Yanal Akışkan Perküsyon: Travmatik Beyin Hasarı Farelerde Modeli

Neuroscience
 

Summary

Yanal sıvı perküsyon (LFP), farelerde travmatik beyin hasarı oluşturulmuş bir model olduğunu göstermiştir. LFP hayvan modellerinde üç ana kriterleri yerine getirir: geçerliliği, güvenilirliği ve klinik önemi. Cerrahi kraniotomi oluşan prosedür, hub tespit, fokal ve diffüz yaralanma ile sonuçlanan yaralanma indüksiyonu ile takip açıklanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Travmatik beyin hasarı (TBI), kafa yaralanmaları artan bir farkındalık nedeniyle araştırma elde yenilenen momentum, morbidite ve mortalite ile sonuçlanabilir. Doğa, rejeneratif süreçleri 1,2 takip TBI, karmaşık ve heterojen ikincil sonuçları Sonuç olarak, aşağıdaki birincil yaralanma dayanarak . İlköğretim yaralanma, kafatası kırığı veya beyin kesme ve hareketi 3,4 nedeniyle beyin doku neden deplasman uzanan doğrudan kontüzyon ile indüklenen olabilir . Sonucu hematom ve laserasyon vasküler yanıt 3,5 neden olur ve diffüz aksonal yaralanma 6-8 beyaz madde, morfolojik ve fonksiyonel hasara yol açar. Ek ikincil değişiklikler beyinde yaygın görülen ödem ve artmış intrakranial basınç 9. TBH ardından, sonuçta uzun vadeli nörolojik engelli 13,14 sonucu eksitotoksik nörotransmitterlerin, bağışıklık arabulucular ve oksijen radikalleri 10-12, serbest bırakılmasını içeren biyokimyasal ve fizyolojik yollar mikroskopik değişiklikler vardır . Böylece, uygun insan ve kemirgen TBI bulunan benzer hücresel ve moleküler olayları, yaralanma ve onarım altında yatan mekanizmaları eğitimi için önemli olduğunu TBI hayvan modellerinde seçerek.

Sıvı perküsyon, kortikal etkisi ve ağırlığı damla / etki ivme 1: TBI çeşitli deneysel modeller aralarında üç özel modeller yaygın kemirgenler için uyarlanmış, insanlarda görülen TBI yönlerini yeniden geliştirilmiştir. Sıvı perküsyon cihazı sağlam dura kısa bir sıvı basıncı darbe uygulayarak bir kraniektomi ile bir yaralanma oluşturur. Darbe, sıvı bir rezervuar piston çarpıcı bir sarkaç tarafından oluşturulur. Perküsyon kısa bir deplasman ve sinir doku 1,15 deformasyonu üretir. Tersine, kortikal etki yaralanması, pnömatik basınç 16,17 altında sert bir çarpma ile sağlam dura mekanik enerji sağlar . Ağırlık açılan / etki modeli kapalı kafatası 18 belirli bir kitle ile bir çubuk düşüş ile karakterizedir. TBI modelleri arasında, karışık fokal ve diffüz beyin hasarının 19 LFP değerlendirmek için en köklü ve yaygın olarak kullanılan bir model . Bu tekrarlanabilir ve yaralanma parametreleri manipülasyon için izin standardize edilmiştir. LFP özetlediği yaralanmalar insanlarda gözlenen bu klinik ilgili render ve 20 klinik çeviri roman terapötikler keşfi sağlar.

Biz farelerde LFP yordamı gerçekleştirmek için ayrıntılı protokol açıklar. Işkence ve yaralanma gibi korteks, hipokampus ve korpus kallosum en savunmasız olma gibi beyin bölgeleri ile hafif ve orta şiddette. Hipokampal ve motor öğrenme görevleri LFP aşağıdaki incelenmiştir.

