マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

Biology
 

Summary

見張りマイコプラズマPCR検出キットは、細胞培養と生物製剤由来の他の細胞培養で、マイコプラズマAcholeplasma、およびウレアプラズマ汚染の検出に最も感度のための選択の方法として確立されて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用しています。

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Dobrovolny, P. L., Bess, D. Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma. J. Vis. Exp. (52), e3057, doi:10.3791/3057 (2011).

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Abstract

汚染のない細胞株の維持は、細胞ベースの研究に不可欠です。最大の汚染物質の懸念の中でマイコプラズマ汚染です。マイコプラズマは、通常、汚染された細胞を殺すことはありませんが、彼らは検出することが困難であり、新陳代謝の変化を含む培養細胞、、上の様々な効果を引き起こす可能性増殖と染色体異常を遅らせた。一言で言えば、マイコプラズマ汚染がライフサイエンス研究のための正確なデータを提供することで、これらの細胞株の価値が損なわれます。

実験室におけるマイコプラズマ汚染の源は非常に完全に制御することが挑戦しています。特定のマイコプラズマ種が人間の皮膚に見られるように、彼らは貧しい無菌操作を介して導入することができます。さらに、彼らはそのようなウシ胎児血清などの汚染されたサプリメントから来ることができる、そして最も重要な他の汚染された細胞培養物から。一度マイコプラズマが文化を汚染、それはすぐに研究室の他の地域を汚染して広げることができます。良い無菌操作などの検査室の安全基準を厳守が鍵であり、マイコプラズマのためのルーチン検査は、非常にマイコプラズマ汚染の成功を制御することをお勧めします。

マイコプラズマのPCRベースの検出は、ルーチン細胞株の維持のための非常にポピュラーな方法となっている。 PCRベースの検出方法は非常に敏感であり、研究者は、それが微生物学的手法を用いて必要な時間と比較して検出されると、汚染を分離し、除去するために迅速に対応できるように迅速な結果を、提供することができます。見張りマイコプラズマPCR検出キットは、ウェルあたりわずか2ゲノムの検出限界で、高感度です。高度に特異的なJumpStartのTaq DNAポリメラーゼと独自のプライマー設計を活かし、偽陽性が大幅に削減されます。便利な8連チューブのフォーマット、dNTPでプレコートされたストリップ、および関連するプライマーは、細胞株の大規模なコレクションを、お客様のニーズを満たすために、スループットの向上に役立ちます。

キットの極端な感度を考えると、細心の注意を試料と試薬の不注意による汚染を防ぐために注意しなければなりません。我々は実証ステップバイステップのプロトコルは、信頼性の高いマイコプラズマ検出に必要な予防措置や慣行を強調しています。我々はまた、表示と典型的な結果とその解釈について説明します。私たちの目標は、目を光らせマイコプラズマPCR検出キットを用いて研究者の成功を確実にするためです。

Protocol

1。マイコプラズマ検出

  1. 細胞の培養上清を直接テストすることができるまたはサンプルは、後日使用する目的で作成できます。の準備をするために、後95℃で滅菌増幅管とインキュベートで上清の代わりに100μlのを使用して℃で5分間。一度これは、サンプルが最大1週間2〜8℃で保存することができます完了です。ちょうど前のペレットのサンプルの短時間の遠心(5秒)、任意の細胞破片を実行する。
  2. PCR用サンプルを準備するには、反応に必要なジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ/再水和バッファの総量を決定する。我々は、合計5つの反応を準備されます。五反応はTaqの2.5μlおよび再水和のバッファの114.5μl必要になります。これはサンプルの反応とポジティブコントロールのための補水のバッファの負の制御に加え、24.5μlあたりの水分補給のバッファの反応と22.5μlあたりTaqの一単位の最小値が含まれます。反応あたりのDNAポリメラーゼの1単位は、補水のバッファの適切な音量に追加する必要があります。これは、使用されるTaqポリメラーゼによって異なります。
  3. きれいなマイクロ遠心チューブにTaq DNAポリメラーゼの計算されたボリュームを配置し、補水のバッファの計算量で従ってください。 DNAポリメラーゼ/水分補給のバッファは、チューブをタッピングし穏やかに混合されるべきである。この混合物をボルテックスしてはいけません。
  4. ネガティブコントロールとサンプルを準備するには、キットに付属の透明な反応チューブを使用してください。キットに含まれている反応管は既にnuclueotides、プライマーと内部コントロールDNAが含まれています。前の手順で準備したジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ/膨潤バッファーミックス23μlを、ネガティブコントロールとサンプルチューブの各々に配置する必要があります。ネガティブコントロールするDNAフリー水を2μlを加え、サンプルチューブとラベルの各サンプル2μlを加える。チューブをフリックでコンテンツを混在させること。内容をボルテックスしてはいけません。
  5. 準備するにはポジティブコントロールはキットに付属のピンクの反応チューブを使用してください。キットに含まれている反応管は既にnuclueotides、プライマーと内部コントロールDNAが含まれています。反応管およびラベルに、前の手順で準備した、ジャンプスタートTaq DNAポリメラーゼ/膨潤バッファーミックス25μlを添加する。チューブをフリックでコンテンツを混在させること。内容をボルテックスしてはいけません。 5分間室温でネガティブコントロール、ポジティブコントロールおよびサンプルチューブをインキュベートする。
  6. PCRの場所にするために、サンプルは、サーマルサイクラーに配置する必要があります。 JumpStartのTaqを使用する場合、アクティベーション手順は必須ではありません。サーマルサイクラーでの反応チューブを置きます。サイクルは次のように設定する必要があります:94℃30秒、55℃30秒と40秒72℃のためのC。これらのサイクルを40回実行されます。
  7. PCRのサイクルが完了したらサンプルをサーマルサイクラーからそれらを削除し、氷に入れて、4〜8 ° Cまで冷却する必要があります。試料が冷却されているとき、彼らは電気泳動用アガロースゲルにロードする必要があります。彼らはすでに反応管に存在する限りローディングゲルと染料は不要です。直接、別の車線に各PCRに8μlをロードする。 3.0センチメートル - 2.5の移行後に電気泳動を停止します。

2。代表的な結果

ネガティブコントロールは、約481 bpのバンドが表示されるはずです。これは、ビデオの先頭に表示されている電気泳動ゲル上でネガティブコントロールの列で見ることができます。 481 bpのネガティブコントロールのバンドがない場合は、ポリメラーゼの活性がsufficienttaqが使用されていないことを示す良い指標が十分に敏感ではなかったです。

マイコプラズマ陽性検体は、270の範囲でバンドを± 8塩基が表示されます。バンドは、高度に汚染されたサンプルの重いと軽く汚染されたサンプルのかすかになります。強度の変化は、ビデオの先頭に表示されている電気泳動ゲル上の正のサンプルの列で見ることができます。すべてのサンプルは、PCRが期待どおりに発生したことを示すために内部ネガティブコントロールが含まれています。それは高度に汚染された試料の内部統制が存在しないことを確認するのが普通です。

あなたのサンプルの負の範囲で正の範囲またはバンドのバンドがない場合、これはあなたのサンプルが阻害されていることを示す良い指標です。サンプルが禁止されている場合はPCRの阻害物質は、DNAの抽出を行うことにより除去することができます。

図1
図1関連するアンプリコンのバンド:PCRによるマイコプラズマ検出の結果が表示されます。レーン2は、約481 bpのバンドが表示されるはず陰性コントロール、です。 481 bpのネガティブコントロールのバンドがない場合は、使用されるTaqポリメラーゼが十分に敏感ではなかったことを示す良い指標です。 6 - マイコプラズマ陽性サンプルは、レーン3に示すように270 + 8 bpの範囲でバンドが表示されます。バンドは、HEAになりますVY高度に汚染された試料(レーン6)と軽く汚染された試料(レーン4)のためのかすかなため。すべてのサンプルは、PCRが期待どおりに発生したことを示すために内部陰性コントロール(481 bp)を含んでいます。それは高度に汚染された試料の内部統制が存在しないことを確認するのが普通です。

Discussion

のでキットの極端な感度で、正しく実行時キットは、サンプルがマイコプラズマ汚染があるかどうかを示す正確な結果が得られるはずです。このキットは、JumpStart Taq DNAポリメラーゼの使用に最適化されています。他のtaqsはサンプルを準備する際に使用されることがありますが、481 bpの内部統制のバンドは、代替Taqの適切な感度を示すために存在している必要があります。それは、汚染のレベルに応じて様々な密度を示すために正のバンドは可能です。汚れが多い試料での内部統制のバンドの有無を観察することが可能です。汚染を防ぐためにサンプルを準備する際の注意と適切なテクニックを使用すると、適切なため非常に重要です。見張りマイコプラズマPCR検出キットを用いて検出。

Disclosures

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するシグマアルドリッチの従業員です。

Acknowledgements

Sigma - Aldrich社によって資金を供給

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma-Aldrich MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplification tubes Sigma-Aldrich T0447

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References

  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. (2011).

Comments

1 Comment

  1. how may runs per kit provides the kit???What is the price?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 16, 2011 - 7:58 PM

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