Lateral Fluid slagverk: Modell av traumatisk hjärnskada hos möss

Neuroscience
 

Summary

Lateral vätska slagverk (LFP), en etablerad modell av traumatisk hjärnskada hos möss, visar sig. LFP uppfyller tre viktiga kriterier för djurmodeller: giltighet, tillförlitlighet och klinisk relevans. Förfarandet, som består av kirurgiska kraniotomi, följt fixering av navet genom framkallande av skada, vilket resulterar i fokus och diffusa skador beskrivs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Traumatisk hjärnskada (TBI) forskning har nått förnyad kraft på grund av den ökade medvetenheten om skallskador, som leder till sjuklighet och dödlighet. Baserat på typen av primär skada efter TBI, komplexa och heterogena sekundära konsekvenser resultat, vilket följs av regenerativa processer 1,2. Primär skada kan orsakas av en direkt kontusion till hjärnan från skallfraktur eller från klippning och stretching av vävnad som orsakar förskjutning av hjärnan på grund av rörelsen 3,4. Den resulterande hematom och sår orsaka vaskulär respons 3,5, och den morfologiska och funktionella skador av den vita substansen leder till diffus axonal skada 6-8. Ytterligare sekundära förändringar ses vanligen i hjärnan ödem och ökat intrakraniellt tryck 9. Efter TBI det finns mikroskopiska förändringar i biokemiska och fysiologiska vägar som involverar frisättning av excitotoxic signalsubstanser, immun medlare och radikaler syre 10-12, vilket i slutändan resulterar i långsiktiga neurologiska funktionshinder 13,14. Således välja lämpliga djurmodeller av TBI som uppvisar liknande cellulära och molekylära händelserna i mänskligt och gnagare TBI är avgörande för att studera mekanismerna bakom skador och reparation.

Olika experimentella modeller av TBI har utvecklats för att återge aspekter av TBI observerats hos människor, bland dem tre specifika modeller är allmänt anpassade för gnagare: vätska slagverk, kortikala effekt och vikt släppa / påverkan acceleration 1. Vätskan slagverk enheten avger en skada genom en craniectomy genom att tillämpa en kort puls vätsketryck på den intakta dura. Pulsen är skapad av en pendel slående kolven i en reservoar av vätska. Den slagverk producerar korta förskjutning och deformering av nervvävnad 1,15. Omvänt ger kortikala påverkan skada mekanisk energi till intakt dura via ett stela pendeln i pneumatiskt tryck 16,17. Vikten drop / effekt-modellen kännetecknas av hösten ett spö med en viss massa på den stängda skallen 18. Bland TBI modellerna är LFP de mest etablerade och vanligaste modellen för att utvärdera blandade fokala och diffusa hjärnskador 19. Det är reproducerbara och standardiserat för att möjliggöra manipulering av skada parametrar. LFP sammanfattas skador observerats hos människa, vilket gör det kliniskt relevant, och möjliggör utforskande av nya behandlingar för klinisk översättning 20.

Vi beskriver detaljerat protokoll för att utföra LFP förfarande hos möss. Skadan tillfogas är mild till måttlig, med hjärnan regioner som cortex, hippocampus och corpus callosum är mest sårbara. Hippocampus och motor inlärningsuppgifter utforskas följande LFP.

Protocol

1. Craniectomy

  1. En steril operationsområdet är beredd med en stereotaxic anpassning instrument (Kopf Instrument) för möss med en mus gas anestesi huvudet hållare (Kopf Instruments) är ansluten till en anestesiapparaten med O 2 flush (Parkland Scientific) för att möjliggöra kontinuerlig inandning av isofluran under operation . En uppvärmning pad förvaras vid 37 ° C är placerad under musen under operation. En kirurgisk mikroskop och ljuskälla behövs. Försöksledaren ska bära en labbrock, kirurgisk mask, fot täcker, handskar och huvudbonad. Alla verktyg och material som kontaktar operationsområdet bör steriliseras.
  2. En skada nav, som består av kvinnliga slutet av en Luer-lok, skapas genom att skära bort metall slutet av en 20 g 1 ½ "nål (Becton Dickinson) med ett rakblad. Navet ska klippas med en liten bias och har en ca 3 mm innerdiameter öppning. trephine (se steg 1,10) kan användas för att mäta och tillverka en skada navet i rätt diameter. Ett nav krävs per djur. Navet kommer att knytas till skallen och ansluten till LFP anordning för att leverera pulsen på trycket.
  3. Fast nylonlina (1,7 mm i diameter, t.ex. sjögräs trimmerlina) klipps i ~ 1 mm tjock diskar med ett rakblad. Återigen är en skiva krävs per djur. Detta används för att stabilisera trephine samtidigt utför craniectomy (se steg 1,10).
  4. Möss kan vara av vilken stam och ålder (vi huvudsakligen använder C57BL / 6 åldrarna 1 - 9 månader). Musen vägs och bedövas i en liten induktion kammare (förfyllda med 4-5% isofluran i 100% O 2) i minst 1 minut. För förebyggande smärtlindring, är en injektion av buprenorphrine (0,1 mg / kg) givet intraperitonealt och musen placeras tillbaka in i kammaren för en annan minut. Smärtstillande behandlingen skall bekräftas genom samråd med lokala djur-användning och vård kommitté.
  5. Håret på toppen av musen huvud är klippta så nära huden som möjligt. Musen är placerad i ett stereotaxic anpassning instrument utrustade med lagom klädd för att administrera flyktig gas anestesi (Kopf instrument). Nivån på isofluran gasen reduceras till 2% eller att genomföra. Andning övervakas visuellt under operationen. Andra fysiologiska parametrar såsom blodgaser (p O 2, p CO 2), blod pH eller blodtryck kan mätas med lämplig utrustning under förfarandet.
  6. Artificiella tårar smörjmedel ögonsalva läggs på ögonen på musen med hjälp av en bomullstuss applikator för att hålla dem från uttorkning. Povidon-jod appliceras på huden mellan ögonen och hals med en bomullstuss applikator följt av 70% alkohol. Tillämpningen av povidon-jod och alkohol upprepas för totalt 3 gånger.
  7. En mittlinjen hårbotten snitt görs från ögonen till nacken med hjälp av en skalpell (# 15 blad) och huden indragen med en liten bulldog klämmor (Fine Science Tools # 18.050-28) att avslöja skallen och ger en tydlig kirurgiska området. The Bulldog klämmor hänga utanför sidokanter skallen.
  8. Bedövningssalva bupivakain (0,025% i koksaltlösning) appliceras på skallen med en bomullstuss applikator och fascia är skrapas från skallen med spetsen av dentala verktyg eller ben skrapa (t.ex. Fine Science Tools, # 10.075-16).
  9. En permanent markör används för att markera skallen halvvägs mellan bregma och lambda och mellan sagittal suturen och laterala kanten över den högra hjärnhalvan (~ 2 mm höger om mittlinjen). En droppe Loctite cyanoakrylat lim (Loctite Tak Pak 454) läggs i en plast väger båt och sida griptänger (Fine Science Tools, Dumont # 6) används för att doppa en skiva av ogräs fast nylonlina (se 1.3 ovan) i lim och tryck sedan på skivan på märket på skallen. En till två droppar av Loctite Accelerator levereras ovanpå hårddisken med en 1 ml spruta och 26 3 / 8 g nål för att orsaka härdning av lim. Testa anslutning av skivan till skallen innan du fortsätter.
  10. Placera en 3 mm ytterdiameter trephine (Forskning Instrumentering Shop, University of Pennsylvania) över disken och snurra medurs tills du har klippt igenom skallen. Kontrollera trephine framsteg ofta för att undvika att borra för långt in i skallen och att bryta mot dura. Det kommer att bli en gallring av skallen i ytterkanten av skivan och skalle luckan kommer att kännas lös när man trycker lätt på. Placera dentala verktyg parallellt / horisontellt till skallen yta för att bända i skallen och lyfta benet luckan upp. Lossa ben från skallen med pincett. Om det finns en liten blödning, utan kompromisser av duran, använd en bomullstuss applikator att utöva påtryckningar tills blödningen upphör och förhindra ben damm från att komma in på dura. Men om det finns ett hål i duran så att diskbråck är synlig, ska djuret tas bort från experimentet med humana dödshjälp. Detta steg kräver tillräcklig erfarenhetatt uppnå den kirurgiska kompetens som krävs.
  11. Använd pincett, underhålla skadan navet i position över craniectomy i skallen så att partiskhet av navet är i linje med krökning av skallen (dvs. längre kanten på navet ligger nära den laterala kanten av skallen). Under tiden med hjälp av en träpinne, skär i en vinkel med ett rakblad att ha en vass spets, applicera superlim gelé runt ytterkanterna av navet med den andra handen och stabilisera navet tills det sitter upprätt över hålet. Man måste vara försiktig att inte få lim på toppen av dura. Limma på dura kommer att orsaka en dämpning av skadan.
  12. Använd en liten papper kopp, blanda metyl-metakrylat dentala akryl (Jet akryl vätska med Perm reline / Reparation Resin, Butler Schein) för att skapa en viskös lösning. Använd en 1 cc spruta utan nål fäst gäller cement runt skadan nav. Den cement bör täcka botten 2 mm av skadan navet samt den omgivande exponerade skallen. Skallen suturer tätas med cement för att se till att vätskan bolus från den skada som håller sig inom hjärnskålen.
  13. Fyll navet med steril 0,9% NaCl (koksalt) med hjälp av en spruta och trubbiga nålen. Den saltlösning kommer att hålla duran fuktig under återhämtningsfasen. Dessutom, om skadan navet inte stannar fyllda, kommer att tyda på en läcka i navet anslutning till skallen och ett nytt nav bör bifogas. Musen bör ges en 0,25 ml injektion av steril koksaltlösning IP, bort från stereotaxic anpassning instrumentet och placeras i en tom bur med ingen tråd bar lock på en värmeplatta. Placera några hydragel på botten av buren och låt möss att återhämta sig i 1-2 timmar.

2. Induktion av skada

  1. Sätt på oscilloskopet (Tektronix TDS 1001B, två kanaler Digi minnesoscilloskop 40 MHz, 500Ms.s) och förstärkare (Trauma inducer tryckgivare förstärkare) som är ansluten till LFP-enheten. Kontrollera att LFP-enheten (Egen design och tillverkning, Virginia Commonwealth University) och högt tryck slang (längd 41cm, volym 2 ml, Baxter # 2C5643) som är anslutna till det fylls med sterilt vatten och fri från luftbubblor. I slutet av slangen är en manlig Luer-Lok bit. Med Luer-lok änden av slangen stängd leverera testpulser genom att släppa pendeln. Enheten skall förberedas genom att leverera cirka 10 testpulser. Kontrollera att pendeln ger jämn signal på oscilloskopet och förstärkare. En högljudd signal indikerar luft i systemet som måste bort innan leverera skadan puls. Längden på pulsen ska vara ca 20 msek. Givaren förstärkare medföljer LFP enheten är kalibrerad så att 10 mV = 1,0 pounds per kvadrattum (PSI). En atmosfär (ATM) = 14,7 PSI. Skada levererade trycket är normalt i intervallet 0,9 till 2,1 atmosfärer för att producera en rad rätande reflex gånger och en ökad dödlighet i samband med lungödem. Mild skada anses vara en rätande reflex tid av 2 - 4 min och 0 - 5% dödlighet. Måttliga skador anses vara en rätande reflex på 6 - 10 min och en 10 - 20% dödlighet. Om nödvändigt, justera vinkeln på pendeln att öka eller minska intensiteten i puls. Vinkeln på pendelns startposition är cirka 10 grader. Efter justering av LFP-enheten, se till att öppna Luer-Lok änden av slangen.
  2. Musen placeras i 4-5% isoflurananestesi kammare (förladdas) tills en kirurgisk plan av anestesi nås. Musen placeras på en plattform bredvid LFP enheten och navet är fylld med steril koksaltlösning. Slangen av LFP enheten med en manlig Luer-lok är knuten till den kvinnliga luer-lok montering av navet. Djuret har placerats på sin sida och när en normal andning igen mönstret, men innan djuret återfå hela medvetandet (~ 2 min), är pendeln av LFP apparaten släpps för att orsaka en enstaka puls av skada. Det är viktigt att inte framkalla skada medan djuret är för bedövas eftersom det kan leda till andningssvikt och död. Den exakta tryck pulsen bör registreras. Oskadd, bluff djur genomgår alla på samma sätt med undantag av själva vätskan pulsen att framkalla skada.
  3. Djuret bör omedelbart avlägsnas från LFP enheten och placeras på rygg för att övervaka rätande reflex tiden. Efter att musen har rättas till sig själv, är det sedan snabbt sövda igen och cement och navet bort tillsammans från skallen för hand. Hårbotten är då stängd med Vetbond vävnad lim (3M), suturer eller häftklamrar. Alla diskbråck av dura eller ocklusion av navet noteras. En ockluderade nav kommer att producera en försvagad skador av okänd omfattning. Djuret placeras tillbaka i buren på en uppvärmning pad till öppenvård och återvände sedan till sitt hem bur.

3. Bedömning av motoriska, kognitiva och histologiska resultat

  1. Den moTor underskott orsakade av LFP kan bestämmas med hjälp av rotarod test, en indikator på integrerad vestibulomotor och sensomotoriska funktion 21. Alla djur måste testas innan de skada att fastställa en baslinje läsning och att vänja mössen till paradigm. Möss är utbildade på rotarod enhet 3 gånger per dag med 1-timmes intertrial mellanrum under de två dagar före skadan. Latensen att balansera på en 36-mm ytterdiameter, roterande staven, som har en gummiyta mäts. Hastigheten ökar från 4 till 40 rpm under en 180 sek intervall. Varje försök slutar när djuret faller av rotarod.
  2. Vid olika tidpunkter efter skada (vanligtvis 1, 7 och 21 dagar), är de möss åter testats på rotarod enhet. Utvärdering av rotarod test efter skadan baseras på den individuella poäng i förhållande till det ursprungliga latenser 22. Den genomsnittliga latens falla av skadade möss jämfört med de falska möss.
  3. Kognitiv funktion efter LFP kan testas på en separat uppsättning av möss med Morris Water Maze (MWM), ett känsligt mått på posttraumatiskt spatiala inlärning och arbetsminne hos gnagare 23. Möss är acklimatiserade till paradigm och testade för baslinjen svar med hjälp av en synlig plattform testa 4 dagar före skada. En vit rund pool (1 m diameter) är fylld med vatten och giftfri vit färg. Plattformen är synlig med hjälp av en flagga eller markör och inga visuella referenser finns på väggarna. Över 4 studier är musen placeras i kvadrant motsatta som det synliga plattformen och latens för att hitta den plattformen mäts. Maximal försökstiden är 60 sek och musen kvar eller placeras på plattformen i 15 sekunder i slutet av varje prövning. Den intertrial intervallet är 5 minuter under vilken musen värms på en värmedyna. Plattformen flyttas till en annan kvadrant för varje rättegång och fyra försök utförs.
  4. För att bedöma lärande, möss utbildade på MWM med hjälp av en dold plattform fast i en av fyra kvadranter vid olika tidpunkter efter skada (vanligtvis 1, 7 och 21 dagar). Svart och vitt signaler är placerade på väggarna. Den kvadranten där musen är placerad är pseudorandomly varierat under utbildning och tid att hitta plattformen är inspelad. Maximal försökstiden är 60 sek och musen kvar eller placeras på plattformen i 15 sekunder och värmas i 5 min mellan försöken. Möss utsätts för 8 prövningar / dag i 3 dagar i följd. För att bedöma minne lagring, är de djur som utsätts för en 60 sek sond rättegång dagen efter den sista träningen. Under sonden rättegången, är plattformen bort för att bestämma tid och avstånd simmat i kvadranten där plattformen brukade vara. Slutligen är en synlig plattform för test gjort för att utesluta eventuella motoriska och visuella underskott som utvecklats efter skada.
  5. För att bestämma histologiska konsekvenserna av LFP skada är vävnad fastställs av intrakadriell perfusion i 0,9% NaCl följt av 4% paraformaldehyd vid önskad tidpunkt poäng efter skada. Tissue är postfixed över natten vid 4 ° C och sedan cryoprotected i 10% och 30% sackaros och bädda lösning. Frysta seriell sektioner klipps på ett kryostat och bearbetas med hjälp av olika immuohistochemical och histologiska tekniker.

4. Representativa resultat:

Skadan orsakas av LFP-enheten är reproducerbart från djur till djur, särskilt med tillräcklig kirurgisk utbildning. För att behålla konsekvensen av skadan, är det tryck som levereras till dura av enheten övervakas. Pendeln slår en vattenfylld akryl cylinder med högt tryck slang och luer-lok montering som är ansluten till den skada navet anbringas på craniectomy webbplatsen på djuret (Figur 1A). För en mild till måttlig skada, är vinkeln på pendeln inställd på att skapa ett tryck på mellan 0,9 till 2,1 atm och ett oscilloskop kopplas till en förstärkare används för att visualisera trycket puls (Figur 1B). Skada producerar många typer av rätande reflex gånger och en ökad dödlighet i samband med lungödem. Mild skada anses vara en rätande reflex tid av 2 - 4 min och 0 - 5% dödlighet. Måttliga skador anses vara en rätande reflex på 6 - 10 min och en 10 - 20% dödlighet. Dessutom kan möss utsätts för LFP uppvisar tonic poserande som kan vara vägledande för krampanfall. Beslag är ofta förknippat med en komprometterad dura. Tillsammans utgör dessa fynd tyder på att skadan orsakar neurologiska skador. Sham djur är anslutna till LFP enheten men pendeln är inte släppt.

För att visualisera de skador som orsakas av LFP har vi utfört immuncytokemi använda antikroppar som känner igen astrocyter och makrofager som båda celltyper i samband med ett svar på skada. Gliaceller fibrillära Sura protein (GFAP) färgning avslöjar ökat gliosis hela hjärnbarken i regionen skada WHereas bluff möss visas inte ökat astrocytosis på motsvarande plats under craniectomy (Figur 2A, B). Likaså visar Mac1 färgning fler makrofager kring platsen för skadan jämfört med möss som utsätts för bluff kirurgi. Dessutom finns det ofta fysiska skador på hjärnbarken vävnaden syns hos möss utsatta för LFP, men inte i falska möss (Figur 2C, D).

Behavioral testa följande mild LFP kan användas för att bedöma både kognitiva och motoriska resultat. MWM används för att bestämma effekter på inlärning och minne. Använda visuella ledtrådar i test rummet blev bluff möss snabbt effektivare på att hitta plattformen med varje följande dag av träning i vattnet labyrint. Möss utsatts för mild LFP ta längre tid att hitta de dolda plattformen på de första två dagarna av tester i förhållande till falsk möss men sedan verkar lära sig uppgiften av den tredje dagen (Figur 3A). Dessa resultat tyder på att skadan minskar hastigheten med vilken mössen kan få rumsliga lärande. För att bestämma effekten av skada på minne retention är en sond försök utförs en dag efter det sista träningspasset. Sham möss tillbringa mer tid i målet kvadranten jämfört med de möss som utsätts för milda LFP tyder på att skadan har påverkat möjligheten för mössen att komma ihåg platsen där plattformen används för att bosätta sig (figur 3B). För att bedöma rörelseapparaten fungerar, är möss testas på rotarod enhet. Möss utsatts för mild LFP har kortare genomsnittlig latens att falla jämfört med bluff möss vid 1, 7 och 21 dagar efter skada (dpi) (Figur 3C). Dessa data tyder på att skadade möss har nedsatt integrerade vestibulomotor och sensomotoriska funktion.

Figur 1
Figur 1. LFP-enhet och en representant spår av oscilloskopet erhållits under skada. A) Komponenterna i LFP enheten: pendeln fast på ett stativ och ställ in i en vinkel förutbestämt att leverera önskad kraft, en vattenfylld akryl cylinder med högt tryck slang och en hane Luer-lok montering bifogas, en förstärkare, och ett oscilloskop. B) Representativa spår av trycket puls från oscilloskopet. I topp-till-topp värdet är 2,16 volt indikerar ett tryck av 1,47 atm.

Figur 2
Figur 2. Förbättrad gliosis och ett inflammatoriskt svar efter LFP visar omfattningen av skadan. Frysta tvärgående profiler (20 mikroM) genom hjärnan på en mus utsatt för bluff kirurgi (A, C) eller LFP skada (B, D) 7 dagar efter skadan (dpi). Kortikala bilder tas vid epicentrum craniectomy. (A, B) Tissue är färgade med en antikropp för att identifiera astrocyter. Gliaceller fibrillära Sura protein (GFAP) antikropp (MAB360, Chemicon, 1:400) visar ett ökat antal astrocyter hela cortex av musen utsätts för LFP skada (pilar) jämfört med simulerad kirurgi. Sekundär antikropp är get-anti-mus 594 (1:1000). (C. D) Tissue är färgade med en antikropp för att identifiera makrofager. Mac1 antikropp (Mac1-alfa-kedjan CD11b, BD Biosciences, 1:50) avslöjar fler macrophges och / eller aktiverade mikroglia kring platsen för skadan i cortex (pilar) jämfört med simulerad kirurgi. Sekundär antikropp är get anti råtta CY3 (1:50). Skala bar = 200μm i A och B, 100μm i C och D.

Figur 3
Figur 3. Behavioral testa följande milda LFP visar underskott i skadade jämfört med bluff möss. A) Möss utsätts för milda LFP ta längre tid att lära sig uppgiften att hitta plattformen i MWM än bluff möss. Sham vs LFP (AVE sekunder ± SEM) 1 dag 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63, 2 dagar 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11, 3 dagar 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 bluff, 10 LFP) . B) Möss utsatts för mild LFP spendera mindre tid i målet kvadranten under sonden rättegången 24 tim efter sista träning i MWM förhållande till bluff möss (21 dpi, n = 10). C) Möss utsatts för mild LFP ramla av rotarod enheten tidigare än bluff möss (1, 7 och 21 dpi, n = 5 bluff, 8 LFP). Felstaplar representerar SE.

Discussion

Den LFP-metoden som presenteras här modellerna många av de neuropathalogical och beteendemässiga utfall av mild till måttlig traumatisk hjärnskada varför det har blivit en allmänt använd djurmodell av TBI. Det finns flera viktiga steg för att tänka på för att öka validiteten och tillförlitligheten i denna teknik. Till exempel är det viktigt att endast sådana djur där integritet dura inte har äventyrats under craniectomy utsättas för LFP och används i studien. Dessutom, om craniectomy är ockluderade av någon lim eller cement så att en del av dura under craniectomy inte utsätts för kraften i vätsketryck, ska djuret tas bort från studien. Slutligen, om den rätande reflex tid eller dödligheten inte är inom det önskade intervallet, bör djuret inte ingå i studien. Intensiteten av trycket puls kan ökas för att generera mer allvarliga skador.

Som visas i figur 1, är konfigurationen av LFP-enheten relativt enkel och reproducerbarhet av graden av skada upprätthålls genom att övervaka atmosfärer av tryck på oscilloskopet. Den släta formen på kurvan på oscilloskopet spår tyder på att det inte finns några luftbubblor i den vätska som kan störa induktion av LFP skada. Ett test puls ska levereras före framkalla skada och om oscilloskopet spår inte uppvisar en mjuk kurva bör luftbubblor tas bort. Längden på pulsen är ca 20 msek vilket är induktion uppmätta tiden i simuleringar krocktest. Skador av kortare pulser kommer sannolikt att producera mer fokala skador. Därför är denna tid som pulsen modeller mänskliga TBI.

Den morfologiska och cellulära förändringar efter LFP omfattar fysiska skador på vävnaden samt ökat antal astrocyter och makrofager vilket framgår i figur 2. Det är väl etablerat att en av de utmärkande tecknen på skada är hyperplasi i astrocyter och bildandet av en stödjeceller ärr. Den gliaceller ärr har visat sig ha både positiva och negativa effekter 24. Likaså är makrofager ansamlas i olika vävnader under fasen efter skada när den läkande processen börjar 25. Därmed ökade antalet GFAP och Mac1 positiva celler i LFP prover i förhållande till bluff kontroller är ett tecken på induktion av skada. Frånvaro av uttryck av dessa celler specifika markörer i falska kontroller visar att den kirurgiska manipulationer ensamma inte har negativa konsekvenser på hälsan av hjärnvävnad och att förändringarna i proteinuttryck är specifika för skada paradigmet.

Den beteendemässiga konsekvenser av mild LFP illustreras i figur 3 inkluderar kognitiva och motoriska brister. Den MWM Resultaten visar att LFP möss så småningom lära sig uppgiften men i långsammare takt än bluff möss och att de inte minns uppgiften samt en dag efter träningen. Även lindrigt skadade möss är mindre effektiva än de simulerade mus vid med hjälp av externa signaler att bearbeta, befästa och lagra geografisk information, som måste hämtas vid senare tester. Andra hippocampus-beroende kognitiva uppgifter såsom betingad rädsla reaktion har visat sig vara nedsatt hos möss utsatta för LFP 26. Slutligen, för att den kortare latens minska med LFP möss i relation till bluff möss i rotarod paradigm upp till 3 veckor efter lindrig skada är en indikator på brister i integrerad vestibulomotor och sensomotoriska funktion. En mer måttlig skada skulle avslöja mer slående förändringar i kognitiv och motorisk funktion som har visats av andra grupper 27-30.

Sammanfattningsvis är LFP en giltig modell för mänskliga TBI eftersom det uppfyller många av de förväntade kriterierna. LFP ger konstruera giltighet i det att den återskapar den etiologiska processer som leder till TBI hos människor. Specifikt är omfattningen av den kraft och dödlighet som liknar det som förekommer i lindrig och måttlig idrott och bil skador med förbehållet att före skadan kirurgiska ingrepp är unika för djurmodell. LFP uppvisar också möta giltighet i LFP rekapitulerar många av de anatomiska, biokemiska, neuropatologiska och beteendemässiga effekter hos människa TBI. Det finns både fokala och diffusa förändringar upptäcks efter LFP och lateralization av effekten gör att man kan jämföra morfologiska skador på sidan ipsilaterala till skadan för att på den kontralaterala sidan. En varning är att den kognitiva och motoriska effekter kan vara mer subtila som en följd av skada bara en halvklotet. Slutligen uppvisar LFP prediktiv validitet och tillförlitlighet LFP tekniken möjliggör utvärdering av olika farmakologiska och genetiska manipulationer före eller efter induktion av skada 20. Fysiologiska variabler som blodtryck, blod pH och blodgaser måste mätas i närvaro och frånvaro av ett test läkemedel för att fastställa verkningsmekanismen för ett terapeutiskt medel. Men på grund av den komplexa karaktären av de primära och sekundära konsekvenser av TBI, det är en svår uppgift att identifiera ett enda ingrepp som kan mildra alla symtom.

En framtida fråga för LFP teknik kan vara att använda mikro-vätska slagverk som sysselsätter en mikroprocessorstyrd, tryckluftsdrivna verktyg för att eliminera behovet av kalibrering av kraft levereras av pendeln och för att undvika operativa variabler som luftbubblor i vätskan 15 . Däremot har standarden LFP tillvägagångssätt visat av många forskare vara en pålitlig och enkel teknik för att utforska de molekylära mekanismerna bakom skadorna och återhämtning efter TBI som kommer att leda till bättre åtgärder och terapi.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete finansieras av New Jersey kommissionen om Brain Injury Research.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2, 410-422 (2005).
  2. Reilly, P. L. Brain injury: the pathophysiology of the first hours.'Talk and Die revisited'. J Clin Neurosci. 8, 398-403 (2001).
  3. Hovda, D. A. The increase in local cerebral glucose utilization following fluid percussion brain injury is prevented with kynurenic acid and is associated with an increase in calcium. Acta neurochir. 51, 331-333 (1990).
  4. Whiting, M. D., Baranova, A. I., Hamm, R. J. Cognitive Impairment following Traumatic Brain Injury, Animal Models of Cognitive Impairment. CRC Press. (2006).
  5. McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
  6. Adams, J. H. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
  7. Cordobes, F. Post-traumatic diffuse axonal brain injury. Analysis of 78 patients studied with computed tomography. Acta Neurochir. 81, 27-35 (1986).
  8. Maxwell, W. L., Povlishock, J. T., Graham, D. L. A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury: a review. J Neurotrauma. 14, 419-440 (1997).
  9. Lighthall, J. W., Anderson, T. E. The neurobiology of cenral nervous system trauma. 3-12 (1994).
  10. Marcoux, J. Persistent metabolic crisis as measured by elevated cerebral microdialysis lactate-pyruvate ratio predicts chronic frontal lobe brain atrophy after traumatic brain injury. Crit Care Med. 36, 2871-2877 (2008).
  11. McIntosh, T. K. Neuropathological sequelae of traumatic brain injury: relationship to neurochemical and biomechanical mechanisms. Lab Invest. 74, 315-342 (1996).
  12. Morganti-Kossmann, M. C., Satgunaseelan, L., Bye, N., Kossmann, T. Modulation of immune response by head injury. Injury. 38, 1392-1400 (2007).
  13. Capruso, D. X., Levin, H. S. Cognitive impairment following closed head injury. Neurol Clin. 10, 879-893 (1992).
  14. Levin, H. S., Goldstein, F. C., High, W. M., Eisenberg, H. M. Disproportionately severe memory deficit in relation to normal intellectual functioning after closed head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 51, 1294-1301 (1988).
  15. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nat Protoc. 5, 1552-1563 (2010).
  16. Cherian, L., Robertson, C. S., Contant, C. F., Bryan, R. M. Lateral cortical impact injury in rats: cerebrovascular effects of varying depth of cortical deformation and impact velocity. J Neurotrauma. 11, 573-585 (1994).
  17. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39, 253-262 (1991).
  18. Flierl, M. A. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4, 1328-1337 (2009).
  19. Lifshitz, J. Chapter 32. Animal Models of Acute Neurological Injuries. Chen, J., Xu, Z. C., Xu, X. -M., Zhang, J. H. Humana Press. 369-384 (2008).
  20. Thompson, H. J. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. J Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  21. Hamm, R. J., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Lyeth, B. G., Jenkins, L. W. The rotarod test: an evaluation of its effectiveness in assessing motor deficits following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 11, 187-196 (1994).
  22. Scherbel, U. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proc Natl Acad Sci. 96, 8721-8726 (1999).
  23. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  24. Stichel, C. C., Muller, H. W. The CNS lesion scar: new vistas on an old regeneration barrier. Cell Tissue Res. 294, 1-9 (1998).
  25. Brechot, N. Modulation of macrophage activation state protects tissue from necrosis during critical limb ischemia in thrombospondin-1-deficient mice. PLoS One. 3, e3950-e3950 (2008).
  26. Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behav Brain Res. 177, 347-357 (2007).
  27. Thompson, H. J. Cognitive evaluation of traumatically brain-injured rats using serial testing in the Morris water maze. Restor Neurol Neurosci. 24, 109-114 (2006).
  28. Doll, H. Pharyngeal selective brain cooling improves neurofunctional and neurocognitive outcome after fluid percussion brain injury in rats. Journal of neurotrauma. 26, 235-242 (2009).
  29. Fujimoto, S. T. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neuroscience and biobehavioral reviews. 28, 365-378 (2004).
  30. Carbonell, W. S., Maris, D. O., McCall, T., Grady, M. S. Adaptation of the fluid percussion injury model to the mouse. Journal of neurotrauma. 15, 217-229 (1998).

Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics