 과정에서 산업 응용 (헤이 외 2011)입니다. 중순 장기 이익이 기술은 간 질환 환자를 연결하거나 치료를 위해 humanised 엑스트라 물질 간 지원 기기있을 가능성이 형식입니다. 이 기술의 장기 이득은 간 질환을위한 세포 기반 이식 치료에서 그러나 현재 데이터는 그것이 병원 (페인 외 2011)에 안전하게 사용할 수 있습니다 전에이 전략은 상당한 노력을 필요로 보여줍 수 있습니다.

결론적으로, 체외 기술에 우리의 의미는 적용 생물학 높은 성실 인간 HLCs의 균질하고 무한한 문화를 생성하는 능력입니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

박사 헤이가 RCUK 원정대에 의해 지원되었다, 박사 서쪽은 외과 부에 의해 지원되었다, 박사 Medine는 BHF 코어 기금에서 부여에 의해 지원되었다 씨, Baltasar Lucendo - Villarin은 MRC 박사 Studenship에 의해 지원되었다. 박사 만주국은 중국 정부의 장학금으로 지원했다.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

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References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
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  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
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