Применение постоянных средней мозговой артерии Лигирование в мышь

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Средней мозговой артерии (СМА) лигирование является методика исследования координационного ишемии мозга на животных моделях. В этом методе, средней мозговой артерии, предоставляемые трепанации черепа и лигируют путем прижигания. Этот метод дает очень воспроизводимые инфаркта объемов и увеличение послеоперационной выживаемости по сравнению с другими методами.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colak, G., Filiano, A. J., Johnson, G. V. The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse. J. Vis. Exp. (53), e3039, doi:10.3791/3039 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Фокусное ишемии головного мозга является одним из наиболее распространенных типа инсульта у пациентов. Из-за клиническое значение имело длительных усилий по разработке подходящих животных моделей для изучения событий, которые разворачиваются в течение ишемического инсульта. Эти методы включают в себя временной или постоянной, фокусное или глобальной ишемии моделей с использованием различных моделей на животных, наиболее распространенными из которых являются грызуны.

Постоянные перевязки MCA метод, который также упоминается в качестве pMCAo в литературе широко используется в качестве координационного модели ишемии у грызунов 1-6. Этот метод был впервые описан для крыс Тамура и соавт. в 1981 г. 7. В этом протоколе трепанации черепа был использован для доступа MCA и проксимальных регионов окклюзии путем электрокоагуляции. Инфаркты включают главным образом коры, а иногда и полосатой регионам в зависимости от расположения окклюзии. Эта техника в настоящее время хорошо известны и используются во многих лабораториях 8-13. Раннее использование этой техники привело к определению и описанию "инфаркт основные» и «полутени» 14-16, и она часто используется для оценки потенциальных нейропротекторное соединений 10, 12, 13, 17. Хотя первоначальные исследования проводились на крысах, постоянные перевязки MCA успешно применяется у мышей с небольшими изменениями 18-20.

Эта модель дает воспроизводимые инфарктов и повышение после выживаемости. Около 80% ишемических инсультов у людей происходят в области MCA 21 и таким образом, это является очень актуальной моделью развития инсульта исследований. В настоящее время наблюдается нехватка эффективных методов лечения доступны для пациентов, перенесших инсульт, и, следовательно, есть потребность в хороших моделей для тестирования потенциальных фармакологических препаратов и оценить физиологическое результатов. Этот метод может также использоваться для изучения внутриклеточных механизмов реагирования гипоксии в естественных условиях.

Здесь мы представляем хирургии MCA лигирования в C57/BL6 мыши. Мы описываем предоперационной подготовки, MCA перевязки хирургии и 2,3,5 Triphenyltetrazolium хлорида (ТТК) окрашивания для количественного определения инфаркта томов.

Protocol

Этот протокол был одобрен Университета Рочестера комитета посвящено этическим использование животных в исследованиях (UCAR). Асептический методы должны соблюдаться во время протокола. Использование стерильных перчаток и маски не требуется.

Все оборудование, материалы, химикаты, и инструменты, которые используются во время протокола описаны в таблице 1.

1. Предоперационная подготовка

  1. Inject мышам подкожно бупренорфин (0.05mg/kg) 2 ч до операции, сразу после операции, а затем каждые 3-5 ч в течение первых 24 часов послеоперационного периода.
  2. Стерилизовать всех хирургических инструментов, марля губки, и аппликаторы хлопка наконечник в автоклаве. Держите хирургические инструменты в 70% этанола во время операции и сухой воздух на стерильную марлю непосредственно перед использованием. Спрей рабочей зоны с 70% этанола.
  3. Обезболить мышь с 3% isofluorane-20% газовой смеси кислорода с помощью испарителя анестетиков. Отрегулируйте количество кислорода с расходомером. Проверьте уровень анестезии на ноги или хвост щипать (они должны быть все равно). Поддерживать уровень анестезии 2% (об. / об) isofluorane.
  4. Применять искусственные слезы на глазах мыши и соблюдать осторожность, чтобы не повредить глаза во время хирургической операции. Наведите на правом боку в боковом положении.
  5. Бритье области с левой стороны между левым глазом и основанием левого уха использования животного клиперов. Чистят области, чередуя решение бетадин и 70% этанола с помощью ватного наконечник аппликаторы и слегка втирают области. При необходимости повторите.
  6. Наведите на грелку подключен к ректальный зонд для поддержания температуры тела при температуре 37 ° C. Вставьте ректальный зонд с помощью минерального масла.
  7. Поместите мышь на правый бок под микроскопом и безопасный с лентой. Вырезать окна марлей губки и охватывают хирургической области.

2. Хирургические процедуры и MCA Лигирование

  1. Сделайте вертикальный разрез между левым глазом и основанием левого уха с помощью тонкой прямые ножницы. Используйте изогнутые hemostats держать хирургические области открыты.
  2. Сделать горизонтальный разрез на височной мышцы с помощью ножниц весной и слегка отдельных височной мышцы с черепом на медленно тянуть пинцетом.
  3. Сделайте небольшой subtemporal краниотомии на пересечении скуловой дуги и чешуйчатой ​​костей с помощью иглы 18G, удерживая челюсть с изогнутым пинцетом.
  4. Expose MCA, удаляя мелкие кусочки черепа с костями rongeurs. Скуловой дуги и орбитальных содержимого не должна быть повреждена во время этого процесса. Если чрезмерного высыхания тканей происходит во время этого процесса, применять стерильную PBS с аппликаторами хлопка наконечником.
  5. Лигировать дистальной части MCA с помощью небольшого cauterizer судна.
  6. Место височной мышцы в исходное положение и закройте разреза с хирургическим 5-0 швами из нейлона.
  7. Прекратите анестезии и удалить ректального датчика. Inject мышь с 2-й дозы бупренорфина (0.05mg/kg) подкожно. Вернуться мыши клетке, которая хранилась при температуре 37 ° С при нагреве панели.
  8. Внимательно следить за мышь в течение следующих 24 ч в течение какого-либо дискомфорта (снижение аппетита / потребления воды, выгибание спины, увеличение дыхания, Пило-возведена волос). Inject мышь с бупренорфин подкожно каждые 3-5 ч после операции до 24 часов. Обеспечить мыши с восстановлением геля в этот период.

3. TTC Окрашивание и определение ударного объема

  1. Двадцать четыре часа после операции глубоко анестезию мыши, transcardially заливать мышь с 4% TTC (м / о) в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 15 мин, а затем с 4% параформальдегида решение в течение 10 мин с помощью мини перистальтического насоса на средней скорости потока. Удалить мозга и поместить его в 4% параформальдегида решение в одночасье.
  2. Позиция мозг в секционирования блока. Нарежьте мозга в 1 мм толщиной ломтиками с помощью лезвия.
  3. Место ломтиками рядом с миллиметровой линейкой масштаба. Фотография ломтики с помощью цифровой камеры, подключенной к рассекает микроскопом.
  4. Вычислить площадь инсульта путем вычитания без инфаркта области ипсилатерального сайт с общей площадью контралатеральной сайте, используя изображения J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Расчет ударного объема, складывая инсульта области ломтиками 22.

4. Направления в использовании программное обеспечение изображение J

  1. Откройте файл изображения должны быть проанализированы в изображение программного обеспечения J, нажав на файл меню.
  2. Нажмите на вкладку "прямой линии" в программе. Нарисуйте прямую линию между двумя полями на линейке. Нажмите на "анализ" и выберите "набор масштаба». Установить известное расстояние, как 1, единица длины, как мм.
  3. Нажмите на вкладку "от руки круг». Нарисуйте круг очертить контралатерального полушария. Нажмите на "анализ" и выберите "мера". Расчет появится всплывающее окно показывает площадь круга нарисован.
  4. Нарисуйте еще один круг вокруг ипсилатерального полушария исключением инсульта (белые) области. Измерьте площадь, как указано в пункте 4.3. Новое значение будет добавлено в расчет окна. Разница между первым и вторым значениями представляет область инфаркта который указан как в приведенной ниже формуле.
  5. Рассчитать инсульта области, в каждый кусочек, повторяя шаги 4.2-4.4. Возьмите суммирования инсульта площадь рассчитывается в каждом срезе (ΣA п). Это представляет ударный объем зная то, что толщина каждого среза 1 мм.
    ΣA п х 1 мм (толщина каждого среза) = Ударный объем

5. Представитель Результаты:

Инфаркты получить постоянное перевязки MCA в мышь в основном коры. Тем не менее, можно получить подкорковых поражений, если MCA лигируют проксимальнее lenticulostriate отрасли. Ударный объем после перевязки MCA может варьироваться от 10 мм до 35 мм ³ ³ 19, 23. Ударный объем рассчитывается с TTC окрашивания в Moyanova и соавт. 19 составляет от 10 мм до 22 мм ³ ³ в то время как ударный объем определяется по МРТ в Filiano и др. 23 составляет от 20 мм до 35 мм ³ ³. Возможной причиной этих различий может быть, точное расположение труб и различных методов, используемых для измерения объемов инсульта.

На рисунке 1, мозгом TTC витражи 24 часов после перевязки постоянного MCA в дикого типа C57/BL6 мышь показано на рисунке. Инсульт сайт имеет белый внешний вид (рис. 1а, б). Рисунок 1А и В иллюстрируют инфаркта сайт под разными углами. На рисунке 2 показан 1 мм толщиной ломтиками TTC окрашенных инсульт мозга спереди назад (рис. 2A-G). Инфаркт объеме рассчитывалась 24 ч после операции. Объем инфаркта составляет ~ 23 мм ³.

Рисунок 1
Рисунок 1. Представление инсульта сайта. AB, TTC окрашенных целом изображения головного мозга, через 24 ч после перевязки MCA. Белая область представляет инфаркта.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результаты. (> G), TTC окрашенных мозга 1мм разделов, через 24 ч после MCAL. Фрагменты выравниваются от передних к задним. Белая область представляет инфаркта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Постоянные перевязки MCA метод дает очень воспроизводимые инфаркта объемов и увеличение послеоперационной выживаемости по сравнению с другими методами. Легкости и малой длительности (~ 30 мин) Процедура сделать его еще более практичным. Метод широко используется в обеих мышей и крыс.

Эта техника требует хирургического вмешательства под стереомикроскопа. Таким образом, опыт работы под микроскопом и совершенствование успешной трепанации черепа имеет важное значение. Лучше всего провести последовательный инфарктов в лаборатории до эксперименты проводятся. Для достижения воспроизводимости результатов важно лигировать MCA в то же точное место каждый раз. MCA должны быть перевязаны проксимальнее lenticulostriate отрасли, если подкорковые инфаркты желательны. Артерии полностью лигируют и окклюзии является постоянным. Поэтому эта модель не позволяет реперфузия с помощью MCA. Хотя это и не включены в эту демонстрацию, это лучше, если зонд допплер используется для измерения кровотока в пораженной области для проверки полной перевязки артерии.

Оператор должен быть очень осторожным, чтобы не повредить или проколоть MCA разоблачая и коагулирующих артерии. Краниотомия должны быть выполнены с большим аккуратность, не допуская повреждения скуловой кости. Потому что хирургическое области находится очень близко к инфаркта области, любое повреждение поверхности коры следует избегать во время трепанации черепа или прижигания. ФСТ 18015-00 блок cateurizer или cateurizer биполярного может быть использован вместо ФСТ 18000-00, используемых в этой демонстрации. ФСТ 18015-00 позволяет пользователю регулировать температуру cauterizer наконечник слабом огне, которые могли бы предотвратить любые повреждения корковой ткани. ФСТ 18015-00 также позволяет избежать колебаний температуры видел в батарейках инструментов прижигания. Во время прижигания, пользователь должен быть очень осторожны, чтобы сохранить cauterizer из потока кислорода и может на мгновение закрыть O 2 / isofluorane, чтобы избежать опасности возгорания. Это не повлияет на состояние наркоза мыши. Чтобы предотвратить эту опасность, мы используем вентиляционные трубы продлен до хирургической области, которая увеличивает циркуляцию воздуха в достаточной степени, а также обеспечивает вывод любой избыток O 2 / isofluorane в воздухе.

Постоянные перевязки MCA модель чрезвычайно полезна при изучении ишемического инсульта. Он может быть использован для тестирования или нейропротекторные исследования молекулярных механизмов ишемии в естественных условиях на модели трансгенных мышей. Очевидное преимущество использования данного подхода в естественных условиях является то, что это позволяет изучение ишемического инсульта на неповрежденных нейронных сетей и поведенческая реакция постинсультных, в дополнение к neuroinflammatory процессов, которые присутствуют после ишемического повреждения. Таким образом, эта модель в ход естественных условиях дает критическую дополнительный подход к на месте модели, которые используются для имитации ишемии в клеточной культуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Хирургическая техника, изначально приобретенные в лаборатории д-р Уильям Д. Хилл в Медицинском колледже штата Джорджия. Авторы также хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида А. Ремпе и Ланда Prifti для использования вскрытия камеры. Это исследование было поддержано NS041744 NIH, NS051279, F31 NS064700 и AHA 30815697D.

References

  1. Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats. Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).
  2. Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat. Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).
  3. Jin, K. Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats. Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).
  4. McCaig, D. Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia. Brain Res. 1034, 51-61 (2005).
  5. Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Stroke. 26, 878-884 (1995).
  6. Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion. Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).
  7. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  8. Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
  9. Carswell, H. V. Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Hypertension. 33, 681-685 (1999).
  10. Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity. Stroke. 32, 993-999 (2001).
  11. Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).
  12. Iaci, J. F. Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke. Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).
  13. Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium. Neuroscience Research. (2011).
  14. Heiss, W. D. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
  15. Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).
  16. Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).
  17. Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion. Stroke. 21, 1727-1733 (1990).
  18. Arlicot, N. Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).
  19. Moyanova, S. G. Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage. J Cereb Blood Flow Metab. (2010).
  20. Ortolano, F. Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain. Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).
  21. O'Neill, M. J., A, C. J. Rodent models of focal cerebral ischemia. Current Protocols in Neuroscience. 9.6.1-9.6.32 (2000).
  22. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  23. Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke. Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics