PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة

Biology
 

Summary

الكشف عن بالمرصاد PCR المفطورة كيت يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، التي أنشئت بوصفها الأسلوب المفضل لأعلى حساسية في الكشف عن التلوث المفطورة ، Acholeplasma والميورة في الثقافات الأخرى وخلية خلية ثقافة تستمد البيولوجية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

صيانة خطوط الخلية خالية من التلوث أمر أساسي لخلية القاعدة البحثية. من بين المخاوف أكبر ملوث وتلوث ميكوبلازما. تباطأ انتشار الأسلحة النووية وعلى الرغم من الانحرافات الكروموسومية ميكوبلازما لا تقتل الخلايا الملوثة عادة ، هم من الصعب كشف ويمكن أن تسبب مجموعة متنوعة من الآثار على الخلايا المستزرعة ، بما في ذلك عملية الأيض تتغير. باختصار ، وتلوث ميكوبلازما التنازلات قيمة هذه خطوط الخلايا في توفير البيانات الدقيقة للبحوث علوم الحياة.

مصادر التلوث الميكوبلازما في المختبر هي صعبة للغاية للسيطرة تماما. كما تم العثور على أنواع معينة ميكوبلازما على جلد الإنسان ، ويمكن من خلال تقنية تعرفوا العقيم الفقراء. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها يمكن أن تأتي من مكملات الملوثة مثل مصل بقري جنيني ، والأهم من غيرها من الثقافات الخلية الملوثة. مرة واحدة ميكوبلازما يلوث ثقافة ، فإنه يمكن أن تنتشر بسرعة لتلويث مناطق أخرى من المختبر. الالتزام الصارم الممارسات المختبرية الجيدة ، مثل تقنية العقيم الجيدة هي المفتاح ، وينصح بشدة الفحص الروتيني للميكوبلازما للنجاح في مراقبة التلوث ميكوبلازما.

أصبح PCR المستندة الكشف عن الميكوبلازما وسيلة شعبية جدا لصيانة روتينية خلية الخط. طرق الكشف PCR المستندة حساسة للغاية ويمكن أن تقدم نتائج سريعة ، والذي يسمح للباحثين على الاستجابة بسرعة للقضاء على التلوث وعزل حال اكتشافه بالمقارنة مع الوقت المطلوب باستخدام التقنيات الميكروبيولوجية. الكشف عن بالمرصاد PCR المفطورة كيت حساس للغاية ، مع حد الكشف عن الجينوم سوى 2 في ميكرولتر. الاستفادة من البلمرة Jumpstart من الحمض النووي طق محددة للغاية والتصميم التمهيدي الملكية ، وتقلص إلى حد كبير ايجابيات كاذبة. ومريحة 8 أنبوب تنسيق ، والشرائط قبل المغلفة مع dNTPs والاشعال المرتبطة يساعد على زيادة الإنتاجية لتلبية احتياجات العملاء بشكل اكبر مع مجموعات من خطوط الخلايا.

نظرا للحساسية البالغة للمجموعة ، يجب توخي الحذر الشديد لمنع التلوث غير المتعمدة من العينات والكواشف. البروتوكول خطوة بخطوة نظهر يسلط الضوء على الممارسات والاحتياطات اللازمة للكشف عن ميكوبلازما موثوق بها. نحن أيضا إظهار ومناقشة نتائج نموذجية وتفسيرها. هدفنا هو التأكد من نجاح الباحثين باستخدام الكشف بالمرصاد PCR المفطورة كيت.

Protocol

1. ميكوبلازما كشفها

  1. ويمكن اختبار supernatants ثقافة الخلية مباشرة أو نموذج يمكن إعدادها للاستخدام في وقت لاحق. للتحضير لاستخدامها لاحقا مكان 100 ميكرولتر من طاف في أنبوب التضخيم معقمة واحتضان درجة مئوية لمدة 5 دقائق. في 95 بمجرد اكتمال هذه يمكن تخزينها في العينة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. فقط قبل إلى تشغيل أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة العينة (5 ثوان) لتكوير اي حطام الخلوية.
  2. لتحضير عينات لPCR ، وتحديد الحجم الكلي للطق في Jumpstart العازلة بوليميريز / الإماهة الحمض النووي المطلوبة لردود الفعل. سنكون إعداد 5 ردود الفعل الكلي. وسوف تتطلب ردود فعل 2.5μl خمسة من طق و114.5μl العازلة من الجفاف. هذا وسوف تحتوي على الحد الأدنى من وحدة واحدة من طق في رد الفعل و22.5μl العازلة من الجفاف في رد الفعل السلبي والتحكم العينة زائد 24.5μl من الإماهة العازلة لمراقبة إيجابية. وينبغي أن يضاف 1 وحدة من بوليميريز الحمض النووي في رد فعل على حجم مناسب لتعويض السوائل العازلة. وهذا يختلف مع طق المستخدمة.
  3. مكان حجم المحسوبة بوليميريز الحمض النووي في أنبوب طق microcentrifuge نظيفة واتبع مع حجم المحسوبة العازلة الإماهة. وينبغي أن تكون مختلطة الحمض النووي بوليميريز / الإماهة العازلة بلطف عبها الأنبوب. لا ينبغي أن يكون هذا الخليط vortexed.
  4. لتحضير عينات الرقابة السلبية واستخدام أنابيب شفافة المنصوص عليها في رد فعل عدة. الأنابيب تفاعل المنصوص عليها في عدة تحتوي بالفعل nuclueotides والشعائل والداخلية DNA السيطرة. يجب وضع 23 ميكرولتر من مزيج Jumpstart من الحمض النووي طق العازلة البلمرة / الإمهاء ، الذي أعد في الخطوات السابقة ، في كل من السيطرة السلبية وأنابيب العينات. إضافة 2 ميكرولتر من المياه مجانا الحمض النووي لرقابة السلبية وإضافة 2 ميكرولتر من العينة إلى كل من أنابيب العينات والتسمية. خلط محتويات عبها بواسطة الأنابيب. لا ينبغي أن تكون محتويات vortexed.
  5. لإعداد مراقبة إيجابية استخدام أنابيب رد فعل الوردي المقدمة في المجموعة. الأنابيب تفاعل المنصوص عليها في عدة تحتوي بالفعل nuclueotides والشعائل والداخلية DNA السيطرة. إضافة 25 ميكرولتر من مزيج Jumpstart من الحمض النووي بوليميريز طق العازلة / الإمهاء ، الذي أعد في الخطوات السابقة ، للأنابيب التفاعل والتسمية. خلط محتويات عبها بواسطة الأنابيب. لا ينبغي أن تكون محتويات vortexed. احتضان سيطرة سلبية ، والسيطرة الإيجابية وأنابيب العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. لPCR أن تجرى على العينات يجب أن توضع في cycler الحرارية. عند استخدام برنامج Jumpstart طق غير مطلوب خطوة التنشيط. وضع أنابيب رد الفعل في cycler الحرارية. يجب تعيين دورات على النحو التالي : 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية. وسيتم تشغيل هذه الدورات 40 مرة.
  7. يجب مرة واحدة في دورات PCR تكون قد أكملت تبريد عينات الى 4-8 درجة مئوية بحلول حرمانهم من cycler الحراري ووضعها في الجليد. وينبغي عند عينات فترت يكون تحميلها agarose هلام للالكهربائي. تحميل الجل وصبغ ليست ضرورية لأنها موجودة بالفعل في أنابيب التفاعل. 8 تحميل مباشرة لكل ميكرولتر PCR في ممر منفصل. وقف الكهربائي بعد هجرة 2،5-3،0 سم.

2. ممثل النتائج

ينبغي للسيطرة سلبية تظهر الفرقة في حوالي 481 سنة مضت. ويمكن ملاحظة ذلك في العمود تحكم سلبي على هلام الكهربائي الذي يظهر في بداية الفيديو. غياب الرقابة السلبية في الفرقة 481 سنة مضت ، هي مؤشر جيد على أن نشاط بوليميريز لم sufficienttaq المستخدمة لم تكن حساسة بما فيه الكفاية.

سوف تظهر عينات إيجابية ميكوبلازما العصابات في مجموعة من 270 ± 8 الغليان. وسوف يكون ثقيلا الفرقة لعينات ملوثة للغاية وخافت لعينات ملوثة طفيفة. ويمكن النظر إلى الاختلافات في كثافة في الأعمدة نموذج ايجابي على هلام الكهربائي الذي يظهر في بداية الفيديو. جميع العينات تحتوي على الرقابة الداخلية السلبية لإثبات أن PCR حدث كما هو متوقع. فمن الطبيعي أن نرى غياب الرقابة الداخلية على عينات ملوثة للغاية.

إذا لم يكن هناك عصابة في النطاق الإيجابي أو الفرقة في النطاق السلبي على عينتك هذا يعد مؤشرا جيدا أن تحول دون العينات الخاصة بك. يمكن إذا ما يحول دون تكون العينة إزالة مثبطات PCR عن طريق إجراء استخراج الحمض النووي.

الشكل 1
وتظهر نتائج الكشف عن ميكوبلازما بواسطة PCR : الشكل 1 Amplicon العصابات ذات الصلة. 2 لين هو السيطرة السلبية ، التي ينبغي أن تظهر الفرقة في حوالي 481 سنة مضت. غياب الرقابة السلبية في الفرقة 481 سنة مضت ، هي مؤشر جيد على أن تستخدم طق لم تكن حساسة بما فيه الكفاية. سوف ميكوبلازما عينات إيجابية تظهر عصابات في نطاق 270 + 8 الغليان كما هو مبين في الممرات 3-6. وسوف تكون الفرقة هيئة التعليم العاليVY لعينات ملوثة للغاية (حارة 6) ، وخافت لعينات ملوثة طفيفة (حارة 4). جميع العينات تحتوي على الرقابة الداخلية السلبية (481 بي بي) لإثبات أن PCR حدث كما هو متوقع. فمن الطبيعي أن نرى غياب الرقابة الداخلية على عينات ملوثة للغاية.

Discussion

وبسبب الحساسية المفرطة من المجموعة ، وعندما يقوم بشكل صحيح يجب أن تسفر عن نتائج محددة عدة تشير إلى أم لا فقد عينتك ميكوبلازما التلوث. وقد الأمثل للاستخدام مع طقم البلمرة Jumpstart من الحمض النووي طق. ويمكن استخدام taqs الأخرى عند إعداد العينات ولكن الرقابة الداخلية في الفرقة 481 الغليان يجب أن تكون موجودة تشير إلى حساسية السليم للطق البديلة. فمن الممكن لنطاقات ايجابية لمعرض كثافات مختلفة تبعا لمستوى التلوث. فمن الممكن أن نلاحظ غياب الفرقة الرقابة الداخلية على عينات ملوثة بشدة. الحذر واستخدام الأسلوب السليم عند إعداد عينات لمنع التلوث وحاسمة لالمناسبة. كشف عند استخدام الكشف بالمرصاد PCR المفطورة كيت.

Disclosures

المؤلفون هم موظفون من سيغما الدريخ التي أنتجت الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Acknowledgements

بتمويل من سيغما الدريخ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics