Die Anwendung des dauerhaften mittleren Hirnarterie Ligation in der Maus

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Summary

A. cerebri media (MCA) Ligation ist eine Technik, fokaler zerebraler Ischämie im Tiermodell zu studieren. Bei dieser Methode ist die mittlere Hirnarterie durch Kraniotomie freigelegt und ligiert durch Kauterisation. Diese Methode liefert gut reproduzierbare Infarktvolumen und erhöhte postoperative Überlebensrate im Vergleich zu anderen Methoden zur Verfügung.

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Colak, G., Filiano, A. J., Johnson, G. V. The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse. J. Vis. Exp. (53), e3039, doi:10.3791/3039 (2011).

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Abstract

Fokaler zerebraler Ischämie ist eine der häufigsten Form des Schlaganfalls bei Patienten gesehen. Durch die klinische Bedeutung hat es eine längere Anstrengung, um geeignete Tiermodelle zu entwickeln, um die Ereignisse, die während der ischämischen Insult entfalten Studie. Diese Techniken umfassen vorübergehend oder bleibend, fokale oder globale Ischämie Modelle mit vielen verschiedenen Tiermodellen, die häufigsten sind Nagetiere.

Die permanente MCA Ligationsmethode die auch als pMCAo ist in der Literatur wird weitgehend als fokale Ischämie-Modell in Nagetieren 1-6 verwendeten. Diese Methode wurde ursprünglich für die Ratten durch Tamura et al. im Jahr 1981 sieben. In diesem Protokoll eine Kraniotomie wurde verwendet, um Zugriff auf die MCA und der proximalen Regionen durch Elektrokoagulation waren verschlossen. Die Infarkte betreffen meist kortikale und manchmal striatalen Regionen, je nach Lage der Okklusion. Diese Technik ist inzwischen gut etabliert und wird in vielen Labors 8-13. Der frühe Einsatz dieser Technik führte zur Definition und Beschreibung von "Infarktkern" und "Penumbra" 14-16, und es wird oft benutzt, um potenzielle neuroprotektive Verbindungen 10, 12, 13, 17 zu bewerten. Obwohl die anfänglichen Studien an Ratten durchgeführt wurden, hat permanent MCA Ligation erfolgreich an Mäusen mit leichten Modifikationen 18-20 verwendet.

Dieses Modell liefert reproduzierbare Infarkte und eine erhöhte post-Überlebensraten. Etwa 80% der ischämischen Schlaganfälle bei Menschen in der MCA Bereich 21 passieren und somit ist dies ein sehr wichtiges Modell für Schlaganfall-Studien. Derzeit gibt es einen Mangel an wirksamen Therapien zur Verfügung Schlaganfall-Patienten, und somit gibt es einen Bedarf für gute Modelle, um potenzielle pharmakologische Verbindungen testen und zu evaluieren physiologische Ergebnisse. Diese Methode kann auch für die intrazelluläre Hypoxie Reaktionsmechanismen in vivo verwendet werden.

Hier präsentieren wir die MCA Ligation Operation in einem C57/BL6 Maus. Wir beschreiben die präoperative Vorbereitung, MCA Ligation Chirurgie und 2,3,5 Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung für die Quantifizierung der Infarktgröße Bände.

Protocol

Dieses Protokoll wurde von der University of Rochester Ausschuss sich mit der ethischen Verwendung von Tieren in der Forschung (UCAR) zugelassen. Aseptische Techniken sollten in das Protokoll befolgt werden. Die Verwendung von sterilen Handschuhen und einer Maske erforderlich ist.

Alle Geräte, Materialien, Chemikalien und Werkzeuge, die während des Protokolls verwendet werden, sind in Tabelle 1 beschrieben.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Inject Mäusen subkutan mit Buprenorphin (0.05mg/kg) 2 h vor der Operation, unmittelbar nach der Operation und dann alle 3-5 h während der ersten 24 h postoperativen Phase.
  2. Sterilisieren aller chirurgischen Instrumente, Gaze Schwämme und Wattestäbchen Applikatoren von Autoklaven. Halten Sie chirurgische Instrumente in 70% igem Ethanol während der Operation und an der Luft trocknen auf steriler Gaze rechts vor dem Gebrauch. Sprühen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
  3. Anesthetize der Maus mit 3% Isofluoran-20% Sauerstoff-Gasgemisch durch ein Betäubungsmittel Verdampfer. Passen Sie die Sauerstoffmenge mit dem Durchflussmesser. Testen Sie das Niveau der Anästhesie durch Zehe oder Schwanz kneifen (sie sollten nicht mehr reagiert). Halten Sie das Niveau der Anästhesie mit 2% (v / v) Isofluoran.
  4. Bewerben künstliche Tränen, um die Maus in die Augen und seien Sie vorsichtig, um eine Beschädigung des Auges während der Operation. Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite in eine seitliche Position.
  5. Shave Bereich auf der linken Seite zwischen dem linken Auge und die Basis des linken Ohres mit dem Tierschermaschinen. Reinigen Sie die Fläche durch den Wechsel zwischen einem betadine-Lösung und 70% Ethanol mit Wattestäbchen Applikatoren und leichtes Reiben der Gegend. Bei Bedarf wiederholen.
  6. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen an eine rektale Sonde auf Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten Legen Sie die rektale Sonde mit Mineralöl.
  7. Bewegen Sie die Maus auf der rechten Seite unter dem Mikroskop und sicher mit Klebeband. Schneiden Sie ein Fenster in einem Gaze-Schwamm und Abdeckung OP-Bereich.

2. Chirurgische Verfahren und MCA Ligation

  1. Machen Sie einen vertikalen Einschnitt zwischen dem linken Auge und die Basis des linken Ohres mit feinen geraden Schere. Verwenden Sie gebogenen Hämostatika zu halten OP-Bereich zu öffnen.
  2. Machen Sie ein horizontaler Schnitt auf der Schläfenmuskels mit Feder Schere und etwas trennen Schläfenmuskels aus dem Schädel durch langsames Ziehen mit der Pinzette.
  3. Machen Sie eine kleine subtemporal Kraniotomie an der Kreuzung der Jochbogen und Squamosum durch Verwendung einer 18G Nadel, während der Kieferknochen mit einer gebogenen Pinzette.
  4. Expose der MCA durch das Entfernen der kleine Schädel mit Knochen Rongeure. Der Jochbogen und Orbital Inhalte sollten dabei nicht beschädigt werden. Wenn übermäßige Trocknung des Gewebes auftritt, während dieses Prozesses, steriler PBS mit Wattestäbchen Applikatoren.
  5. Ligieren des distalen Teil der MCA mit einem kleinen Schiff cauterizer.
  6. Legen Sie die Schläfenmuskels wieder in seine ursprüngliche Position und schließen Sie die Inzisionsstelle mit chirurgischen 5-0 Nylonnaht.
  7. Unterbrechen Sie Anästhesie und entfernen Sie die rektale Sonde. Spritzen Sie die Maus mit einer 2. Dosis von Buprenorphin (0.05mg/kg) subkutan. Bringen Sie die Maus, um den Käfig, der auf 37 ° C wurde mit einer Heizplatte.
  8. Genau beobachten, mit der Maus für die nächsten 24 h für alle Beschwerden (Appetitlosigkeit / Wasserverbrauch, gekrümmte Haltung, beschleunigte Atmung, Pilo-errichtet Haare). Spritzen Sie die Maus mit Buprenorphin subkutan alle 3-5 h nach der Operation bis zu 24 Stunden. Geben Sie die Maus mit Recovery-Gel in diesem Zeitraum.

3. TTC-Färbung und Bestimmung der Stroke Volume

  1. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation tief betäuben die Maus, transkardial perfuse der Maus mit 4% TTC (w / v) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 15 min und dann mit einer 4% Paraformaldehyd-Lösung für 10 min mit einem Mini-Schlauchpumpe bei mittlerer Strömungsgeschwindigkeit. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in die 4% Paraformaldehyd-Lösung über Nacht.
  2. Position des Gehirns in die Schnitte zu blockieren. Scheiben des Gehirns in 1mm dicke Scheiben schneiden mit Rasierklingen.
  3. Legen Sie die Scheiben neben einer Millimeter-Skala Lineal. Fotografieren Sie die Scheiben mit einer Digitalkamera mit dem Binokular.
  4. Berechnen Sie den Hubbereich durch Subtraktion der nicht-Infarktareal der ipsilateralen Seite von der Gesamtfläche der kontralateralen Seite mit Image J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Berechnen Sie das Hubvolumen durch Stapeln der Hubbereich der Scheiben 22.

4. Anfahrt zu nutzen Image J Software

  1. Öffnen Sie die Bilddatei in Image J Software, indem Sie auf das Menü Datei analysiert werden.
  2. Klicken Sie auf den "geraden Linie" Tab im Programm. Zeichnen einer geraden Linie zwischen den beiden Rändern auf dem Lineal. Klicken Sie auf "Analyse"-Menü und wählen Sie 'set scale'. Set dem bekannten Abstand als 1, Einheit der Länge als mm.
  3. Klicken Sie auf "Freihand Kreis-Register. Zeichne einen Kreis um die kontralateralen Hemisphäre zu skizzieren. Klicken Sie auf "Analyse"-Menü und wählen Sie "Maßnahme". Die Berechnung Fenster öffnet sich, welche die Fläche des Kreises gezogen.
  4. Draw noch ein Kreis um den ipsilateralen Hemisphäre ohne Hub (weiss) Bereich. Man misst die Fläche, wie in Schritt 4.3 angegeben. Der neue Wert wird auf die Berechnung Fenster hinzugefügt werden. Der Unterschied zwischen der 1. und 2. Werte stellt den Bereich des Infarktes, die als A in der folgenden Formel angegeben ist.
  5. Berechnen Sie den Hubbereich in jeder Scheibe durch Wiederholen der Schritte 4,2-4,4. Nehmen Summation der Hubbereich in jede Scheibe (ΣA n) berechnet. Dies entspricht Hubvolumen Kenntnis der Tatsache, dass die Dicke jeder Scheibe 1mm ist.
    ΣA n x 1mm (Dicke jeder Scheibe) = Hubvolumen

5. Repräsentative Ergebnisse:

Die Infarkte durch permanente MCA Ligation in der Maus gewonnen werden meist kortikalen. Allerdings ist es möglich, subkortikale Läsionen zu erhalten, wenn der MCA ist ligiert proximal des lentikulostriatalen Branche. Das Hubvolumen nach MCA Ligation könnte von 10mm bis 35mm ³ ³ 19, 23 variieren. Das Hubvolumen mit TTC-Färbung in Moyanova et al. 19 sind zwischen 10mm bis 22mm ³ ³, während die Hubvolumen von MRT-Bildern in Filiano et al 23 sind zwischen 20 mm ³ bis 35mm ³ bestimmt. Ein möglicher Grund für diese Unterschiede vielleicht die genaue Lage der Ligation und die verschiedenen Methoden verwendet, um die Hubvolumen zu messen.

In Abbildung 1 ist ein TTC gefärbt Gehirn 24 Stunden nach dauerhaften MCA Ligation in einem Wildtyp-C57/BL6 Maus gezeigt. Der Hub Site ist weiß in Erscheinung (Abb. 1A, B). Abbildung 1A und B zeigen die Infarkt Ort aus verschiedenen Blickwinkeln. Abbildung 2 zeigt 1mm dicke Scheiben des TTC gefärbt Schlaganfall Gehirn von vorne nach hinten (Abb. 2A-G). Infarktvolumen berechnet wurde 24 h nach der Operation. Das Volumen des Infarkts ist ~ 23mm ³.

Abbildung 1
Abbildung 1. Vertretung von Schlaganfallpatienten vor Ort. AB, gebeizt TTC ganze Gehirn Bilder, 24 h nach der MCA-Ligation. Weiß-Bereich stellt die Infarkt.

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse. (A> G), TTC gefärbt 1mm Hirnschnitten, 24 h nach MCAL. Scheiben sind von vorne nach hinten ausgerichtet. Weiß-Bereich stellt die Infarkt.

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Discussion

Die permanente MCA Ligationsmethode gibt gut reproduzierbare Infarktvolumen und erhöhte postoperative Überlebensrate im Vergleich zu anderen Methoden zur Verfügung. Die Leichtigkeit und der kurzen Dauer (~ 30 min) des Verfahrens machen es noch praktischer. Die Methode ist weit verbreitet in Mäusen und Ratten verwendet.

Diese Technik erfordert einen invasiven Chirurgie unter einem Stereomikroskop. Deshalb ist Erfahrung im Betrieb unter einem Mikroskop und Perfektionierung einer erfolgreichen Kraniotomie erforderlich. Am besten ist es konsequent Infarkten im Labor zu etablieren, bevor Experimente durchgeführt werden. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die MCA gleichzeitig genaue Lage ligieren jeder Zeit. Die MCA sollten ligiert proximal Niederlassungen lentikulostriatalen wenn subkortikalen Infarkten erwünscht sind. Die Arterie ist vollständig unterbunden und der Okklusion ist dauerhaft. Daher ist diese Modell nicht möglich Reperfusion über den MCA. Obwohl nicht in diese Demonstration enthalten, ist es am besten, wenn ein Doppler-Sonde zur Messung des Blutflusses in den betroffenen Bereich eine vollständige Unterbindung der Arterie zu überprüfen verwendet wird.

Der Betreiber sollte sehr vorsichtig sein, nicht zu beschädigen oder Punktion MCA während Belichten und Koagulation der Arterie. Kraniotomie sollte mit umfangreichen Pflege durchgeführt werden, um Schäden an der Jochbein zu verhindern. Da die OP-Bereich ist sehr nah an dem Infarkt Bereich sollten Schäden an der kortikalen Oberfläche während Kraniotomie oder Kauterisation vermieden werden. FST 18015-00 cateurizer Einheit oder einer bipolaren cateurizer kann anstelle des FST 18000-00 in diese Demonstration verwendet werden. FST 18015-00 ermöglicht dem Benutzer, die Temperatur des cauterizer Spitze zu schwacher Hitze, die Schäden an der kortikalen Gewebes verhindern könnten anzupassen. FST 18015-00 vermeidet auch die Temperaturschwankungen im Batteriebetrieb Verätzungen Werkzeuge zu sehen. Während Verätzungen, sollte der Nutzer sehr vorsichtig sein, um die cauterizer zu halten, die Sauerstoffzufuhr und kann vorübergehend herunterfahren O 2 / Isofluoran um das Risiko von Entzündung vermieden wird. Dies hat keinen Einfluss auf die Narkose Zustand der Maus. Um diesem Risiko vorzubeugen, verwenden wir ein Lüftungsrohr erweitert, um die OP-Bereich, die die Luftzirkulation erhöht ausreichend, sowie saugt überschüssige O 2 / Isofluoran in der Luft.

Die permanente MCA Ligation Modell ist äußerst nützlich bei der Untersuchung einen ischämischen Schlaganfall. Es kann benutzt werden, um neuroprotektive Untersuchung oder Studie molekularen Mechanismen der Ischämie in vivo an transgenen Mausmodellen werden. Der offensichtliche Vorteil für die Verwendung dieser in vivo-Ansatz ist, dass diese für das Studium der ischämischen Insult auf intakten neuronalen Netzen und die Verhaltensreaktion post-Beleidigung, zusätzlich zu den neuroinflammatorischen Prozesse, die vorhanden sind nach einem ischämischen Schäden ermöglicht. Daher ist diese in vivo Schlaganfall-Modell bietet eine kritische komplementären Ansatz zur in situ-Modellen, die zur Ischämie in der Zellkultur zu imitieren sind.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die chirurgische Technik wurde ursprünglich im Labor von Dr. William D. Hill am Medical College of Georgia erworben. Die Autoren möchten auch Dr. David A. Rempe und Landa Prifti für die Nutzung der Dissektion Kamera danken. Diese Arbeit wurde vom NIH NS041744, NS051279, F31 NS064700 und AHA 30815697D unterstützt.

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