Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

Biology
 

Summary

In questo video ci mostrano la preparazione della E18 neuroni corticali di ratto.

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Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).

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Abstract

In questo video, dimostriamo la preparazione della E18 neuroni corticali di ratto. E18 neuroni corticali di ratto sono ottenuti da E18 corteccia fetale di ratto precedentemente sezionati e preparati. La corteccia è E18, dopo la dissezione, immediatamente dissociato in singoli neuroni. E 'possibile memorizzare E18 corteccia in un tampone contenente Hibernate E B27 a 4 ° C per un massimo di una settimana prima della dissociazione viene eseguita. Tuttavia, ci sarà un calo di vitalità cellulare. Tipicamente si ottiene la nostra E18 Cortex fresca. E 'trasportato al laboratorio a freddo di calcio privo di ghiaccio tampone dissezione di magnesio libero (CMFM). All'arrivo, tripsina viene aggiunto alla corteccia a una concentrazione finale di 0,125%. La corteccia viene quindi incubato a 37 ° C per 8 minuti. DMEM contenente 10% FBS viene aggiunto alla corteccia per arrestare la reazione. La corteccia viene poi centrifugato a 2500 rpm per 2 minuti. Il surnatante viene rimosso e 2 ml di Neural media basale (NBM) contenente 2% B27 (vol / vol) e lo 0,25% si aggiunge Glutamax (vol / vol) verso la corteccia che viene poi nuovamente sospeso pipettando su e giù. Successivamente, la corteccia è triturato con pipette di vetro precedentemente lucidate a fuoco, ciascuno con una successiva apertura più piccola. Dopo la triturazione, la corteccia è ancora una volta centrifugato a 2500 rpm per 2 minuti. Il surnatante viene quindi rimosso e il pellet di corteccia risospese con 2 ml di NBM contenenti B27 e Glutamax. La sospensione cellulare viene fatto passare attraverso un colino 40 um cellule nylon. Avanti le cellule sono contati. I neuroni sono ora pronti per il caricamento nel dispositivo neurone microfluidica.

Protocol

Preparazione E18 neuroni corticali di ratto fetale per compartimentazione

Prima di partire, è importante per scaldare tutti i supporti necessari e reagenti a 37 ° C.

E 'anche importante per sterilizzare tutto ciò che viene utilizzato per la preparazione delle cellule (ad esempio, le lampadine gomma, portaprovette, bottiglie media, ecc), e ciò che è posto nel cofano, con l'annientamento verso il basso con il 70% di etanolo.

  1. Mettere due pezzi di corteccia di ratto E18 fetale (un cervello, precedentemente sezionato) in una provetta da 15 ml contenente 1 ml ghiacciata calcio-magnesio libero senza buffer di dissezione.
  2. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla corteccia dissezione nel buffer, portando il volume finale a 2 ml e la concentrazione di tripsina finale a 0,125%.
  3. Posizionare il tubo di 15 ml in un bagno d'acqua a 37 ° C per 8 minuti.
  4. Durante questo periodo, il fuoco lucidare 3 pipette Pasteur di vetro, formando aperture sempre più piccoli, in un armadio di biosicurezza per aiutare a mantenere la sterilità.
  5. Dopo l'incubazione 8 minuti della corteccia, aggiungere 10 ml di DMEM contenente 10% FBS alla corteccia per aiutare a fermare la reazione tripsina.
  6. Centrifugare i 15 tubo ml contenente la corteccia e DMEM/10% FBS a 2500 rpm per 2 minuti.
  7. Nell'armadio biosicurezza, rimuovere il sopranatante della corteccia con una pipetta Pasteur in vetro sottovuoto con aspirazione allegato. Fare attenzione a non disturbare o rimuovere il pellet.
  8. Aggiungere 1 ml di NMB al pellet di corteccia e pipettare delicatamente su e giù. E 'molto importante evitare di creare bolle d'aria, mentre pipeting su e giù, come le bolle d'aria può danneggiare le cellule dall'ossidazione.
  9. Usare il fuoco lucido pipetta Pasteur con la più ampia apertura verso triturare la corteccia ed accompagnato da una lampadina sterile gomma fino alla fine e pipeting su e giù per 5 volte, sempre facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Continuare questo processo con gli altri 2 pipette di vetro, ciascuna con una dimensione di apertura ridotto.
  10. Dopo la triturazione, centrifuga giù le cellule di nuovo a 2500 rpm per 2 minuti.
  11. Dopo la centrifugazione, ancora una volta, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di NBM.
  12. Filtrare la soluzione risospeso cellula attraverso un colino 45 celle um.
  13. Macchia le cellule con Blu tripan, contati, e caricati nel dispositivo. Noi di solito carico 20 ul di cellule per dispositivo.

Nota: la concentrazione finale di cellule è in genere tra 2,5 milioni di cellule / ml e 8 milioni di cellule / ml

Caricamento in corso le cellule

Dopo che le cellule sono state contate, è tempo di caricare le cellule del dispositivo:

  1. Portare i dispositivi precedentemente preparato contenente NBM nel mobile biosicurezza per mantenere la sterilità.
  2. Rimuovere i supporti in eccesso dai pozzi di aspirazione. Tuttavia, fare attenzione a evitare di rimuovere tutti i mezzi di comunicazione - ci deve essere qualche supporto nel canale principale.
  3. Applicare 20 ul di cellule al serbatoio in alto a sinistra del dispositivo (vedi schema se necessario). Il flusso di cellule nel dispositivo e attaccarsi alla superficie trattata PLL.
  4. Dopo il caricamento, posizionare i dispositivi contenenti cellule indietro in un incubatore per 10 minuti per consentire alle cellule di allegare.
  5. Dopo 10 minuti, riempire i serbatoi con i media e dispositivi di luogo indietro nell'incubatrice.

Discussion

Densità delle cellule può essere variata a seconda dell'applicazione. Tuttavia, semina neuroni primari troppo basso di una densità di porta normalmente alla morte cellulare. A seconda della incubatrice e il livello di umidità, i media può avere bisogno di essere cambiato nei dispositivi ogni 2 o 3 giorni. Quando si cambiano i media, è importante dopo aver rimosso il supporto dal serbatoio, per rimuovere mai i media dai canali principali. Inoltre, è buona abitudine mettere mezzi freschi nei pozzetti superiore e consentire ad alcuni mezzi freschi a fluire attraverso il dispositivo e nei principali canali prima di riempire tutti i serbatoi.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NBM medium Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos Animal Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS buffer ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA Reagent Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets Fisher Scientific glass
DMEM medium Invitrogen
FBS Reagent Invitrogen serum, used at 10% in DMEM
centrifuge set at 2500 rpm
Trypan Blue Invitrogen for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um Tool BD Biosciences Falcon cat# 352340 Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).

Comments

6 Comments

  1. This is quite impressive.  How do you avoid the neurons in the small channels sticking to the PDMS and peeling off when you remove the slabs before fixation?  Is there some sort of special treatment for the PDMS or technique used before removal so the axons are not disturbed?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 20, 2008 - 2:05 PM
  2. Hello Allyson first, there are two ways to bond the device to glass, plasma bonding and by non-plasma bonding.  There are two other videos demonstrating this on JOVE that may interest you. If a device is plasma bonded to the glass it cannot be removed.  A non-plasma bonded device can be removed from the glass but if not done carefully axons in the microgrooves will get lifted off.  Some researchers have said that placing the device on ice for 5 minutes after fixing prior to removing the device helps keep the neurons on the glass. Most researchers including our lab just stain the neurons in the device and image them in the device.  For many applications this is sufficient enough.  If you wish to remove the device before staining then non-plasma bonding will have to be done and the device chilled briefly after fixing before removing.  Usually if one is going to remove the device for staining it is best to prepare a few samples in the likely hood that in some cases the neurons will be disturbed upon removing the device.

    Reply
    Posted by: Joseph H.
    June 20, 2008 - 3:07 PM
  3. Just wanted to let everyone know a company has formed to make and sell the neuron device. Please contact xonamicrofluidics@gmail.com for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 4, 2008 - 1:03 PM
  4. Hi, I was wondering- do the channels between the two compartments form a diffusion barrier? I would like to stimulate one of the culture chambers and not the other (using KCl)... Cheers

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 19, 2008 - 5:03 AM
  5. Hello John Brown Sorry for the late response.  Work has been done with gradients in microfluidic devices but the horizonatal channels were much, much wider.  I am not sure if in the Neuron Device a gradient is created.  There might be one on a small channel that would probably be hard to measure.  I would suggest searching PubMed by Dr. Noo Li Jeon.  He has published several papers with devices used to make gradients.  Feel free to contact me at xonamicrofluidics@gmail.com if you have other questions. JŒ

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 12:55 PM
  6. Hello, I want to know the process of dissection of Fetal Rat Cortexone brain.Because I should the experiment,but nobody would teach me.Thank you.

    Reply
    Posted by: Jun L.
    July 6, 2012 - 8:44 AM

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