Protocol

1. Kraniektomi

  1. Bir ameliyat sırasında steril cerrahi site izofluran sürekli inhalasyon için izin O 2 floş (Parkland Bilimsel) ile anestezi makinesine bağlı bir fare gaz anestezi kafa tutucu (Kopf Araçlar) fareler için stereotaksik hizalama aracı (Kopf Araçlar) de dahil olmak üzere hazırlanmıştır. . C ameliyat sırasında farenin altına yerleştirilmiş ° ısıtıcı 37 tuttu. Cerrahi mikroskop ve ışık kaynağına ihtiyaç vardır. Deneyci kapsayan bir laboratuvar önlüğü, cerrahi maske, ayak kapsayan, eldiven ve kafa giymeli. Cerrahi alan irtibata tüm alet ve malzemelerin sterilize edilmelidir.
  2. Bir Luer-lok kadın sonunda oluşan bir yaralanma merkezi, bir jilet ile ½ "iğne (Becton Dickinson). Hub hafif bir önyargı ile kesilmiş ve olmalıdır, 20 g 1 metal uç keserek oluşturulur yaklaşık 3 mm iç çapı açılışı var. trefin (1,10 adım) doğru çaplı bir yaralanma merkezi ölçmek ve imal etmek için kullanılan olabilir. Hub Bir hub hayvan başına gereklidir. kafatasına bağlı ve LFP bağlı olacak nabız basıncı sağlamak için bir cihaz.
  3. Katı naylon kord (1.7 mm çapında, örneğin ot düzeltici çizgi) bir jilet kullanarak ~ 1 mm kalınlığında diskler halinde kesilir. Yine, hayvan başına tek bir disk gereklidir. Bu, (bkz. adım 1.10) kraniektomi yaparken trefin stabilize etmek için kullanılır.
  4. Fareler herhangi bir gerginlik ve yaş (- 9 ay öncelikle C57BL / 6 yaşları 1) olabilir. Fare en az 1 dakika için küçük bir indüksiyon odası (% 4-5 izofluran% 100 O 2 ile önceden doldurulmuş) tartılır ve anestezi. Preemptif analjezi için, buprenorphrine bir enjeksiyon (0.1 mg / kg) intraperitoneal olarak verilir ve fareyi bir dakika için odasına geri yerleştirilir. Analjezik rejimi yerel hayvan kullanımı ve bakımı komitesi ile istişare ile teyit edilmelidir.
  5. Farenin başının üstüne saç mümkün olduğunca deriye yakın olarak kesilir. Fare stereotaksik hizalama enstrüman uçucu gaz anestezi (Kopf Araçlar) yönetmek için tasarlanmış ısırık kaplama ile donatılmış bir konuma sahiptir. Isofluran gaz seviyesi% 2 ya da etkisi azalır. Nefes alıp verme hızı ameliyat sırasında görsel olarak takip edilmektedir. Işlem sırasında uygun ekipman kullanarak kan gazları gibi diğer fizyolojik parametreleri (p O 2, CO 2 p), kan pH ya da kan basıncı ölçülebilir.
  6. Suni gözyaşları yağ göz merhemi, gözlerde kuruma onları tutmak için bir pamuk aplikatör kullanarak fare konur. Povidon-iyot,% 70 alkol ile izlenen bir pamuk aplikatör ile gözler ve boyun arasındaki cilde uygulanır. Povidon-iyot ve alkol uygulaması, toplam 3 kez tekrarlanır.
  7. Bir orta hat kesi saçlı deri, kafatası maruz ve net bir cerrahi alan sağlamak için küçük bir bulldog kelepçeler ile retrakte bir neşter (# 15 bıçak) ve deri (Güzel Bilim Araçları # 18.050-28) kullanarak gözleri boyun yapılır. Bulldog kelepçeler kafatasının lateral kenarları kapalı asmak.
  8. Topikal anestezik bupivakain (% 0.025 'i tuzlu su) bir pamuk aplikatör ve fasya diş aracı veya kemik kazıyıcı (örneğin, Güzel Bilim Araçları, # 10.075-16) ucu ile kafatası sıyrılarak kafatası uygulanır.
  9. Kalıcı bir belirteç yarım bregma ve lambda arasında ve sağ hemisfer (~ 2 mm orta hat, sağ) üzerinde sagital sütür ve yanal sırt arasında kafatası işaretlemek için kullanılır. Loctite siyanoakrilat yapıştırıcı (Loctite Tak Pak 454) Bir damla tekne ve yan grasperın (Güzel Bilim Araçlar, Dumont # 6) bir disk içine ot katı naylon kord (yukarıdaki 1.3 'e bakınız) daldırma için kullanılır ağırlığında plastik konur tutkal ve kafatası işareti disk tuşuna basın. Bir iki damla Loctite Hızlandırıcı tutkal sertleştirme neden bir 1ml şırınga ve 26 3 / 8 G iğne kullanarak disk üzerine teslim edilir. Devam etmeden önce kafatası disk testi bağlılık.
  10. Disk üzerinde 3 mm dış çaplı trefin (Araştırma Enstrümantasyon Dükkanı, University of Pennsylvania) yerleştirin ve kafatası kesti kadar saat yönünde döndürün. Trefin ilerleme çok uzak kafatası ve ihlal dura delik önlemek için sık sık kontrol edin. Hafifçe basıldığında kafatasının kafatası flap disk ve çevresinde incelme gevşek bir hissedeceksiniz olacaktır. Kafatasının altında gözetlemek ve kemik flep kaldırmak için diş aracı paralel / kafatası yüzeyinde yatay yerleştirin. Forseps ile kafatası kemik ayırın. Dura ödün vermeden küçük bir kanama miktarı, varsa, kanamayı durdurur ve dura üzerine elde kemik tozu önlemek kadar baskı uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Ancak herniasyonu gibi görünür dura ihlali varsa, hayvan insani ötenazi deneme elimine edilmelidir. Bu adım, yeterli pratik gerektirir.gerekli cerrahi beceri elde etmek için.
  11. Forseps kullanarak hub önyargı kafatası eğriliği (yani hub uzun kenarı kafatası yanal sırt yakınında yer almaktadır) ile uyumlu olduğunu, kafatası kraniektomi üzerinden pozisyonda yaralanma merkezi korumak. Bu arada, tahta bir sopa, sivri uçlu bir jilet ile bir açıyla kesilmiş kullanarak, elinin tersiyle hub dış kenarlarında süper yapıştırıcı jel uygulayın ve göbek deliği üzerinde dik yapıştırılmıştır kadar stabilize. Bakım dura üstüne tutkal almak için alınmalıdır. Tutkal üzerinde dura yaralanma zayıflamasına neden olacaktır.
  12. Küçük bir kağıt bardak kullanarak, viskoz bir çözüm oluşturmak için metil-metakrilat diş akrilik (Perm Reline / Onarım Reçine, Butler Schein Jet Akrilik Sıvı) karıştırın. Yaralanma merkezi etrafında çimento uygulamak için ekli herhangi bir iğne ile 1 cc şırınga kullanın. Çimento yaralanma hub alt 2 mm yanı sıra çevredeki maruz kafatası kapsamalıdır. Kafatası sütür yaralanma sıvı bolus kraniyal kavite içinde kalmasını sağlamak için çimento ile mühürlenir.
  13. Hub bir şırınga ve körletilmeye iğne kullanılarak steril% 0.9 NaCl (serum fizyolojik) ile doldurun. Salin kurtarma aşamasında dura nemli tutmak. Buna ek olarak, yaralanma merkezi dolu kalmaz eğer, kafatası hub bağlantısı bir sızıntı gösterecektir ve yeni bir hub eklenmelidir. Fare stereotaksik hizalama aracı kaldırılır ve bir ısınma plaka üzerinde herhangi bir tel çubuk kapaklı boş bir kafes yerleştirilir steril serum fizyolojik IP 0,25 ml enjeksiyon, verilmelidir. Kafesin alt tarafında bazı hydragel koyun ve fareler 1-2 saat kurtarmak için izin verir.

2. Yaralanma indüksiyonu

  1. LFP cihaza bağlı olan osiloskop (Tektronix TDS 1001B, İki Kanal Digi Depolama Osiloskop 40 MHz, 500Ms.s) ve amplifikatör (Travma indükleyicisi Basınç Transducer Amplifikatör) açın. LFP cihazı (Özel Tasarım ve Üretim, Virginia Commonwealth University) ve buna bağlı yüksek basınç boru (uzunluk 41cm, hacim 2ml, Baxter # 2C5643) steril su ile doldurulur ve hava kabarcıkları serbest olduğunu onaylayın. Boru sonunda bir erkek Luer-lok parça. Boru Luer-lok sonu kapalı, sarkaç serbest test bakliyat sunmak. Cihaz yaklaşık 10 test bakliyat sunarak astarlanmalıdır. Bu sarkaç osiloskop ve amplifikatör pürüzsüz sinyal verir onaylayın. Gürültülü bir sinyal sistemi yaralanma darbe teslim öncesinde sökülmelidir hava gösterir. Darbe süresi yaklaşık 20 milisaniye olmalıdır. LFP cihazı ile birlikte transdüser amplifikatör kalibre, 10 mV = 1,0 inç kare başına pound (PSI). Bir atmosfer (ATM) = 14.7 PSI. Refleks süreleri ve pulmoner ödem ile ilgili giderek artan bir ölüm doğrulan bir dizi üretmek için 2.1 atmosfer - 0.9 aralığında teslim Sakatlık baskıların genellikle. 4 dakika ve 0 -% 5 ölüm oranı Hafif yaralanma 2 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. 10 dakika ve 10 -% 20 ölüm oranı Orta yaralanma 6 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. Gerekirse, darbe yoğunluğunu artırmak veya azaltmak için sarkaç açısını ayarlayın. Sarkaç başlangıç ​​pozisyonuna açı yaklaşık 10 derecedir. LFP cihazı ayarladıktan sonra, boru Luer-Lok ucunu açmak için emin olun.
  2. Fare anestezi cerrahi düzlemine ulaşana kadar% 4-5 izofluran anestezi odası (ön-ücret) yerleştirilir. Fare LFP cihazının yanında bir platform üzerine yerleştirilir ve hub steril tuzlu su ile doldurulur. Hub dişi Luer-lok uydurma bir erkek Luer-lok LFP cihazın tüp takılır. Hayvan yan ve bir kez normal solunum paterni devam eder yerleştirilen ancak tam bilinç (~ 2 dk) kazanmak için önce hayvan, LFP cihazın sarkaç yaralanma tek bir darbe neden yayınlandı. , Solunum yetmezliği ve ölüme neden olabilir hayvan çok anestezi ise hasara yol değil önemlidir. Darbe tam basınç kayıt altına alınmalıdır. Yaralanmamış bir şekilde hasara yol için gerçek bir sıvı darbe dışında, sahte hayvanlar ile aynı usullere tabi.
  3. Hayvan LFP cihaz hemen kaldırılır ve düzeltilmesi refleks zaman izlemek için sırtında yer olmalıdır. Fare kendini doğrultarak sonra, tekrar ardından kısa bir süre anestezi ve çimento ve göbek elle kafatası bir araya kaldırıldı. Kafa derisi sonra Vetbond doku yapıştırıcısı (3M), dikiş ya da zımba ile kapatılır. Herhangi bir hub dura veya oklüzyonu herniasyonu olduğunu kaydetti. Tıkalı bir hub bilinmeyen büyüklükte bir zayıflatılmış yaralanma üretecektir. Sonra ayaktan ve ev kafes döndü kadar hayvan bir ısınma pad üzerinde kafes yerleştirilir.

3. Değerlendirme, motor, bilişsel ve histolojik sonuçlar

  1. MoLFP neden tor açıkları rotarod testi, entegre vestibulomotor ve sensorimotor fonksiyon 21 bir gösterge kullanılarak tespit edilebilir. Bütün hayvanlar bir temel okuma belirlemek ve paradigma farelerin gelmesini yaralanma önce test edilmelidir. Fareler yaralanma öncesinde iki gün boyunca 1 saat intertrial aralıklarla günde 3 kere rotarod cihaz eğitilmiştir. Lastik bir yüzeye sahip bir 36 mm dış çapı, döner çubuk, dengelemek için gecikme ölçülür. Hızı 4-40 rpm 180 sn aralığında artar. Hayvan rotarod düştüğünde her deneme sona erer.
  2. Hasarı (genellikle 1, 7 ve 21 gün) aşağıdaki farklı zaman noktalarında, fareler tekrar rotarod cihaz üzerinde test edilmiştir. Yaralanma sonrası rotarod testlerin değerlendirilmesi başlangıçtaki gecikmeleri 22 göre bireysel puanları dayanmaktadır. Yaralı farelerin düşmesi ortalama gecikme sahte fareler karşılaştırılır.
  3. Bilişsel fonksiyonu aşağıdaki LFP Morris Su Labirent (MWM), kemirgenler 23 posttravmatik uzamsal öğrenme ve çalışma belleği hassas bir ölçü kullanarak farelerde ayrı bir set test edilebilir. Fare paradigma acclimated ve temel yanıt için 4 gün önce yaralanma görülebilir bir platform testi kullanılarak test edilmektedir. Beyaz yuvarlak yüzme havuzu (1 m çap), su ve toksik olmayan beyaz boya ile doldurulur. Platformu duvarlarda bir bayrak ya da marker ve hiçbir görsel ipuçlarını kullanarak görünür hale getirilir. 4 çalışma içinde, fare görünür platformunun karşısında kadranda yerleştirilir ve platform bulmak için gecikme ölçülür. Maksimum deneme süresi 60 sn ve fare kalır ya da her deneme sonunda 15 saniye için bir platform üzerine yerleştirilmiştir. Intertrial aralığı fare bir ısıtma yastığı ısınması sırasında 5 dakika. Platform, her deneme için farklı bir kadranda taşınır ve dört çalışma yapılmaktadır.
  4. Öğrenmelerini değerlendirmek için, fareler yaralanma (genellikle 1, 7 ve 21 gün) sonra, çeşitli zaman noktalarında 4 kadranın bir sabit gizli bir platformu kullanarak MWM eğitilmiştir. Siyah ve beyaz ipuçları duvarlara yerleştirilir. Fare konduğu kadranda pseudorandomly platform kaydedilir bulmak için eğitim süresi boyunca çok çeşitlidir. Maksimum deneme süresi 60 sn ve fare kalır ya da 15 saniye için bir platform üzerine yerleştirilen ve çalışmalar arasındaki 5 dakika süreyle ısıtılır. Fare, 3 gün üst üste 8 deneme / gün 'e tabi tutulur. Hafıza tutma değerlendirmek için, hayvanların son eğitimini takiben gün 60 sn probu yargılanma tabi tutulur. Prob deneme sırasında, platform zaman geçirdim ve platform olarak kullanılan kadranda mesafe yapılırsa yapılsın belirlemek için kaldırılır. Son olarak, gözle görülür bir platform testi mümkün motor ve zarar sonrası gelişen görme kusuru ekarte etmek için yapılır.
  5. LFP yaralanma histolojik sonuçları belirlemek için, doku NaCl,% 4, yaralanma sonrası istenilen zaman noktalarında paraformaldehid takip% 0.9 intrakardiyak perfüzyon ile sabittir. Doku 4 geceleme postfixed ° C ve daha sonra% 10 ve% 30 sukroz ve gömme çözüm cryoprotected. Dondurulmuş seri bir Kriyostat bölümleri kesilerek ve çeşitli immuohistochemical ve histolojik teknikler kullanarak işlenir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

