İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makale, insan embriyonik kök hücre popülasyonlarının insan hepatik endoderm üretimi üzerinde durulacaktır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. J. Vis. Exp. (56), e2969, doi:10.3791/2969 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Modelleme insan ilaç zehirlenmesi ilerlemelere rağmen, birçok bileşikleri klinik çalışmalar sırasında beklenmeyen yan etkiler nedeniyle başarısız olur. Klinik çalışmaların maliyeti büyük, bu nedenle daha fazla öngörü toksikoloji ekranlarında geliştirilen ve ilaç geliştirme (Greenhough ve ark 2010) başlarında konuşlanmış olması çok önemlidir. İnsan hepatositler ilaç toksisitesinin değerlendirilmesi için altın standart model temsil eder, ancak değişken fonksiyon gösteren sınırlı bir kaynaktır. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiştir hücre hatları ve hayvansal doku modelleri kullanımı rutin bolluğu nedeniyle istihdam edilmektedir. Iki kaynaktan bilgilendirici olsa da, yetersiz fonksiyonu, türün değişkenliği ve / veya kültür istikrarsızlık (Dalgetty ve ark 2009) sınırlıdır. Pluripotent kök hücreler (PSC'leri) hücreleri gibi insan hepatosit cazip bir alternatif kaynak (HLCs) (Medine ve ark 2010). PSC'ler yetişkin bulunan tüm somatik hücre türleri için kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler ve böylece temsilfarklılaşmış hücrelerin bir potansiyel olarak bitmez tükenmez bir kaynak. Biz otomasyon ve verim fonksiyonel insan HLCs (Fletcher ve ark 2008; Hannoun ve ark 2010; Payne ve ark 2011 ve Hay ve ark 2011 Hay ve ark 2008) için uygun, yüksek verimli, basit bir prosedür geliştirdik. Biz teknoloji, hastalık modelleme, ekstra bedensel cihazlar inşaat ve muhtemelen hücre nakli tedaviler ilaç keşfi için HLCs ölçeklenebilir üretimine yol olacağına inanıyorum.

Protocol

1. Başlangıç ​​tüm kimyasal stoklarının hazırlanması ve kültür plasticware kaplama

Tüm adımlar, aseptik koşullarda, doku kültürü kaputu yapılmalıdır.

  1. Insan temel Fibroblast Büyüme Faktörü (hbFGF) hazırlanması
    1. 0.22 mikron filtre ile PBS ve filtre% 10 BSA çözüm hazırlayın.
    2. % 10 BSA çözüm% 0,2 BSA solüsyon hazırlanır.
    3. 10 ml% 0,2 BSA solution/100 mikrogram hbFGF ekleyin.
    4. Pre-ıslak 0.22 mikron filtre ile 5 ml% 10 BSA çözüm filtreleyerek filtre. 10 ml BSA yıkama atın.
    5. Önceden yıkanmış bir filtre üzerinden hbFGF Filtresi.
    6. -20 ° C'de steril eppendorfs ve mağaza kısım hbFGF
  2. İnsan aktivin A Tipi Hisse Senedi Çözüm hazırlanması
    1. 1 ml% 0,2 BSA bir şırınga ve ön ıslak filtre içine ekleyin.
    2. 100 mcg / mL bir stok konsantrasyonu% 0,2 BSA A aktivin sulandırınız.
    3. Aktivitelerine Filtren çözümü ve steril eppendorfs bir kısım, -20 ° C'de saklayın
  3. Fare Wnt3a Stok Çözüm hazırlanması
    1. Wnt3a 2 mg flakon bir stok konsantrasyonu 10 mcg / mL PBS 200 ul ekleyin.
    2. -20 ° C'de steril eppendorfs ve mağaza kısım
  4. İnsan HGF Stok Çözeltisi (1000X) hazırlanması
    1. Bir stok konsantrasyonu 10 mcg / mL PBS içinde HGF sulandırınız.
    2. Filtre steril eppendorfs HGF çözüm ve kısım, -20 ° C'de saklayın
  5. Onkostatin M Stok Çözeltisi (1000X) hazırlanması
    1. Bir stok konsantrasyonu 20 mg / ml PBS içinde OSM sulandırınız.
    2. Filtre steril eppendorfs OSM çözüm ve kısım, -20 ° C'de saklayın
  6. Matrigel kültür Kaplama plasticware
    1. 4 gecede Matrigel 10 ml stok şişe çözülme ° C buz ve daha sonra KO-DMEM 10 ml ekleyin. Soğutulmuş pipetler ve mağaza 1 ile iyice karıştırın-20 ° C'de ml alikot
    2. 4 Matrigel ° C en az 2 saat veya bir jel oluşumunu önlemek için bir gecede bir kısım çözülme.
    3. Matrigel soğuk KO-DMEM 5 ml ekleyin, bir pipet ile iyice karıştırın.
    4. 15 ml kadar soğuk KO-DMEM ve bir pipet kullanarak karışımı olun.
    5. (Tablo: (i)) kaplanmış olması plaka veya cam şişe matrigel ekle
Tabak / Flask Cilt / Kuyu veya Flask
12 plaka De ortalama 0.5 mL
6-plaka Her 1 mL
25cm 2 şişesi Şişesi ortalama 2 mL

(Tablo 1). HESC kültür kaplama tipik plasticware için matrigel Önerilen hacimleri.

    1. Kaplanmış plaka veya cam şişe, 4 gece boyunca inkübe ° C veya odaKullanmadan önce 1 saat boyunca ısıya.
    2. Matrigel ile kaplı plakalar veya şişeler, 1 hafta kadar 4 ° C'de saklanabilir. Onlar açıkça kaplı olan tarih ile etiketlenmiş olmalıdır. Bir hafta içinde kullanılan herhangi bir tabak veya cam şişeler atın.
      1. Kullanmadan önce kaplı kültürü kapsayıcı bir doku kültürü kaputu içinde oda sıcaklığına kadar gelmek için izin verir.
      2. Hemen önce matrigel aspire kullanmak ve hücre süspansiyonu iyi ya da balon eklemek.

2. Rutin bakım hESC kültür ve karakterizasyonu

  1. HESC hatları, Resüsitasyon
    1. Sıvı azot depolama hESC çıkarın ve hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosunda çözünme.
    2. Hücre süspansiyonu sıcak ortamda birkaç ml içeren steril bir tüp dikkatli bir şekilde aktarın.
    3. Pelet santrifüj yoluyla hücreler @ 5min için düşük devirli (1000 RPM).
    4. Süpernatant ve çok nazik edinmek ve kapalı aspiresıcak ES orta ve MEF besleyici tabaka levha içine hücreleri pend.
    5. Günlük, taze ES orta ve subconfluence hücreleri üzerine tekrar çember yükleme hücreleri, hücreler Pasajlanması gerektirir.
  2. Rutin hESC bakım
    ES hücreleri matrigel ile kaplı plakalar veya şişeler içinde yetiştirilir. Hücreleri günlük olarak incelenmiş ve beslenmesi gerekiyor:
    1. Kirlenme, hücre morfolojisi ve izdiham mikroskop altında inceleyin.
    2. Aspire geçirdi orta.
    3. Uygun bir ses, taze Fare Embriyonik Fibroblast-conditioned Orta (MEF-CM) + insan bFGF (son konsantrasyonu 4 ng / ml) ya da diğer serum serbest medya 6 ekleyin.
  3. Kollajenaz ile Pasajlanması hücreleri
    hESC hatları (H1, H9 ve RCM-1), 1:3 bölünmüş oranı Pasajlanması aşağıdaki her 5-7 gün izdiham ulaşacak. Stroma varlığı Erken geçiş hESC daha yavaş büyüyecek ve matrigel zaman önemli bir faktör haline gelebilir. İnsan EKH 14 daha uzun süre bırakılmamalıdırmatriks bozulması nedeniyle aynı matrigel ve hücrelerin akışkan eğer bu durumda geçit, 1:1 veya 1:2 bölünmüş oranı hücreleri için gerekli olabilir.

    Enzim Kuluçka
    1. Tüm adımlar, aseptik koşullarda, doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
    2. 1.6 bölümüne uygun olarak hazırlanan yeni bir matrigel kaplı bir tabak veya şişesi var olduğundan emin olun.
    3. Hücreler için istenen split oranı karar verin. Bir dizi faktör, split oranı karar katılan:
      1. Yüksek düzeyde düşük sayıda kolonilerin stroma: küçük bir iyi boyutuna geri geçişli olabilir veya bazı stroma kurtulmak ve böylece hESC büyümeyi teşvik koloni stroma oranı artacak 01:01 geçişli olabilir.
      2. Yeterince büyük hESC koloniler varsa kolonilerin sayısı bağlı olarak büyük kolonileri ile stroma Yüksek düzeyde, 1:1 veya 1:2 geçişli olabilir.
      3. Tipik küçük bir str ile büyüyen hESComa veya herhangi bir stroma ve / veya bazı farklılaşma 1:2 veya 3 geçişli olabilir.
      4. Iyi ya da balon medya aspire.
      5. 2 mL PBS (MgCl 2, CaCl 2) ile bir kez yıkayın.
      6. Kollajenaz uygun bir hacmi (KO-DMEM 200 U / ml seyreltilmiş) ekleyin ve 37 inkübe ° C 2-5 dk. 2 dakikadan itibaren mikroskop altında (1 dakika aralıklarla) düzenli olarak inceleyin. Noktada farklılaşmış hücrelerin kaldırmaya başlar ve koloniler hücrelerin geçişli hazır kenarında kaldırmaya başlar.
    HESC Kazıma ve havuzu
      1. Kollajenaz aspire.
      2. 2 mL PBS (MgCl 2, CaCl 2) ile bir kez yıkayın.
      3. Split oranı bağlı olarak ve fiziksel olarak iyi ya da balonun yüzeyi hücreleri kaldırmak bir hücre kazıyıcı kullanarak MEF-CM uygun bir hacim, daha sonra gen çiğnemektly 2-3 kez 10 ml pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme. HESC hücre kümeleri tutulur ve tek hücre içine kırık değil önemlidir.
    HESC Replating
      1. Yeni matrigel kaplamalı matara veya kuyu üzerine çıkan hücre süspansiyonu Replate.
      2. MEF-CM hacmi için 4 ml 6 plaka iyi olun.
      3. Koloniler, hücre replating ve farklılaşmayı etkileyen levha / şişesi doku kültürü merkezinde çökmemesi için hücrelerin inkübatör ajitasyon verirken doku kültürü konteyner gibi hatta koloniler olası bir dağıtım sağlamak için.
  4. Flow sitometri hESC popülasyonlarının Rutin karakterizasyonu
    1. hESC nüfus Eki 3 / 4, Tra 1-60 ve SSEA-4 gibi kök hücre belirteçleri için ayda bir defa akım sitometri yöntemiyle incelenir.
    2. hESCtek hücre süspansiyonları tripsin / EDTA (Invitrogen) ile 5 dakikalık bir tedavi aşağıdaki gibi popülasyonlar kendi substrat kaldırılır.
    3. 1x10 6 hücre / mL PBS% 0.1 BSA ve% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş tek hücre tekrar
    4. Hücre hazırlama, 4 ° C'de 40 dakika için uygun antikorlar ile inkübe edin.
    5. Hücreler, PBS bağlanmamış antikor kaldırmak ve son hacim 100 mcL tekrar süspansiyon ve flow sitometri ile analiz için% 0.1 BSA ve% 0,1 sodyum azid ile desteklenmiş ile iki kez yıkayın.
    6. Veri 30.000-40.000 "canlı" etkinlikleri için 488 nm lazer ile donatılmış bir FACS Caliber sitometresinin kullanarak her bir numune için alınan ve CellQuest yazılımı (Becton Dickinson, San Jose, CA) kullanılarak analiz edilmektedir. Boyanmamış hücrelerin kontrol grubu olarak dahil edilir. Forward scatter ve yan dağılım parametreleri elektronik bir canlı geçidini kullanarak analiz enkaz ile birlikte ölü ve apoptotik hücre dışı bırakıldı.

3. DiferansiyehESC karaciğer endoderm, ation

  1. Medya, hepatik endoderm için hESC farklılaşma için hazırlanması. Tüm medya hazırlık aseptik koşullarda, bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
    1. RPMI Hazırlanması: B27 emişli orta endoderm farklılaşma
      1. RPMI-B27, orta karışımı RPMI 1640 (500 ml) ve B27 (50x, 10 ml) için
      2. Bileşenleri çalkalanarak karıştırılır.
      3. Tüm bileşenleri, 4 vakum, mağaza altında filtre ünitesi ve filtre ° C ekle
    2. Hepatosit farklılaşma SR-DMSO ortamın hazırlanması
      1. SR-DMSO orta, 80% KO-DMEM, 20% KO-SR,% 0.5 'lik L-glutamin,% 1 non-esansiyel amino asitler, 0.1mm β-mercaptoethanol ve% 1 DMSO karıştırın.
      2. Filtre vakum altında çözüm, mağaza, 4 ° C ve -20 ° C'de kısım gerekirse ve saklarız.
      3. 4 mL başına iyi bir 6-plaka ve T25 şişesi başına 6 mL kullanın.
    3. Hepa L15 olgunlaşması için ortamın hazırlanmasıtocyte olgunlaşma
      1. L-15, orta karışımı 500 ml Leibovitz L-15 orta, triptoz fosfat suyu (son konsantrasyonu% 8.3), ısı inaktive fetal sığır serumu (son konsantrasyonu% 8.3), 10 mcM hidrokortizon 21-hemisuccinate 1 mcM İnsülin (sığır pankreas ),% 1 L-Glutamine,% 0.2 'askorbik asit.
      2. Filtre vakum altında çözüm, mağaza, 4 ° C ve -20 ° C'de kısım gerekirse ve saklarız.
    4. Son RPMI Hazırlanması: B27 emişli orta
      1. Için gerekli priming orta hacmi deneyi (6 plaka başına 1 ml ve T25 şişesi başına 2 ml) koyun.
      2. 100 ng / mL son konsantrasyon için bir aktivin ekleyin.
      3. 50 ng / mL son konsantrasyon rekombinant Wnt3a ekleyin.
      4. İyice karıştırın ve medya artık kullanıma hazır.
      5. Bu son medya her gün taze yapılmalıdır.
    5. Son L-15 olgunlaşma orta hazırlanması
      1. Gerekli Uygulamadeneyi (6 plaka başına 4 ml ve T25 şişesi başına 6 ml) L-15 orta hacim.
      2. 10 ng / ml final konsantrasyonda HGF ekleyin.
      3. 20 ng / mL son konsantrasyon için OSM ekleyin.
      4. İyice karıştırın ve medya artık kullanıma hazır.
      5. Bu son medya her gün taze yapılmalıdır.
  2. Astar hESC kesin endoderm
    1. Kültür hESC (H1, H9 ve RCM-1) ve bFGF ile desteklenmiş fare embriyonik fibroblast MEF-CM matrigel kaplı plakalar üzerinde yaymak.
    2. HESC emişli orta MEF-CM (RPMI 1640-B27 100 ng / ml aktivin A ve 50 ng / ml ile desteklenmiş yerine confluency seviyesini yaklaşık% 30 -60 (% hESC hattına bağlı) ulaştığınızda hepatik farklılaşma başlatın. Wnt3a.
    3. Hücreleri 3 gün (her 24 saatte bir değişen orta) emişli orta kültür ve aktivin A ve Wnt3a ile son priming ortamı her gün taze yapılır.
    4. 8 gün kültürü olgunlaşma ve bakım ortamında hücreleri (L-15) 9 gün (her 48 saatte bir değişen bir orta) için 10 ng / mL hHGF ve 20 ng / ml OSM ile desteklenebilir. Her gün taze hHGF ve OSM ile Olgunlaşma ve bakım ortamında yapılır.
    5. Hücrelerinin yavaş yavaş bir dikenli / üçgen şekli poligonal bir görünüm (Şekil 2A) gösteren karakteristik bir karaciğer morfoloji morfolojik değişiklikler gösterirler.
    6. Hepato-hücre farklılaşması için şematik:

4. HESC elde edilen karaciğer endoderm Karakterizasyonu

  1. Immün
    1. PBS iki kez, 1 dakika Her yıkamadan hESC elde edilen HLCs yıkayın.
    2. (Hücre, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 PFA Fix HLCss PBS içinde 4 ° C'de saklanan ve daha sonraki bir tarihte vitray) olabilir. Hücreler, -20 ° C'de 10 dakika boyunca buz gibi metanol ile tespit edilebilir
    3. Hücreler iki kez PBS, her yıkama 5 dakika yıkayınız.
    4. 2 dakika boyunca hücreler nükleer boyanma (metanol fiksasyonu kullanılır ise, bu adım gerekli değildir) için% 100 etanol ile oda sıcaklığında inkübe edin.
    5. Hücreler iki kez PBS, her yıkama 5 dakika yıkayınız.
    6. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle PBS / T (% 0.1 arasında) /% 10 BSA hücreleri engelleyin.
    7. Engelleme tampon gecede 4 ° C ajitasyon çıkartın ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS / T (% 0.1 arasında) /% 1 BSA ve inkübe seyreltilmiş ilgili primer antikor eklemek veya.
    8. Hücreler 3 kez PBS / T (% 0.1 arasında) / oda sıcaklığında% 1 BSA, 5 dakika, her yıkama ile yıkayın.
    9. PBS içinde seyreltilmesi ajitasyon ile karanlıkta 1 saat oda sıcaklığında inkübe hücreleri ve uygun ikincil Alexa Fluor antikor (1:400). Hücreler PBS ile 3 kez, 5 dakika, her yıkama yıkayın.
    10. MOWIOL 4-88 ve DAPI (1:1000) ile her yanı Dağı. Tüm hava kabarcıkları 4 kaldırılır ve mağaza sağlamak için hafifçe basılarak lamel ° C karanlık, iyi bir kapak kayma ile kaplayın.
  2. RNA izolasyonu ve çıkarma
    1. PBS ve aspirat ile hESC elde HLCs yıkayın.
    2. TRIZOL reaktif 1 ml ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. 1.5 ml Eppendorf (-80 ° C daha sonra gerektiğinde kullanmak için mağaza) hücreler ve yer Pençe.
    4. Kloroform 0.5 ml Eppendorf ve alt üst edilerek karıştırın ekleyin; bu davlumbaz yapılır emin olun.
    5. 15 dakika boyunca 13.000 RPM çözüm Santrifüj 4 ° C
    6. Arayüz hiçbir kirlenme olduğundan emin olun, temiz bir Eppendorf içine sulu tabaka ve yerde toplayın.
    7. 1 izopropanol mL ve karıştırın evirerek precipi 10 dakika oda sıcaklığında bırakınTate RNA.
    8. 10 dakika boyunca 13.000 RPM Santrifüj 4 ° C
    9. Süpernatantı aspire ve RNA pelet rahatsız değil emin olun. 0.5 ml% 70 etanol ile yıkayın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın.
    10. 5 dakika boyunca 8.000 RPM Santrifüj 4 ° C
    11. Etanol aspire edin ve 5-10 dakika oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    12. Bir kez tüm etanol buharlaştı, deiyonize su 30 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin. RNA -80 ° C daha sonra kullanmak üzere saklayın.
    13. Nanodrop kullanarak RNA konsantrasyonu niceliğini.
  3. Ters Transkripsiyon PCR
    1. Daha önce izole RNA (200 ng), rastgele hekzamer, nükleotidler (10mm) ters transkriptaz ve ince duvarlı 0.5 ml Eppendorf ilgili tampon kullanarak bir tepki ayarlayın.
    2. Bir negatif RT, yukarıdaki reaksiyon ters transkriptaz olmadan ayarlayın.
    3. Tüpleri bir termo cycler, PCR makinesi içine yerleştirin ve aşağıdaki p kurmakPROGRAM:
      1. 37 ° C - 5 dakika (1 döngü)
      2. 42 ° C - 1 saat (1 döngü)
      3. 95 ° C - 5 dakika (1 döngü)
    4. Gerekirse daha sonra kullanmak için cDNA -20 ° C'de saklayın.
  4. TaqMan kantitatif revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu Hasat hücrelerin farklılaşması protokol boyunca farklı zaman noktalarında. RNA Özü ve talep üzerine aşağıdaki primerler ve Analiz (Uygulamalı Biyosistem) protokolü kullanılarak ters transkripsiyon qPCR yürütmek:
    1. Oct 4 Hs03005111_g1
    2. Nanog Hs02387400_g1
    3. Albumin Hs00910225_m1
    4. Alpha-fetoprotein Hs00173490_m1

RNA izolasyonu ve çıkarma lütfen için bölüm 3.3.2 'ye bakın .

  1. Ters transkripsiyon ve TaqMan qPCR
    1. RNA 1 mg alın ve Invitrogen Üstsimge III ters transkripsiyon kullanılarak cDNA yazıya terskiti, üreticinin talimatlarına göre.
    2. Uygulamalı Biyosistem, 18S ribozomal kontrol astar ve rox Invitrogen 2x platin qPCR Supermix UDG uygun astar ve uygun bir su hacmi oluşan 25 ul TaqMan reaksiyonu kullanılan cDNA 1 ul.
    3. İyice karıştırın ve her bir örnek 10 ul ya 96 ya da 384 kuyu qPCR plaka iki kuyu içine yerleştirin.
    4. Bir kez tüm örnekler) yüklü, artı uygun kontrollerin, plaka, mühür ve Uygulamalı Biyosistem 7900HT TaqMan makinede analiz.
    5. Sonuçlar kontrol örneği üzerinden nispi ifade olarak ifade edilir.
  1. - HESC Türetilmiş Karaciğer Endoderm Fonksiyonel Analiz P450 Tahliller Sitokrom http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
    1. Inkübe gün 17 hESC 37 ° C (n = 3) 5 saat özel substrat HE türetilmiştir. Gibi doku kültürü ortamları kullanın.37 negatif kontrol ve inkübe ° C'de 5 saat.
    2. Süpernatantlar toplayın ve tahlil üreticinin talimatlarına göre yürütmek.
    3. Göreli bazal aktivite düzeylerini ölçmek ve BCA Testi (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101) tarafından belirlenen başına mg protein normalleştirmek.

Notlar

  1. Tüm miktarlar 6 plaka formatına dayanır. Gerekli plaka veya cam şişe, buna göre miktarlar ayarlayın.
  2. Tüm emişli, farklılaşma ve olgunlaşma orta kullanmadan önce vakum altında filtre edilir.
  3. Astar, farklılaşma ve olgunlaşma ortamında saklanan 4 ° C, 2 haftadan daha uzun için. Orta deney ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de kısım kalan medya ve mağaza için gerekli ne kadar değerlendirin.
  4. Matrigel üreticinin talimatlarına uygun olarak yapılır; 1 ml alikotları kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  5. Grobir kez yapılan ve aliquoted wth faktörler, -20 ° C'de saklanabilir ve çözülmüş zaman 4 saklanabilir ° C, 2 haftadan daha uzun süre.
  6. Primer antikor genellikle hESC elde edilen HLCs karakterize etmek için kullanılır (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) albümindir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

HESC, Karakterizasyonu önce hepatik farklılaşma korudu

Çalışmada kullanılan H9 hESC kök hücre durumunu karakterize etmek için bir dizi parametre okudu. Hücreleri hESC morfolojisi, tanımlanan koloniler (Şekil 1A) büyüyen küçük, sıkışık hücrelerde sergilenen ve pluripotent kök hücre gen göstergeleri, Eki-3 / 4 ve Nanog (Şekil 1B). Biz bu genlerin ifadesi H7 hESC hattı pozitif kontrol ile karşılaştırıldığında önemli farklılıklar bulamadı. Ayrıca, hESC nüfusun% 90.1 'kök hücre belirteci SSEA-4 (Şekil 1C) için pozitif oldu.

oSC karaciğer endoderm farklılaşma

İnsan embriyonik kök hücreleri, in vitro hepatik endoderm (Hay ve ark 2008) etkin bir şekilde ayırt edilebilir. Gün 9 farklılaşma, hücre hasat ve HLCs için hESC farklılaşma değerlendirildi. Daha önce bildirdiği gibi, bir dizi derin morfolojik değişiklikler hESC sergiledi ve 9 gün, poligonal bir görünüm (Şekil 2A) gelişmekte olan erken hepatosit morfolojisi sergiledi. Ayrıca, Ekim-3 / 4, 9 günlük süre boyunca baskılanması (Şekil 2B) gözlenmiştir. Buna karşın, karaciğer transkript AFP ve albümin gün 7 itibaren up-regüle (Şekil 2C).

Karaciğer Endoderm in vitro maturasyon

Karaciğer endoderm kurulan yordam (Hay ve ark 2008) kullanılarak in vitro olgunlaştı. Farklılaşma kültürlerin son gününde insan karaciğer belirteçleri albümin, AFP ve E-cadherin immunohistokimyasal. Bizim kullanarak verimi HLCs işlem tipik olarak% 90 (Hanun ve ark 2010; Payne ve ark 2011 Hay ve ark 2008). HLCs Albumin, Alpha-fetoprotein ve E-Cadherin (Şekil 3) için pozitif boyandı.

Şekil 1
Şekil 1. Bu çalışmada kullanılan hESC karakterizasyonu. (A) faz kontrast mikroskobu görüntüleri temsilcisi hESC morfolojisi 4x ve 10x büyütme kültür gözlemledi. (B) kültür hESC Oktamer (Eki-3 / 4), pozitif ve Nanog olumlu bir Nikon TE3000 / U inverted mikroskop kullanarak görüntüleri ele geçirildi . H7 hESC pluripotency gen ekspresyon düzeyleri için bir kontrol olarak kullanmak. Bağıl ifade endojen gen kontrolü ile karşılaştırıldığında indüksiyon kıvrımları ifade eder, β-2-mikroglobulin (C) FACS araziler aşamada özgün embriyonik antijenleri SSEA 4 hESC yüzey işaretleyici ifade düzeyleri de dahil olmak üzere, göstermektedir.

69/2969fig2.jpg "/>
Şekil 2. Kültür gözlenen farklılaşma 9 gün hESC kaynaklı karaciğer endoderm morfolojisi (A) Faz kontrast mikroskobu temsili görüntü, x4 ve x10 büyütme (B) gen ekspresyonu değişiklikleri Karakterizasyonu. Ilerici farklılaşmamış hücre gen ekspresyon baskılanması (Eki-3 / 4) ve (C) hepatosit gen ekspresyonu ekspresyonunun (albumin ve α-fetoprotein) gösteren, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile RNA ekstrakte edildi ve cDNA analiz edildi. Bağıl ifade endojen gen kontrolü, β-2-mikroglobulin farklılaşma 0 gün ile karşılaştırıldığında indüksiyon kat ifade eder. P <0.05 gösterilir ve p <0.001 gün 0 hESC ile karşılaştırıldığında öğrencilerin t-testi ile ölçülen *** başlar. Hata çubukları, 1 standart sapma temsil eder.

Şekil 3
Şekil 3. ChhESC kaynaklı karaciğer endoderm, aracterisation
Hepatosit belirteçleri, albümin, AFP ve hESC E-Cadherin (H9) türetilen karaciğer endoderm İmmünositokimya gösteren ifade. Negatif kontroller ilgili immünoglobulin G (IgG) ve görüntülerin gösterildiği temsilciler ile yapıldı.

Şekil 4
Şekil 4 hESC (H9) elde edilen HLCs metabolik aktivite sergilerler. At HLCs için farklılaşmış Gün 17, H9 CYP3A metabolik aktivitesi (n = 6) sergiledi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz insan HLCs ölçeklenebilir seviyelerini oluşturmak için basit, homojen ve in vitro yüksek oranda tekrarlanabilir bir model geliştirdik . Bizim modelimiz bir dizi dış işbirliği laboratuarları tarafından onaylanmıştır. Biz rutin olarak gelişim belirteçler ve karaciğer özel fonksiyonel testlerinin (çoğu ticari olarak mevcuttur) ev araç kutusu kullanılarak kök hücre elde edilen HLCs karakterize eder. Sürecinde önemli aşamaları şunlardır: bakım pluripotency kök hücre, kök hücre farklılaşması kesin endoderm yönlendirme yeteneği; karaciğer endoderm homojen kültürlerin özellikleri ve yeteneği in vitro geniş fonksiyonu sergileyerek olgun karaciğer endoderm türetmek için.

HLC teknolojisi elde edilen kök hücre geniş ölçekli dağıtım için bir sınırlama kültür olgun karaciğer endoderm (~ 4 gün matrigel üzerinde) kısa vadede farklılaştırılmış fonksiyonu olmuştur. Bu nedenle biz bir polimer gösterildibio-aktif ve yeni hücresel destekler için kütüphane. Bu en az 15 gün karaciğer fonksiyon sağlayan bir roman destek tanımlanmasına yol açmıştır. Bu teknoloji için geleceğe yönelik ilk ilaç keşfi sürecinin endüstriyel uygulama (Hay ve ark 2011). Orta vadeli kazançlar, bu teknolojinin, karaciğer hastalığı olan hastalarda köprü veya tedavi etmek için insanlara ekstra bedensel karaciğer destek cihazı olma olasılığı oluşturur. Bu teknoloji, uzun vadeli kazançlar, ancak karaciğer hastalığı için hücre nakli tedavi kliniği (Payne ve ark 2011) güvenli bir şekilde kullanılmadan önce geçerli veri, bu stratejinin önemli bir çaba gerektirdiğini gösteriyor olabilir.

Sonuç olarak, in vitro teknolojisi önemini uygulamalı biyoloji yüksek sadakat insan HLCs homojen ve sınırsız kültürlerini oluşturmak için yeteneğidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Dr Hay RCUK Bursu tarafından desteklenen Dr West Cerrahi Anabilim Dalı tarafından desteklenen, Dr Medine BHF Core Fonundan hibe tarafından desteklenen, Sayın Baltasar Lucendo-Villarin bir MAM Doktora Studenship tarafından desteklenmiştir. Dr Zhou, Çin Hükümeti bursu ile desteklenmiştir.

Materials

Matrigel coating plates and flasks

  1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
  2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
  4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

  1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

  1. Confluent well or flask of hESCs.
  2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
  3. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
  6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

  1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  8. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
  9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
  10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
  12. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
  16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
  17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
  18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
  19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

  1. Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
  2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
  3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
  4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
  6. Ethanol
  7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
  8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
  9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.
Primary antibodies
Antigen* Type Supplier Dilution
ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500
E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100
α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500
SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100
IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

  1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
  2. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
  3. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
  4. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
  2. Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
  3. Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
  4. Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
  5. Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
  6. Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
  7. Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
  8. Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
  9. Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics