Optimierte PCR-basierten Nachweis von Mycoplasma

Biology
 

Summary

Die Regeln der Gewalt Mycoplasma PCR Detection Kit nutzt die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die als die Methode der Wahl für höchste Empfindlichkeit in der Detektion von Mycoplasma, Acholeplasma und Ureaplasma Kontamination in Zellkulturen und anderen auf Zellkultur basierenden Biologicals hergestellt wird.

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

Die Wartung der kontaminationsfreie Zelllinien ist wichtig, zellbasierter Forschung. Zu den größten Schadstoff Bedenken sind Mykoplasmen-Kontaminationen. Obwohl Mykoplasmen in der Regel nicht töten kontaminierten Zellen, sie schwer zu erkennen sind und eine Vielzahl von Effekten an kultivierten Zellen, einschließlich verändertem Stoffwechsel führen, verlangsamte Proliferation und chromosomale Aberrationen. In kurzen, Kompromisse Mykoplasmen-Kontaminationen der Wert dieser Zelllinien in genaue Daten für die biowissenschaftliche Forschung.

Die Quellen von Mykoplasmen-Kontaminationen im Labor sind sehr anspruchsvoll vollständig zu kontrollieren. Da bestimmte Mykoplasmenarten auf der menschlichen Haut zu finden sind, können sie durch schlechte aseptischen Bedingungen eingeführt werden. Außerdem können sie aus kontaminierten Ergänzungen wie Rinderfötenserum kommen, und vor allem von anderen kontaminierten Zellkulturen. Sobald Mykoplasmen eine Kultur verschmutzt, kann es schnell auf andere Bereiche des Labors zu verunreinigen. Die strikte Einhaltung guter Laborpraxis wie gute aseptische Technik sind der Schlüssel, und routinemäßige Prüfung auf Mykoplasmen ist sehr für eine erfolgreiche Steuerung von Mykoplasmen-Kontaminationen zu empfehlen.

PCR-basierten Nachweis von Mykoplasmen ist ein sehr beliebte Methode für den Routineeinsatz Zelllinie Wartung. PCR-basierte Nachweisverfahren sind sehr empfindlich und kann schnelle Ergebnisse, die Forscher schnell reagieren zu isolieren und zu beseitigen Verschmutzungen, wenn es im Vergleich zu der Zeit erkannt erforderlich mit mikrobiologischen Techniken ermöglicht. Die Regeln der Gewalt Mycoplasma PCR Detection Kit ist hochempfindlich, mit einer Nachweisgrenze von nur 2 Genome pro ul. Unter Ausnutzung der sehr spezifischen JumpStart Taq DNA Polymerase und einem proprietären Primer-Design, sind Fehlalarme deutlich reduziert. Die komfortable 8-Tube-Format hilft Streifen vorbeschichtet mit dNTPs, und die damit verbundenen Primer erhöhen den Durchsatz auf die Bedürfnisse von Kunden mit größeren Sammlungen von Zelllinien zu erfüllen.

Angesichts der extremen Empfindlichkeit des Kits, muss darauf geachtet werden, um eine versehentliche Kontamination von Proben und Reagenzien zu verhindern. Die Schritt-für-Schritt-Protokoll zeigen wir Highlights der Vorsichtsmaßnahmen und Verfahren für die zuverlässige Mykoplasmenanalyse erforderlich. Wir zeigen auch, und diskutieren Sie typische Ergebnisse und deren Interpretation. Unser Ziel ist es, den Erfolg der Wissenschaftler mit dem LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit zu gewährleisten.

Protocol

1. Mykoplasmenanalyse

  1. Zellkulturüberstände können direkt getestet werden oder die Probe für den Einsatz zu einem späteren Zeitpunkt vorbereitet. Zur Vorbereitung für den späteren Gebrauch Platz 100 pl Überstand in einem sterilen Röhrchen Verstärkung und Inkubieren bei 95 ° C für 5 Minuten. Sobald dies abgeschlossen ist die Probe bei 2-8 ° C können bis zu einer Woche aufbewahrt werden. Kurz vor dem Ausführen des Beispiels kurz zentrifugieren (5 Sekunden) zu Pellets keine Zelltrümmer.
  2. Zur Vorbereitung der Proben für die PCR, bestimmt das Gesamtvolumen der Jumpstart Taq DNA Polymerase / Rehydrationspuffer für die Reaktionen erforderlich. Wir werden Herstellung von 5 insgesamt Reaktionen. Fünf Reaktionen erfordern 2.5μl von Taq und 114.5μl von Rehydrationspuffer. Diese enthält mindestens eine Einheit Taq pro Reaktion und 22.5μl von Rehydrationspuffer pro Probe Reaktions-und Negativ-Kontrolle sowie 24.5μl von Rehydrationspuffer für die positive Kontrolle. 1 Einheit der DNA-Polymerase pro Reaktion sollte auf eine angemessene Lautstärke der Rehydrationspuffer hinzugefügt werden. Dies wird mit der Taq variieren.
  3. Legen Sie das berechnete Volumen der Taq DNA Polymerase in eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen und folgen Sie mit dem berechneten Volumen von Rehydrationspuffer. Die DNA-Polymerase / Rehydrationspuffer sollte vorsichtig durch flicking das Rohr gemischt werden. Diese Mischung sollte nicht verwirbelt werden.
  4. Zur Vorbereitung der negativen Kontrolle und Proben mit dem transparenten Reaktionsgefäße im Kit enthalten. Die Reaktionsrohre in dem Kit enthalten bereits die nuclueotides, Grundierungen und internen Kontroll-DNA. 23 ul der Jumpstart Taq DNA Polymerase / Rehydrationspuffer mischen, wie in den vorherigen Schritten hergestellt wird, sollte in jedem der negativen Kontrolle und Probenröhrchen platziert werden. Add 2 ul DNA freies Wasser auf die Negativ-Kontrolle und mit 2 ul der Probe zu jedem der Probenröhrchen und beschriften. Mischen Sie den Inhalt von flicking die Rohre. Inhalt sollte nicht verwirbelt werden.
  5. Zur Vorbereitung der positiven Kontrolle mit dem rosa Reaktionsgefäße im Kit enthalten. Die Reaktionsrohre in dem Kit enthalten bereits die nuclueotides, Grundierungen und internen Kontroll-DNA. Add 25 ul der Jumpstart Taq DNA Polymerase / Rehydrationspuffer mischen, wie in den vorherigen Schritten erstellt, um die Reaktion zu Rohren und Label. Mischen Sie den Inhalt von flicking die Rohre. Inhalt sollte nicht verwirbelt werden. Inkubieren Sie die Negativ-Kontrolle, positive Kontrolle und Probe-Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  6. Für die PCR stattfinden die Proben müssen in einem Thermocycler platziert werden. Bei der Verwendung von JumpStart Taq eine Aktivierung Schritt ist nicht erforderlich. Setzen Sie die Reaktionsgefäße in den Thermocycler. Die Zyklen sollten wie folgt eingestellt werden: 94 ° C für 30 Sekunden, 55 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 40 Sekunden. Diese Zyklen werden 40 mal ausgeführt werden.
  7. Nach der PCR-Zyklen abgeschlossen haben, sollten die Proben auf 4-8 ° C, indem Sie sie aus dem Thermocycler und sie in Eis gekühlt werden. Wenn die Proben abgekühlt sind sie auf das Agarosegel zur Elektrophorese geladen werden. Lädt Gel-und Farbstoff sind nicht notwendig, da sie bereits in der Reaktionsrohre sind. Direkt Last 8 ul für jede PCR in eine separate Gasse. Stoppen Sie die Elektrophorese nach der Migration von 2,5 bis 3,0 cm.

2. Repräsentative Ergebnisse

Die negative Kontrolle sollte eine Bande bei ca. 481 bp zu zeigen. Dies kann in der negativen Kontrolle Spalte auf der Elektrophorese-Gel, die am Anfang des Videos gezeigt wird gesehen werden. Das Fehlen der negativen Kontrolle Band bei 481 bp ist ein guter Indikator, dass die Aktivität der Polymerase nicht sufficienttaq verwendet wurde, nicht empfindlich genug.

Mycoplasma-positiven Proben zeigen Banden im Bereich von 270 ± 8 bp. Die Band wird schwer sein für hoch kontaminierten Proben und schwach für leicht kontaminierte Proben. Die Schwankungen in der Intensität in der positiven Probe Spalten auf dem Elektrophorese-Gel, die am Anfang des Videos gezeigt wird gesehen werden. Alle Proben enthalten eine interne negative Kontrolle zu zeigen, dass die PCR erfolgte wie erwartet. Es ist normal, das Fehlen des internen Kontrollsystems auf hoch belasteten Proben zu sehen.

Wenn es nicht eine Band in den positiven Bereich oder eine Band in den negativen Bereich auf Ihrer Probe ist dies ein guter Indikator dafür, dass Ihre Proben gehemmt werden. Ist die Probe hemmte die PCR-Inhibitoren können durch eine DNA-Extraktion entfernt werden.

Abbildung 1
. Abbildung 1 Relevante Amplicon Bands: Ergebnisse der Erfassung Mykoplasmen mittels PCR gezeigt werden. Spur 2 ist die Negativ-Kontrolle, die eine Bande bei ca. 481 bp sollte zeigen. Das Fehlen der negativen Kontrolle Band bei 481 bp ist ein guter Indikator, dass die Taq verwendet nicht empfindlich genug. Mycoplasma-positiven Proben Banden im Bereich von 270 zeigen, + 8 bp als in den Spuren 3 dargestellt - 6. Die Band wird hea werdenvy für hoch kontaminierten Proben (Spur 6) und schwach für leicht kontaminierte Proben (Spur 4). Alle Proben enthalten eine interne negative Kontrolle (481 bp) zeigen, dass die PCR erfolgte wie erwartet. Es ist normal, das Fehlen des internen Kontrollsystems auf hoch belasteten Proben zu sehen.

Discussion

Aufgrund der extremen Empfindlichkeit des Kit, wenn sie richtig das Kit sollte Ausbeute präzise Ergebnisse anzeigt, ob Ihre Probe Mykoplasmen-Kontaminationen hat. Das Kit ist für den Einsatz mit JumpStart Taq DNA Polymerase optimiert. Andere taqs kann verwendet werden, wenn die Vorbereitung der Proben werden, aber die internen Kontroll-Band bei 481 bp sollte vorhanden sein, um eine ordnungsgemäße Empfindlichkeit der alternative Taq anzuzeigen. Es ist möglich, dass die positiven Banden unterschiedlicher Dichte je nach dem Grad der Verunreinigung aufweisen können. Es ist möglich, das Fehlen des internen Kontrollsystems Band auf stark belasteten Proben zu beobachten. Mit Vorsicht und richtige Technik bei der Vorbereitung der Proben zur Vermeidung von Kontaminationen sind entscheidend für die richtige. Erkennung bei Verwendung des LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Disclosures

Die Autoren sind Mitarbeiter von Sigma-Aldrich, dass Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Acknowledgements

Gefördert durch Sigma-Aldrich

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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