LFP cihaz tarafından uyarılan yaralanma yeterli cerrahi eğitimi ile, özellikle hayvandan hayvana tekrarlanabilir. Yaralanma tutarlılığı sağlamak için, cihaz tarafından dura teslim basınç miktarı izlenir. Sarkaç hayvan kraniektomi sitesi (Şekil 1A) yapıştırılmış yaralanma hub'a bağlı olan yüksek basınçlı boru ve Luer-lok uydurma bir su dolu akrilik silindir vurur. 2.1 atm ve bir amplifikatöre bağlı bir osiloskop basınç darbesi (Şekil 1B) görselleştirmek için kullanılır - orta hafif bir yaralanma, sarkacın açısı 0.9 arasında değişen bir basınç oluşturmak için ayarlanır. Sakatlık refleks süreleri ve pulmoner ödem ile ilgili giderek artan bir ölüm doğrulan bir dizi üretir. 4 dakika ve 0 -% 5 ölüm oranı Hafif yaralanma 2 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. 10 dakika ve 10 -% 20 ölüm oranı Orta yaralanma 6 düzeltilmesi refleks süresi olarak kabul edilmektedir. Ayrıca, LFP tabi fareler nöbet göstergesi olabilir tonik tavır gösterebilir. Nöbet genellikle bir tehlikeye dura ile ilişkilidir. Birlikte, bu bulgular, yaralanma nörolojik hasara neden olduğunu düşündürmektedir. Şam hayvanlar LFP cihaza bağlı olan ancak sarkaç serbest bırakılmaz.

LFP tarafından uyarılan hasar görselleştirmek için, biz bir yanıt yaralanma ile ilişkili hücre tiplerinin her ikisi de makrofajlar farkındayız astrositler ve antikorlar kullanarak immünsitokimya gerçekleştirdik. Glial fibriller asidik protein (GFAP) boyama bölgede yaralanma wh korteks boyunca artış gliozis ortaya koymaktadırereas sahte fareler kraniektomi altında eşdeğer bir site (Şekil 2A, B) artış astrocytosis görüntülenmez . Benzer şekilde, MAC1 boyama yaralanma site çevreleyen sham maruz farelere kıyasla daha fazla makrofaj göstermektedir. Buna ek olarak, sık sık kortikal doku değil, sahte farelerde (Şekil 2C ve D) olarak LFP maruz kalan farelerde görünür fiziksel hasar var.

Hafif LFP sonrası davranış testi hem de bilişsel ve motor sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. MWM öğrenme ve hafıza üzerine etkilerini belirlemek için kullanılır. Test odası görsel ipuçlarını kullanarak, sahte fareler, sonraki her gün su labirenti eğitim platformu yerini hızla daha verimli oldu. Fare hafif LFP tabi ama sonra üçüncü gün (Şekil 3A) görev öğrenmek için sahte farelere göre test ilk iki gün gizli bir platform bulmak için uzun sürer . Bu bulgular, yaralanma farelerin mekansal öğrenme edinebilirler oranını azalttığını göstermektedir. Hafıza tutma yaralanma etkisini belirlemek için, bir sonda deneme son antrenmandan sonra 1 gün yapılır. Şam fareler hedef kadranda hafif LFP yaralanma platform ikamet için kullanılır (Şekil 3B) konumunu hatırlamak için farelerin yeteneği etkiledi tabi farelere göre daha fazla zaman geçirirler. Lokomotor fonksiyonunu değerlendirmek için, fare rotarod cihaz üzerinde test edilmektedir. Hafif LFP maruz Fareler, 1, 7 ve 21 gün yaralanma (dpi) (Şekil 3C) sahte farelere kıyasla düşmeye kısa ortalama gecikme var . Bu veriler, yaralı fareler entegre vestibulomotor ve sensorimotor fonksiyon engelli olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1 LFP cihaz ve yaralanma sırasında elde edilen osiloskop bir temsilci iz. A) LFP cihazın bileşenleri şunlardır: sarkaç, istenilen güç, yüksek basınçlı boru ve bağlı bir erkek Luer-lok uydurma, bir amplifikatör ile akrilik silindir dolu bir su sağlamak için önceden belirlenmiş bir açıyla bir stand ve set sabit ve osiloskop. B) basıncı nabız osiloskop Temsilcisi iz. Peak-tepe değeri 1.47 atm basınç gösteren 2.16 volttur.

Şekil 2
Şekil 2 LFP aşağıdaki Gelişmiş gliozis ve inflamatuar bir yanıt yaralanma ölçüde göstermektedir. Sham (A, C) veya LFP yaralanma (B, D) 7 gün yaralanma (dpi) tabi bir fare beyin aracılığıyla Dondurulmuş enine bölümler (20μm). Kortikal görüntüleri kraniektomi merkez üssü alınır. (A, B) Doku astrositler tanımlamak için bir antikor ile boyandı. Glial fibriller asidik protein (GFAP) antikoru (MAB360, Chemicon, 1:400) sham göre LFP yaralanma (oklar) tabi fare korteks boyunca daha yüksek bir sayıda astrositler ortaya koymaktadır. İkincil antikor keçi anti-fare 594 (1:1000). (C D) Doku makrofajlar tanımlamak için bir antikor ile boyandı. MAC1 antikor (MAC1-alfa zinciri CD11b, BD Biosciences, 1:50) sham göre, etrafında daha fazla macrophges ve / veya aktif mikroglia korteks (oklar) yaralanma site ortaya koymaktadır. İkincil antikor keçi anti sıçan CY3 (1:50). C ve D, A ve B, 100μm Ölçek çubuğu = 200μm

Şekil 3
Şekil 3 hafif LFP aşağıdaki Davranış test, sahte farelere göre yaralı eksiklikler göstermektedir . A) hafif LFP tabi Fareler sahte farelere göre daha MWM platformu bulma görevi öğrenmek için daha uzun sürebilir. Şam vs LFP (ave saniye ± SEM) 1 gün 34.21 ± 3.02 vs 38,64 ± 2.63, 2. gün 24.52 ± 2.84 vs 27.21 ± 2.11, 3 gün 22,47 ± 2.00 vs 22.08 ± 2.52 (1 dpi, n = 9 sahte, 10 LFP) . B) hafif LFP tabi Fareler MWM akrabası sahte fareler (21 dpi, n = 10) en son eğitim sırasında hedef kadranda sonra prob deneme 24 saat daha az zaman harcar. C) hafif LFP maruz Fare rotarod cihaz er düşmenize sahte farelere göre (1, 7, ve 21 dpi, n = 5 sahte, 8 LFP). Hata çubukları GD temsil eder.

Discussion

LFP yöntemi burada sunulan neuropathalogical ve davranışsal sonuçların birçok model hafif ve orta derecede travmatik beyin hasarı TBI yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli haline gelmiştir. Bu tekniğin geçerliliği ve güvenilirliği artırmak için göz önünde bulundurulması gereken pek çok kritik adımlar vardır. Örneğin, sadece dura bütünlüğünü kraniektomi sırasında aşıldığını olan hayvanların LFP tabi tutulur ve çalışmada kullanılan olması önemlidir. Ayrıca, herhangi bir yapıştırıcı veya çimento kraniektomi tarafından tıkalı ise kraniektomi altında dura o kısmı sıvı basınç kuvveti maruz değildir, hayvan çalışma giderilmelidir. Son olarak, düzeltilmesi refleks zaman ya da ölüm oranı istenilen aralık içinde değilse, hayvan çalışmaya dahil edilmemelidir. Daha ciddi yaralanmalar oluşturmak için basınç darbe yoğunluğu artırılabilir.

Şekil 1'de gösterildiği gibi, LFP cihazın konfigürasyonu nispeten basit ve yaralanma derecesine tekrarlanabilirlik osiloskop atmosfer basınç izlenmesi tarafından yapılmaktadır. Osiloskop iz eğrinin düzgün şekil LFP yaralanma indüksiyon etkileyebilir sıvı içinde herhangi bir hava kabarcığı olduğunu gösterir. Bir test darbe yaralanma inducing önce teslim edilmesi ve osiloskop izleme pürüzsüz bir eğri sergi değilse, hava kabarcıkları çıkarılmalıdır. Darbe süresi çarpışma testi simülasyonları ölçülen indüksiyon süresi temsil eden yaklaşık 20 msn. Kısa bakliyat Yaralanmaları daha odak yaralanmalar üretmek için muhtemeldir. TBI Bu nedenle, darbe modelleri bu süre insan.

LFP aşağıdaki morfolojik ve hücresel değişiklikler, doku gibi, Şekil 2'de gösterildiği gibi astrositler ve makrofajların artan sayıda fiziksel hasar. Astrositler hiperplazi ve glial skar oluşumu, yaralanma damgasını belirtileri biri olduğunu kanıtlamıştır. Glial skar, yararlı ve zararlı etkileri 24 olduğu gösterilmiştir . Benzer şekilde, makrofajlar iyileşme süreci 25 başladığında faz aşağıdaki yaralanma sırasında çeşitli dokularda birikmesine bilinmektedir . Böylece sahte kontrollere göre LFP örnekleri GFAP ve MAC1 pozitif hücrelerin sayısının artmasına yaralanma indüksiyon göstergesidir. Sahte kontrollerde bu hücre spesifik belirteçler ifade eksikliği, tek başına cerrahi manipülasyonlar beyin dokusu sağlığı üzerinde olumsuz sonuçları ve protein ekspresyonu değişiklikleri yaralanma paradigmasına özgü olmadığını gösterir.

Şekil 3'te gösterildiği hafif LFP davranışsal sonuçları, bilişsel ve motor açıkları içerir. MWM bulgular LFP fareler sonunda sahte farelere göre daha yavaş bir hızda ancak görev öğrenmek ve eğitimden sonra iyi bir gün olarak görev hatırlamıyorum göstermektedir. Böylece, hatta hafif yaralandı fareler sonraki test sırasında alınmalıdır mekansal bilgi, süreci güçlendirmek ve saklamak için harici ipuçlarını kullanarak sahte farelere göre daha az verimlidir. Klimalı korku tepkisi olarak hipokampal bağımlı bilişsel görevler LFP 26 maruz kalan farelerde engelli olduğu gösterilmiştir . Son olarak, kısa bir gecikme hafif yaralanmasını takiben 3 hafta kadar rotarod paradigma sahte farelere göre LFP fareler tarafından düşmeye entegre vestibulomotor ve sensorimotor fonksiyonu açıklarının bir göstergesi. Daha ılımlı bir yaralanma, diğer gruplar 27-30 tarafından kanıtlanmıştır gibi bilişsel ve motor fonksiyon daha çarpıcı değişiklikler ortaya.

Beklenen kriterlerin çoğunu karşılar çünkü Özetle, LFP, insan TBI için geçerli bir model. LFP yapı geçerliliğini sağlar insanlarda TBI neden etiyolojik süreçleri yeniden oluşturur. Özellikle, kuvvet ve ölüm oranlarının büyüklüğü, yaralanma öncesi cerrahi müdahaleler hayvan modeli için benzersiz olduğunu ihtar ile hafif ve orta derecede spor ve araba ile ilgili yaralanmalar meydana geldiği benzer. LFP yüz geçerliliği de birçok insan TBI gözlenen anatomik, biyokimyasal, nöropatolojik ve davranışsal etkileri olduğu LFP özetlediği sergiler. Fokal ve diffüz LFP sonra tespit edilen değişiklikler ve etkisi lateralizasyonu bir tarafta, karşı tarafta bu yaralanma ipsilateral morfolojik hasar karşılaştırmanıza olanak sağlar vardır. Bir yetersizlik, bilişsel ve motor etkileri sadece tek yarımkürede yaralandı bir sonucu olarak daha ince olabilir. Son olarak, LFP prediktif geçerliliğini sergiler ve LFP tekniğin güvenilirliği yaralanma 20 indüksiyon öncesinde veya sonrasında çeşitli farmakolojik ve genetik manipülasyon değerlendirilmesini sağlar. Kan basıncı, kan pH ve kan gibi fizyolojik değişkenlergazlar, tedavi edici bir ajan etki mekanizması belirlemek için bir test ilacın varlığı ve yokluğu olarak ölçülen gerekecektir. Ancak, TBI birincil ve ikincil sonuçları karmaşık doğası nedeniyle, tüm belirtileri azaltabilir tek bir müdahale tespit etmek zor bir iştir.

LFP tekniği Bir ​​gelecekteki göz sıvısı 15 sarkaç tarafından teslim kuvvet kalibrasyon gereksinimini ortadan kaldırmak için ve hava kabarcıkları gibi operasyonel değişkenler önlemek için bir mikroişlemci kontrollü, pnömatik tahrikli araç istihdam, mikro-sıvı perküsyon kullanımı olabilir . Ancak, standart LFP yaklaşımı daha iyi müdahaleler ve tedavi için yol açacaktır TBI aşağıdaki hasar ve kurtarma altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmek için basit ve güvenilir bir teknik olduğu birçok araştırmacı tarafından kanıtlanmıştır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, Beyin Hasarı Araştırma New Jersey Komisyonu tarafından finanse edilmektedir.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2, 410-422 (2005).
  2. Reilly, P. L. Brain injury: the pathophysiology of the first hours.'Talk and Die revisited'. J Clin Neurosci. 8, 398-403 (2001).
  3. Hovda, D. A. The increase in local cerebral glucose utilization following fluid percussion brain injury is prevented with kynurenic acid and is associated with an increase in calcium. Acta neurochir. 51, 331-333 (1990).
  4. Whiting, M. D., Baranova, A. I., Hamm, R. J. Cognitive Impairment following Traumatic Brain Injury, Animal Models of Cognitive Impairment. CRC Press. (2006).
  5. McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
  6. Adams, J. H. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
  7. Cordobes, F. Post-traumatic diffuse axonal brain injury. Analysis of 78 patients studied with computed tomography. Acta Neurochir. 81, 27-35 (1986).
  8. Maxwell, W. L., Povlishock, J. T., Graham, D. L. A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury: a review. J Neurotrauma. 14, 419-440 (1997).
  9. Lighthall, J. W., Anderson, T. E. The neurobiology of cenral nervous system trauma. 3-12 (1994).
  10. Marcoux, J. Persistent metabolic crisis as measured by elevated cerebral microdialysis lactate-pyruvate ratio predicts chronic frontal lobe brain atrophy after traumatic brain injury. Crit Care Med. 36, 2871-2877 (2008).
  11. McIntosh, T. K. Neuropathological sequelae of traumatic brain injury: relationship to neurochemical and biomechanical mechanisms. Lab Invest. 74, 315-342 (1996).
  12. Morganti-Kossmann, M. C., Satgunaseelan, L., Bye, N., Kossmann, T. Modulation of immune response by head injury. Injury. 38, 1392-1400 (2007).
  13. Capruso, D. X., Levin, H. S. Cognitive impairment following closed head injury. Neurol Clin. 10, 879-893 (1992).
  14. Levin, H. S., Goldstein, F. C., High, W. M., Eisenberg, H. M. Disproportionately severe memory deficit in relation to normal intellectual functioning after closed head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 51, 1294-1301 (1988).
  15. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nat Protoc. 5, 1552-1563 (2010).
  16. Cherian, L., Robertson, C. S., Contant, C. F., Bryan, R. M. Lateral cortical impact injury in rats: cerebrovascular effects of varying depth of cortical deformation and impact velocity. J Neurotrauma. 11, 573-585 (1994).
  17. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39, 253-262 (1991).
  18. Flierl, M. A. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4, 1328-1337 (2009).
  19. Lifshitz, J. Chapter 32. Animal Models of Acute Neurological Injuries. Chen, J., Xu, Z. C., Xu, X. -M., Zhang, J. H. Humana Press. 369-384 (2008).
  20. Thompson, H. J. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. J Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  21. Hamm, R. J., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Lyeth, B. G., Jenkins, L. W. The rotarod test: an evaluation of its effectiveness in assessing motor deficits following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 11, 187-196 (1994).
  22. Scherbel, U. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proc Natl Acad Sci. 96, 8721-8726 (1999).
  23. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  24. Stichel, C. C., Muller, H. W. The CNS lesion scar: new vistas on an old regeneration barrier. Cell Tissue Res. 294, 1-9 (1998).
  25. Brechot, N. Modulation of macrophage activation state protects tissue from necrosis during critical limb ischemia in thrombospondin-1-deficient mice. PLoS One. 3, e3950-e3950 (2008).
  26. Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behav Brain Res. 177, 347-357 (2007).
  27. Thompson, H. J. Cognitive evaluation of traumatically brain-injured rats using serial testing in the Morris water maze. Restor Neurol Neurosci. 24, 109-114 (2006).
  28. Doll, H. Pharyngeal selective brain cooling improves neurofunctional and neurocognitive outcome after fluid percussion brain injury in rats. Journal of neurotrauma. 26, 235-242 (2009).
  29. Fujimoto, S. T. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neuroscience and biobehavioral reviews. 28, 365-378 (2004).
  30. Carbonell, W. S., Maris, D. O., McCall, T., Grady, M. S. Adaptation of the fluid percussion injury model to the mouse. Journal of neurotrauma. 15, 217-229 (1998).

Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics