측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Neuroscience
 

Summary

래터럴 유체 타진 (LFP), 생쥐의 외상성 뇌 손상의 설립 모델이 증명됩니다. LFP 동물 모델에 대한 세 가지 주요 기준을 충족 : 타당성, 안정성 및 임상 관련. 수술 craniotomy 구성 절차, 허브의 고정은 초점과 확산 부상의 결과로, 상해의 유도 뒤에 설명되어 있습니다.

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Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

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Abstract

외상성 뇌 손상 (TBI) 머리 부상의 증가 의식에 의한 연구가 달성 갱신 추진력, 병적 상태와 사망률의 결과. 재생 프로세스 1,2 뒤에 아르 TBI, 복잡하고 이질적인 보조 결과 결과, 다음 주 부상의 성격에 따라. 주 상해는 두개골 골절 또는 전단 및 이동 3,4로 인해 두뇌의 조직 발생 변위의 스트레칭의 두뇌에 직접 타박상에 의해 유도된 수 있습니다. 그 결과 hematomas과 상처는 혈관 반응 3,5 원인, 그리고 흰색 물질의 형태학의 기능적인 손상이 axonal 부상 6-8을 무마하기 위해 연결됩니다. 일반적으로 두뇌에서 볼 추가 보조 변경 부종 증가 intracranial 압력 9아르. TBI에 따라 궁극적으로 장기적인 신경 장애를 초래할 13,14 excitotoxic 신경 전달 물질, 면역 중재자와 산소 래디 칼 10-12의 출시와 관련된 생화 학적 및 생리 학적 경로의 미세한 변경이 있습니다. 따라서 인간과 설치류 TBI에있는 유사한 세포와​​ 분자 이벤트 부상 및 수리를 기본 메커니즘을 연구를위한 중요한 것을 TBI의 적절한 동물 모델을 선택.

유체 타진, 대뇌 피질의 충격과 체중 드롭 / 충격 가속 1 : TBI의 다양한 실험 모델은 그 중 세 특정 모델을 널리 설치류에 맞게 있으며, 인간 관찰 TBI의 측면을 재현하기 위해 개발되었습니다. 유체 타악 장치는 그대로 두라에 간단한 유체 압력 펄스를 적용하여 craniectomy를 통해 부상을 생산하고 있습니다. 펄스는 액체의 저수지의 피스톤을 때리는 진자에 의해 생성됩니다. 타악기는 간단한 변위 및 신경 조직 1,15의 변형을 생산하고 있습니다. 반대로 피질 충격 부상 공압 압력 16,17 아래 단단한 임팩터 통해 그대로 두라에 기계적 에너지를 제공합니다. 체중 드롭 / 충격 모델은 닫힌 해골 18 특정 질량을 가진 막대의 가을이 특징입니다. TBI 모델 중 LFP 혼합 초점 및 확산 뇌 손상 19 평가할 수있는 가장 설립하여 일반적으로 사용되는 모델입니다. 그것은 다시 재현할 수 있습니까 부상 매개 변수의 조작 수 있도록 표준화합니다. LFP의 recapitulates 부상 따라서는 임상 관련 렌더링, 인간 관찰, 임상 번역 20 소설 치료제의 탐험을 허용합니다.

우리는 생쥐에서 LFP 절차를 수행하기 위해 상세한 프로토콜을 설명합니다. 입은 부상은 피질, 해마의 가장 취약하고 코퍼스의 callosum 같은 뇌 영역과 중간에 온화합니다. Hippocampal 및 모터 학습 작업 LFP 다음과 탐험하고 있습니다.

Protocol

1. Craniectomy

  1. 무균 수술 사이트는 수술 중에 isoflurane의 지속적인 흡입 수 있도록 O 2 플러시 (파클랜드 과학)과 마취 기계에 연결된 마우스 가스 마취 머리 홀더 (Kopf 인 스트 루먼트)와 마우스에 대한 stereotaxic 정렬 악기 (Kopf 악기)를 포함 준비가되어 있습니다 . C가 수술하는 동안 마우스를 아래에 배치됩니다 ° 온난 패드 37 있었죠. 수술 현미경 및 광원이 필요합니다. 실험자들은 다루는 실험실 외투, 수술 마스크, 발 커버, 장갑, 그리고 머리를 착용해야합니다. 외과 사이트에 문의 모든 도구와 자료는 소독해야합니다.
  2. Luer - 록의 여성 끝에 구성된 부상 허브, 면도날과 ½ "바늘 (백톤 디킨슨). 허브는 약간의 편견과 절단해야 20g 1의 금속 끝을 잘라 만든 것입니다 약 3mm 내경 오픈되어 있습니다. trephine는 (단계 1.10 참조) 정확한 직경의 부상 허브를 측정하고 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 한 허브 동물마다 필요합니다. 허브는 두개골에 붙어 LFP로 연결됩니다 압력의 펄스를 제공하는 장치.
  3. 솔리드 나일론 코드 (1.7 mm 직경 예 비드 트리머 라인)은 면도날을 사용하여 ~ 1mm 두께의 디스크로 절단됩니다. 다시 말하지만, 하나의 디스크는 동물마다 필요합니다. 이것은 (단계 1.10 참조) craniectomy을 수행하는 동안 trephine을 안정화하는 데 사용됩니다.
  4. 마우스는 어떤 변형과 연령 (- 9개월 우리가 주로 C57BL / 6 세 1을 사용)의 수 있습니다. 마우스는 최소한 1 분 작은 유도 챔버 (100 % O 2에 isoflurane 4~5% 사전 가득한)의 무게와 anesthetized입니다. 선제 진통제 들어, buprenorphrine (0.1 밀리그램 / kg)의 주사가 intraperitoneally 부여되고 마우스가 다른 잠시 동안 의회에 다시 배치됩니다. 진통제 처방은 지역 동물 사용 및 관리위원회와 협의하여 확정한다.
  5. 마우스의 머리 위에 머리는 가능한 한 피부에 가까운 손질합니다. 마우스는 휘발성 가스 마취 (Kopf 인 스트 루먼트)를 관리하기위한 입 도금 장착되어 stereotaxic 정렬 악기에 위치합니다. isoflurane 가스의 수준은 2 %이나 효과 줄어 듭니다. 호흡 속도는 수술 중에 시각 모니터입니다. 이러한 혈액 가스와 같은 다른 생리적 매개 변수 (P O 2, P CO 2), 혈액 산도이나 혈압이 절차를 수행하는 동안 해당 장비를 사용하여 측정할 수 있습니다.
  6. 인공 눈물 윤활유 아이 연고는 건조에서 그들을 유지하는 면으로 된 작은 주걱을 사용하여 마우스의 눈에 들어가게된다. Povidone - 요오드는 70 % 알콜 다음 면화 작은 주걱으로 눈을와 목 사이를 피부에 적용됩니다. povidone - 요오드와 알코올의 응용 프로그램은 3 회 총 반복됩니다.
  7. 정중선 두피 절개는 두개골을 노출하고 명확한 외과 필드를 제공하는 작은 불독 겸자 철회 메스 (# 15 블레이드)와 피부 (파인 과학 도구 # 18050-28)를 사용하여 눈을에서 목에 이루어집니다. 불독 클램프는 두개골의 측면 가장자리를 끊지.
  8. 국소 마취 bupivacaine (호수의 0.025 %)은 면화 작은 주걱과 근막이 치과 도구나 뼈 스크레이퍼 (예 : 파인 과학 도구, # 10075-16)의 팁과 두개골에서 스크랩한 것입니다로 두개골에 적용됩니다.
  9. 영구 마커는 중간 bregma과 람다 사이 오른쪽 뇌를 (정중선의 오른쪽 ~ 2 ㎜) 이상의 화살 봉합과 측면 능선 사이의 두개골을 표시하는 데 사용됩니다. Loctite cyanoacrylate 접착제 (Loctite 탁 박 454)의 드롭은 보트 측면 쥐고 집게 (파인 과학 도구, 더몬트 # 6)에 비드 견고한 나일론 코드의 디스크를 (위의 1.3 참조) 수영하는 데 사용되는 무게는 플라스틱에 들어가게된다 다음 접착제하고 두개골에있는 지시에 따라 디스크를 누르십시오. Loctite 가속기 중 하나에 두 방울은 접착제의 경화를 일으킬 수있는 1ml 주사기와 26 3 / 8 G 바늘을 사용하여 디스크의 상단에 전달됩니다. 진행하기 전에 두개골에 디스크의 테스트 부착.
  10. 디스크에 비해 3mm 외경 trephine을 (연구 계측 쇼핑, 펜실베니아 대학) 장소 및 두개골을 통과하여 갈 때까지 시계 방향으로 회전. 너무 멀리 두개골과 위배 두라에 책임을 피하기 위해 자주 trephine의 진행 상황을 확인합니다. 가볍게 눌렀을 때 디스크와 두개골 플랩의 주위에 두개골이 얇아은 자유롭게 느낄 것이다있을 것이다. 두개골 아래 놀리려는과 뼈가 플랩을 세운 치과 도구 병렬 / 두개골의 표면에 수평 놓습니다. 포셉와 두개골의 뼈를 분리합니다. 두라의 손상없이 출혈의 작은 금액이있다면 출혈이 중지되고 두라에 얻는 뼈 먼지를 방지 때까지 압력을 적용하는 면으로 된 작은 주걱을 사용합니다. 이러한 것을 헤르 니아가되는 것을 볼 수있는 두라에 위반이있는 경우 그러나, 동물은 인간 안락사에 의해 실험에서 제거되어야합니다. 이 단계는 충분한 연습이 필요필요한 수술 기술을 달성하기 위해.
  11. 허브의 바이어스가 두개골 (예 : 허브의 긴 가장자리는 두개골의 측면 능선 근처에 자리잡고 있습니다)의 곡률에 부합되도록 집게를 사용하여 두개골의 craniectomy 이상의 위치에 부상 허브를 유지합니다. 한편, 날카로운 팁을 가지고 면도날과 각도로 절단 나무 막대기를 사용, 그 반대 손으로 허브의 외부 가장자리 주위에 슈퍼 접착제 젤을 적용하고이 구멍을 통해 수직으로 부착된 때까지 허브를 안정화. 케어는 두라 위에 접착제를하지 않도록해야합니다. 두라에 접착제가 부상의 감쇄가 발생합니다.
  12. 작은 종이컵을 사용하여 점성 솔루션을 만들 수 메틸 메타 크릴 레이트 - 아크릴 치과 (펌의 Reline / 수리 수지, 버틀러 Schein과 제트 아크릴 액체)를 섞는다. 모든 부상 허브 주위에 시멘트를 적용하는 부착없이 바늘로 1 CC의 주사기를 사용합니다. 시멘트는 부상 허브의 하단 2mm뿐만 아니라 주변 노출된 두개골을 커버한다. 두개골의 봉합은 부상에서 유체 볼러스이 두개골 구멍 안에 남아 있도록 시멘트로 봉쇄하고 있습니다.
  13. 주사기와 바늘을 사용하여 무딘 멸균 0.9 % NaCl (염분)과 허브를 입력합니다. 호수가 복구 단계 동안 두라의 촉촉한을 유지합니다. 또한, 부상 허브가 가득 체류하지 않는 경우, 두개골에 허브 연결 누수를 나타내는 것입니다 새로운 허브가 첨부되어야합니다. 마우스는 stereotaxic 정렬 기기에서 제거하고 온난 화 접시에 노 와이어 바 뚜껑이있는 빈 새장에 배치 멸균 생리 IP의 0.25 ML 사출을 부여해야합니다. 새장 바닥에 몇 hydragel을 놓고 쥐가 1-2 시간 동안 복구할 수 있습니다.

2. 부상 유도

  1. LFP 장치에 연결되어있는 오실로 스코프 (텍트로닉스 TDS 1001B, 두 채널 Digi 스토리지 오실로 스코프 40 MHz 이상, 500Ms.s) 및 앰프 (외상 유도 압력 변환기 증폭기)를 켭니다. LFP 장치 (사용자 정의 설계 및 제작, 버지니아 커먼 웰스 대학)와 그것에 연결된 고압 튜브가 (길이 41cm, 볼륨 2ml, 백스터 # 2C5643) 멸균 물을 채워 공기 방울 무료입니다 있는지 확인합니다. 튜브의 끝에 남성 Luer - 록의 조각입니다. 튜빙의 Luer - 록의 끝이 닫힌 상​​태에서 진자를 발표하여 테스트 펄스를 제공합니다. 장치는 약 10 테스트 펄스를 제공함으로써 끝났다해야합니다. 그 진자는 오실로 스코프와 앰프에 부드러운 신호를 제공합니다 확인합니다. 시끄러운 신호가 부상 펄스를 전달하기 전에 제거해야합니다 시스템에서 공기를 나타냅니다. 펄스의 기간은 약 20 밀리초해야합니다. LFP 장치와 함께 제공된 변환기 증폭기는 교정과 같은 것을 10 MV = 평방 인치 당 1.0 파운드 (PSI). 한 분위기 (ATM) = 14.7 PSI. 반사 시간과 폐 부종과 관련된 사망률 증가를 righting의 범위를 생산하기 위해 2.1 대기 - 전달 부상 압력은 0.9의 범위에 일반적으로있다. 4 분 및 0 - - 5 %의 사망률 가벼운 부상은 2 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 10 분 및 10 - - 20 %의 사망률 보통 부상은 6 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 필요한 경우, 펄스의 강도를 증가 또는 감소로 진자의 각도를 조정합니다. 진자의 시작 위치의 각도가 약 10도 정도입니다. LFP 장치를 조정 후, 튜브의 Luer - 록 엔드를 열고해야합니다.
  2. 마우스는 마취 수술 비행기에 도달할 때까지 4~5% isoflurane 마취 챔버 (미리 유료)에 배치됩니다. 마우스는 LFP 장치 옆에 플랫폼에 배치되고 허브 멸균 식염수로 가득합니다. 남성 Luer - 록과 LFP 장치의 튜브는 허브의 여성 Luer - 록 피팅에 첨부되어 있습니다. 동물은 그 옆에 한 번 정상적인 호흡 패턴 이력서에 위치하지만 이전에 완전한 의식 (~ 2 분) 회복 동물로, LFP 장치의 진자는 부상의 단일 펄스를 발생 배포되고 있습니다. 그것이 호흡과 죽음을 일으킬 수로 동물도 anesthetized있는 동안 그것은 부상을 유발하지 않는 것이 중요합니다. 펄스의 정확한 압력이 기록되어야합니다. 손상되지 않은, 가짜 동물은 부상을 유발하는 실제 유체 펄스의 예외와 동일한 절차를 모두 받고있다.
  3. 동물은 즉시 LFP 장치에서 제거하고 righting 반사 시간을 모니터하기 위해 뒷면에 배치해야합니다. 마우스 자체를 righted 후 다시 다음 잠시 anesthetized 있으며, 시멘트와 허브는 손으로 두개골에서 함께 삭제되었습니다. 두피는 다음 Vetbond 조직 접착제 (3M), 봉합 또는 스테이플과 함께 닫힙니다. 허브의 두라이나 폐색의 헤르 니아가되는 것이 기록됩니다. occluded 허브 알 수없는 크기의 감쇠 부상을 생산합니다. 다음 외래와는 홈 케이지에 반환 때까지 동물은 온난 패드에있는 새장에 다시 배치됩니다.

3. 모터의 평가,인지 및 histological 결과

  1. MOLFP에 의한 토르 적자는 rotarod 테스트, 통합 vestibulomotor 및 sensorimotor 기능 21 지표를 사용하여 결정하실 수 있습니다. 모든 동물은 기본적인 독서를 결정하고 패러다임에 쥐를 적응하기 전에 부상을 테스트해야합니다. 생쥐 전에 부상으로 이틀 동안 1 시간 간격으로 intertrial rotarod 장치에 하루 3 번 훈련하고 있습니다. 고무 표면이있는 36 mm 외경, 회전 막대에 균형을 지연이 측정됩니다. 속도가 180 초 이상의 간격 4-40 RPM에서 증가합니다. 동물 rotarod를 될때 각각의 재판은 끝납니다.
  2. 상해 (일반적으로 1, 7 21 일) 다음과 같은 서로 다른 시간 시점에서, 생쥐는 다시 rotarod 장치에 테스트됩니다. 부상 후 rotarod 시험의 평가들은 기본 대기 시간 22 상대적으로 개별 점수를 기준으로합니다. 부상 마우스의 가을에 평균 대기 시간은 가짜 마우스의 비교입니다.
  3. 인지 기능을 다음과 LFP는 모리스 워터 미로 (MWM), 설치류 23 외상후 공간 학습과 작업 메모리의 민감한 측정을 사용하여 마우스 별도의 세트에 테스트하실 수 있습니다. 생쥐는 패러다임에 acclimated 4 일 이전 상해에 보이는 플랫폼 테스트를 사용하여 기본적인 응답을 테스트하고 있습니다. 흰색 원형 수영장이 (1m 직경) 물, 무독성 흰색 페인트로 가득합니다. 플랫폼은 벽에있는 깃발이나 마커없이 시각적 단서를 사용하여 볼 수 이루어집니다. 네 시련 동안 마우스가 보이는 플랫폼의 반대 사분면에 위치하고, 플랫폼을 찾기 위해 대기 시간이 측정됩니다. 최대 시험 시간은 60 초이며 마우스는 남아 각 시험의 끝에서 15 초에 대한 플랫폼에 배치됩니다. intertrial 간격은 마우스가 가열 패드를 따뜻하게하는 동안 5 분입니다. 플랫폼은 각각의 재판에 대해 다른 사분면으로 이동하고 네번이나 재판이 수행됩니다.
  4. 학습 평가하기 위해 생쥐는 상해 (일반적으로 1, 7 21 일) 다음과 같은 여러 시간 지점 4 quadrants 중 하나에 고정 숨겨진 플랫폼을 사용하여 MWM에서 훈련을하고 있습니다. 흑백 신호는 벽면에 표시됩니다. 마우스가 배치되는 사분면은 pseudorandomly 플랫폼 기록됩니다 찾습니다 훈련과 시간에 걸쳐 다양합니다. 최대 시험 시간은 60 초이며 마우스는 남아 15 초에 대한 플랫폼에 위치하고 실험 사이에 5 분 예열합니다. 마우스는 3 일 연속 8 재판 / 일를 받게됩니다. 메모리 보존을 평가하기 위해 동물은 마지막 훈련 다음날 60 초 프로브 재판을 받게됩니다. 프로브 재판이 진행되는 동안,이 플랫폼은 시간 소비와 플랫폼으로 사용하는 사분면에있는 거리까지 수영을 결정하기 위해 제거됩니다. 마지막으로, 눈에 띄는 플랫폼 테스트는 가능한 모터와 사후 부상을 개발 시각 결손을 배제하기위한 것입니다.
  5. LFP 부상 histological 결과를 확인하려면, 조직은 NaCl이 부상 후 원하는 시간 지점에서 4 % paraformaldehyde 다음 0.9 %에서 intracardial 재관류에 의해 고정됩니다. 조직은 4 박 postfixed 있습니다 ° C 그리고 10 % cryoprotected 30 %의 자당 및 삽입 솔루션입니다. 냉동 시리얼 섹션은 그라 이오 스탯에 상처 다양한 immuohistochemical 및 histological 기술을 이용하여 처리됩니다.

4. 대표 결과 :

LFP 장치에 의해 유도 부상은 특히 충분한 수술 훈련, 동물에서 동물로 재현할 수있다. 부상의 일관성을 유지하기 위해 장치에 의해 두라로 전달 압력의 크기는 모니터입니다. 진자는 동물에 craniectomy 사이트 (그림 1A)에 부착된 부상 허브에 연결된 고압 튜브 및 Luer - 록 피팅과 물이 채워진 아크릴 실린더를 친다. 2.1 ATM 및 증폭기에 연결된 오실로 스코프는 압력 펄스 (그림 1B)를 시각화하는 데 사용됩니다 - 상해를 운영 가벼운 들어, 진자의 각도는 0.9에 이르는 압력을 생성하도록 설정되어 있습니다. 부상 반응 시간과 폐 부종과 관련된 사망률 증가를 righting의 범위를 생산하고 있습니다. 4 분 및 0 - - 5 %의 사망률 가벼운 부상은 2 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 10 분 및 10 - - 20 %의 사망률 보통 부상은 6 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 또한, LFP의 대상이 생쥐는 발작을 나타내는 수 있습니다 토닉 허세가 발생할 수 있습니다. 발작은 종종 손상된 두라와 연결되어 있습니다. 함께,이 결과는 부상이 신경 손상을 일으키는 것을 권해드립니다. 섐 동물은 LFP 장치에 연결되어 있지만 진자​​는 공개되지 않습니다.

LFP에 의해 유발되는 피해를 시각화하기 위해, 우리는 astrocytes 및 부상에 대한 반응과 관련된 세포 유형 둘 중 macrophages을 인식 항체를 사용하여 immunocytochemistry을 수행했습니다. Glial Fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 얼룩이 부상 무의 지역에서 피질 전반에 걸쳐 증가 gliosis를 보여ereas 위장 마우스 craniectomy 아래에 해당 사이트 (그림 2A, B)에서 증가 astrocytosis를 표시하지 않습니다. 마찬가지로, MAC1 얼룩은 위장 수술의 대상이 생쥐에 비해 부상의 사이트를 둘러싼 많은 macrophages을 보여줍니다. 또한,하지만 가짜 생쥐 (그림 2C, D)에 LFP의 대상이 생쥐에서 볼 수 피질 조직에 자주 물리적 손상이 있습니다.

가벼운 LFP 다음과 같은 행동 테스트는인지와 모터 결과 모두를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. MWM은 학습과 기억에 영향을 결정하는 데 사용됩니다. 테스트 룸에서 영상 신호를 사용하여 위장 마우스는 급속하게 물 미로 훈련의 각 후속 하루 플랫폼의 위치를​​보다 효율적으로되었다. 가벼운 LFP 대상이 마우스는하지만 세 번째 날 (그림 3A)에 의해 작업을 배울 수 표시 위장으로 마우스를 기준으로 테스트의 첫 두 일 숨겨진 플랫폼을 찾을 오래 걸립니다. 이러한 결과는 부상이 생쥐는 공간 학습을 얻을 수있는 속도를 줄일 것을 권장합니다. 메모리 보존에 부상의 효과를 확인하려면 프로브 재판은 마지막 훈련 후 일일 수행됩니다. 위장 마우스는 부상이 플랫폼 (그림 3B) 거주하는 데 사용되는 장소를 기억하기 위해 생쥐의 능력에 영향을 것을 제안 가벼운 LFP의 대상이 생쥐와 비교하여 대상 사분면에 더 많은 시간을 보냅니다. 전위의 기능을 평가하기 위해, 생쥐는 rotarod 장치에 테스트됩니다. 가벼운 LFP 대상이 마우스는 1, 7 21 일 게시 부상 (DPI) (그림 3C)에서 가짜 마우스에 비해 가을 짧은 평균 지연 시간이 있습니다. 이러한 데이터는 부상 쥐가 통합 vestibulomotor 및 sensorimotor 기능 장애가하는 것이 좋습니다.

그림 1
그림 1. LFP 장치와 부상 중 얻은 오실로 스코프에서 대표 추적. A) LFP 장치의 구성 요소는 다음과 같습니다 진자는 원하는 힘, 고압 관과 연결된 남성 Luer - 록 피팅, 증폭기와 아크릴 실린더를 가득 물을 전달하기 위해 미리 정해진 각도에 서서 설정 고정 그리고 오실로 스코프. 오실로 스코프에서 압력 펄스의 B) 대표 추적. 피크 - 투 - 피크 값을 1.47 ATM의 압력을 나타내는 2.16 볼트이다.

그림 2
그림 2. LFP 다음과 같은 향상된 gliosis 및 염증 반응은 부상의 범위를 보여줍니다. 가짜 수술 (A, C) 또는 LFP 상해 (B, D) 7 일 포스트 부상 (DPI)의 대상이 마우스의 두뇌를 통해 얼어붙은 가로 섹션 (20μm). 대뇌 피질의 이미지는 craniectomy의 중심지에서 찍은 있습니다. (A, B) 조직은 astrocytes을 식별하는 항체 물들일 것입니다. Glial Fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 항체 (MAB360, Chemicon, 1:400)는 위장 수술에 비해 LFP 부상 (화살표)의 대상이 마우스의 피질에 걸쳐 astrocytes 높은 숫자를 보여줍니다. 이차 항체 염소 방지 마우스 594 (1:1000)입니다. (C. D) 조직은 macrophages을 식별하는 항체 물들일 것입니다. MAC1 항체 (MAC1 - 알파 체인 CD11b, BD Biosciences, 1시 50분)는 가짜 수술에 비해 피질 (화살표)에서 부상의 사이트의 주위에 더 많은 macrophges 및 / 또는 활성화 microglia을 보여줍니다. 이차 항체 염소 안티 쥐 CY3 (1시 50분)입니다. C와 D. A와 B, 100μm의 스케일 바 = 200μm

그림 3
그림 3. 온화한 LFP 다음과 같은 행동 테스트 가짜 마우스에 비해 부상의 적자를 보여줍니다. A) 가벼운 LFP 대상이 마우스는 가짜 마우스보다 MWM의 플랫폼을 찾는 작업을 배울 오래 걸립니다. 섐 VS LFP (아베 초 ± SEM) 일일 34.21 ± 3.02 VS 38.64 ± 2.63; 이일 24.52 ± 2.84 VS 27.21 ± 2.11, 삼일 22.47 ± 2.00 VS 22.08 ± 2.52 (1 DPI, N = 9 사기, 10 LFP) . B) 가벼운 LFP 대상이 마우스는 가짜 마우스 (21 DPI, 여기서 n은 = 10)로 MWM 상대의 마지막 훈련 후 프로브 재판 24 시간 동안 대상 사분면에있는 더 적은 시간을 보내고. C) 가벼운 LFP를 받게 마우스 빨리 rotarod 장치 떨어지 사기 마우스보다 (1, 7, 21 DPI, N = 5 체하다, 8 LFP). 오류 바 SE를 나타냅니다.

Discussion

LFP 방법은 여기에 제시의 neuropathalogical과 행동 결과 많은 모델은 TBI의 널리 사용되는 동물 모델이 될 이유는 외상성 뇌 손상을 검토할 온화한. 이 기법의 타당성과 신뢰성을 향상시키기 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 두라의 무결성이 craniectomy 중에 손상되지 않은있는 유일한 동물 LFP의 대상 및 연구에 사용하는 것이 중요합니다. craniectomy 어떤 접착제 또는 시멘트에 의해 occluded 경우 또한 craniectomy 아래 두라 이러한 부분이 유체 압력의 강제로 노출하지 않습니다, 동물이 연구에서 제거되어야합니다. righting 반사 시간이나 사망률이 원하는 범위 내에 있지 않은 경우 마지막으로, 동물은 연구에 포함되지 않습니다. 압력 펄스의 강도가 더 심한 부상을 생성 증가 수 있습니다.

그림 1에 나타난 LFP 장치의 구성은 비교적 간단하고 부상의 정도의 재현성은 오실로 스코프에 대한 압박의 분위기를 모니터링하여 유지됩니다. 오실로 스코프 추적에 곡선의 부드러운 형태 LFP 부상의 유도 방해 수있는 유체에 공기 방울이 없다는 것을 나타냅니다. 테스트 펄스가 부상을 유도하기 전에 전달되어야하며 오실로 스코프 추적이 부드러운 곡선을 전시하지 않는 경우, 공기 방울이 제거되어야합니다. 펄스의 기간은 충돌 테스트 시뮬레이션에서 측정 유도 시간을 나타냅니다 약 20 밀리초입니다. 짧은 펄스의 부상이 더 초점 부상을 생산 가능성이 있습니다. TBI 따라서, 펄스 모델이 기간은 인간.

LFP 다음과 같은 형태학의 및 세포 변화는 조직뿐만 아니라 그림 2에서 보여주 astrocytes와 macrophages의 증가 수를 물리적 손상이 포함됩니다. 이곳은 상해의 특징 신호 중 하나가 astrocytes의 증식과 glial 흉터의 형성이라고 설정됩니다. glial 흉터는 유익하고 해로운 효과 24 모두를 가질 표시되었습니다. 마찬가지로, macrophages은 치유 과정 25 시작 때 위상 다음과 같은 부상하는 동안 여러 조직에 축적하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 가짜 컨트롤에 상대적으로 LFP 샘플에서 GFAP 및 MAC1 긍정적인 세포의 증가 숫자는 부상의 유도 나타내는 것입니다. 가짜 컨트롤에서 해당 셀을 특정 마커 표현의 부족 혼자 수술 조작은 부정적인 뇌 조직의 건강에 결과 그 단백질 표현의 변화가 부상 패러다임에만 해당이 없다는 것을 나타냅니다.

그림 3에서 그림 온화한 LFP의 행동 결과는 인지적 및 모터 적자를 포함합니다. MWM의 결과는 LFP 생쥐 결국 가짜 마우스보다 느린 속도지만, 작업을 배우고 그들이 훈련 후 잘 하루가 작업을 기억하지 나타냅니다. 따라서, 심지어는 가벼운 부상 마우스는 이후의 테스트 기간 동안 검색할 수 있어야합니다 공간 정보를, 프로세스 통합, 그리고 저장하는 외부 신호를 사용하는에서 사기 마우스보다 효율적입니다. 이러한 시설이 두려움 반응과 같은 다른 hippocampal 종속 인지적 작업 LFP 26 대상이 생쥐에서 장애인으로 표시되었습니다. 마지막으로, 짧은 대기 시간은 가벼운 부상으로 다음과 같은 최대 3 주 rotarod 패러다임의 사기 마우스에 비해 LFP 마우스로 가을하면 통합 vestibulomotor 및 sensorimotor 기능의 결손의 지표이다. 더 적당한 부상은 다른 그룹에 27-30로 표시되어 같이인지 및 운동 기능에 이상 눈에 띄는 변화를 보여줄 것입니다.

그것이 예상 기준 중 많은 것들을 충족하기 때문에 요컨대, LFP 인간 TBI의 유효한 모델입니다. LFP는 건설 타당성을 제공한다는 점에서 그것은 인간의 TBI 유도 etiological 프로세스를 다시 만듭니다. 특히, 포스와 사망률의 크기는 사전에 부상 수술 개입은 동물 모델에 고유한되는 경고와 온화하고 적당한 스포츠 및 자동차 관련 부상에서 발생하는 것과 비슷합니다. LFP는 또한 인간의 TBI의 관찰 해부, 생화학, neuropathological 및 행동 효과의 많은 것을 LFP recapitulates의 얼굴 유효 기간을 나타냅니다. 초점과 확산 LFP 후에 감지된 변화와 영향의 lateralization 모두 하나가 contralateral 측면에 해당하는 부상을 ipsilateral 측면에 형태학의 손상을 비교할 수 있습니다 있습니다. 하나 주의해야 할 점은인지하고 모터 효과가 하나의 반구를 손상의 결과로 좀 더 정교한 수있다. 마지막으로, LFP는 예측 타당성을 전시하고 LFP 기술의 신뢰성은 부상 20 유도 앞이나 뒤에 다양한 약리과 유전자 조작의 평가를 수 있습니다. 이러한 혈압, 혈액 산도 피로 생리 변수건가 ... 치료 요원의 행동의 메커니즘을 결정하는 시험 약물의 존재와 부재에 측정해야합니다. 그러나, 때문에 TBI의 기본 및 보조 결과의 복잡한 특성, 그것은 증상을 모두 낮출 수있다 하나의 개입을 식별하는 어려운 작업입니다.

LFP 기법에 대한 하나의 미래를 고려 유체 15 진자에 의해 전달되는 힘을 보정의 필요성을 제거하고 같은 공기 방울로 운영 변수를 방지하기위한 마이크로 프로세서 제어, pneumatically 주도 악기를 고용 마이크로 유체 타악기의 사용을 수 있습니다 . 그러나, 표준 LFP 접근이 더 나은 개입 및 치료제로 이어질 것입니다 TBI 다음과 같은 피해 및 복구를 기본 분자 메커니즘을 탐구하기 위해 안정적이고 간단한 방법으로 많은 연구에 의해 입증되었습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 뇌 손상의 연구에 뉴저지위원회 후원됩니다.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

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