مختبر تقنيات العقيم: طرق تصفيح

Published 5/11/2012
2 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

عند العمل مع وسائل الإعلام والكواشف المستخدمة في الكائنات الحية الدقيقة الثقافة، يجب أن تمارس أسلوب العقيم لضمان أن يتم التقليل من التلوث. وتستخدم بشكل روتيني مجموعة متنوعة من الأساليب لعزل الطلاء، نشر، أو البكتيريا تعداد وبالعاثية، والتي تتضمن الإجراءات التي تحافظ على عقم المواد التجريبية.

Cite this Article

Copy Citation

Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064, doi:10.3791/3064 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الكائنات الدقيقة موجودة على كل الأسطح الجامدة خلق مصادر التلوث في كل مكان ممكن في المختبر. النجاح يعتمد على التجارب قدرة لتعقيم الأسطح عالم العمل والمعدات، فضلا عن منع الاتصال من الأدوات المعقمة والحلول مع الأسطح غير معقمة. هنا نقدم الخطوات لأساليب الطلاء عدة تستخدم بشكل روتيني في المختبر لعزل، نشر، أو الكائنات الحية الدقيقة تعداد مثل البكتيريا وبالعاثية. جميع الطرق الخمسة دمج تقنية العقيم، أو الإجراءات التي تحافظ على عقم المواد التجريبية. وتشمل الإجراءات المذكورة (1) خط الطلاء الثقافات البكتيرية لعزل المستعمرات واحد، (2) صب الطلاء و (3) انتشار الطلاء تعداد المستعمرات البكتيرية قابلة للحياة، (4) لينة التراكبات أجار لعزل بالعاثية و لويحات تعداد، و( 5) طبق الطلاء لنقل الخلايا من لوحة واحدة إلى آخر في نمط والمكاني متطابقة. لا يمكن أن يؤديها في هذه الإجراءات رشريطة أن مقاعد البدلاء المختبر، أنها تنطوي على غير المسببة للأمراض سلالات من الكائنات الحية الدقيقة (السلامة الأحيائية المستوى 1، BSL-1). إذا كان يعمل مع BSL-2 الكائنات، ثم يجب أن تكون هذه المناورات تجري في خزانة السلامة الأحيائية. الرجوع إلى الطبعة الأحدث من السلامة في المختبرات الميكروبيولوجية والطبية الحيوية (BMBL)، وكذلك صفائح بيانات سلامة المواد (MSDS) بالنسبة للمواد المعدية لتحديد تصنيف بيولوجية فضلا عن احتياطات السلامة والتسهيلات اللازمة لاحتواء الكائن الدقيق في السؤال. ويمكن الحصول على سلالات بكتيرية والأرصدة بالعاثية من المحققين البحوث والشركات والمجموعات التي تحتفظ بها منظمات معينة مثل مجموعة نوع الثقافة الأمريكية (ATCC). فمن المستحسن أن يتم استخدام سلالات غير ممرضة عندما تعلم أساليب الطلاء المختلفة. عن طريق اتباع الإجراءات المذكورة في هذا البروتوكول، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:

  • إجراء عمليات الطلاء دون contaminatiوسائل الإعلام نانوغرام.
  • عزل المستعمرات البكتيرية واحدة من خلال طريقة خط الطلاء.
  • استخدام أساليب صب الطلاء والطلاء انتشار لتحديد تركيز البكتيريا.
  • أداء تراكب أجار لينة عند العمل مع بالعاثية.
  • نقل الخلايا البكتيرية من لوح واحد إلى آخر باستخدام الإجراء طبق الطلاء.
  • نظرا مهمة تجريبية، حدد طريقة الطلاء المناسب.

Protocol

1. إعداد مساحة عمل آمنة ومعقمة

  1. أن يكون على دراية جميع القواعد المختبرات واحتياطات السلامة التي يجب اتخاذها عند التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة. بغض النظر عن تصنيف اقية، وتعتبر جميع المواد التي تأتي في اتصال مع الكائنات الدقيقة النفايات المعدية ويجب تطهير قبل التخلص منها. اتبع إرشادات السلامة وفقا لتلك المقدمة من الصحة البيئية المؤسسية والإدارات السلامة، وإنشاء أوعية النفايات المناسبة للتخلص منها فورا والسليم للمواد يحتمل أن تكون ملوثة (مخاطر بيولوجية).
  2. تعقيم جميع الأدوات والحلول، ووسائل الإعلام قبل استخدامها لإجراءات الطلاء.
  3. ازالة جميع المواد التبعثر مجال عملك على مقاعد البدلاء المختبر.
  4. تنظيف منطقة العمل مع مطهر للتقليل من تلوث ممكن.
  5. إعداد الموقد بنسن والعمل ببطء، بعناية، وبشكل متعمد داخل منطقة المجال المعقم التي أنشأتها updraقدم من اللهب.
    • إذا كان يعمل مع BSL-2 الكائنات الحية، على مساحة العمل الخاصة بك في خزانة السلامة الأحيائية. لا يمكن أن تستخدم موقد بنزن داخل مجلس الوزراء لأن الحرارة من اللهب يعطل تدفق الهواء إلى وظائفه الأساسية.
  6. ترتيب جميع المستلزمات اللازمة لإجراء على مقاعد البدلاء المختبر بالقرب من حقل معقمة. تأكد بشكل صحيح وصفت جميع المواد. وتنظيم منطقة العمل لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة في العمل وتجنب التحركات غير الضرورية تقليل زمن التعرض للمواد التجريبية للملوثات المحمولة جوا.
    • وضع الموقد بنسن لحقك على مقاعد البدلاء.
    • لوحات أجار مكان أو أطباق بتري إلى يسارك.
    • ترتيب مزارع الخلايا، وأنابيب وقوارير وزجاجات في وسط مقاعد البدلاء.
    • تخفيف من قبعات القوارير وأنابيب وزجاجات بحيث يمكن بسهولة فتحوا بيد واحدة خلال التلاعب اللاحقة.
  7. غسل اليدين جيدا بالصابون المطهر ودافئةالماء قبل التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة.

2. خط الإجراءات اللوحة: عزل المستعمرات البكتيرية باستخدام أسلوب كوادرانت

تم تصميم إجراء مسحة لوحة لعزل الثقافات نقية من البكتيريا، أو مستعمرات، المختلطة السكان من قبل فصل الميكانيكية البسيطة. وتتكون مستعمرات واحدة من ملايين الخلايا تنمو في الكتلة على أو داخل لوحة أجار (الشكل 1). A مستعمرة، على عكس خلية واحدة، يمكن رؤيته بالعين المجردة. من الناحية النظرية، وتستمد جميع الخلايا في مستعمرة بكتيريا واحدة من إيداع في البداية على لوحة، وبالتالي ويشار إلى استنساخ، أو مجموعة من الخلايا متطابقة وراثيا.

  • البكتيريا موجودة في مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام. على سبيل المثال، الفرد خلايا الإشريكية القولونية هي على شكل قضيب مع متوسط ​​طول من 2 ميكرون وعرض من 0.5 ميكرومتر في حين أن الخلايا العقدية هي كروية ذات قطر متوسط ​​من 1 ميكرون. بعض أنواع البكتيريا (سوكما CH E. كولاي) وجود خلايا واحدة في حين أن آخرين تشكيل أنماط متميزة من الجمعيات. العقدية، على سبيل المثال، وتنمو في أزواج أو سلاسل أو شكل مجموعات من الخلايا. ويفترض عموما أن مستعمرة واحدة تنشأ من خلية واحدة تمر الانشطار الثنائي، ولكن هذا الافتراض ليس صحيحا بالنسبة لهذه البكتيريا الموجودة بشكل طبيعي وسلاسل، أزواج، أو مجموعات أو أن القسمة على آليات أخرى. قد بدلا من ذلك، إذا عدد كبير جدا من البكتيريا مطلي، ثم تتداخل تحدث للخلايا وزيادة احتمال من اثنين أو أكثر البكتيريا مما يؤدي إلى ما يبدو أنه مستعمرة واحدة. لتجنب هذه المضاعفات عند وصف أو سرد الثقافات البكتيرية المتزايد على وسيط الصلبة، ويشار إلى المستعمرات مستعمرة تشكيل وحدات (كفو).

للإجراء مسحة لوحة، وينتشر خليط من الخلايا على سطح وسيلة شبه صلبة أجار القائم والمغذيات في طبق بتري بحيث أقل وأقل البكتيريةتودع الخلايا في نقاط متباعدة على سطح المتوسطة، وبعد الحضانة، تتطور إلى المستعمرات. وسيتم وصف طريقة لعزل المستعمرات رباعي واحد من خليط من الخلايا هنا.

  1. ويمكن تحقيق خط الطلاء مع عدد من الأدوات المختلفة (الشكل 2). يمكن أن يكون حلقة معدنية إعادة استخدامها عدة مرات ويستخدم لطلاء خط سلالات المخبرية الروتينية. الحلقات البلاستيكية متوفرة تجاريا وتستخدم أكثر شيوعا عند العمل مع BSL-2 سلالات في خزانة السلامة الأحيائية. العلماء يفضلون استخدام العديد من الأبحاث، قبل تعقيمها التخلص منها العصي الخشبية أو المسواك شقة للخط الطلاء. هذه هي بديل غير مكلفة لحلقات البلاستيكية ويمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عند العمل مع عينة بيئية مثل التربة التي تحتوي على الأرجح بوغ تشكيل البكتيريا.
    • ليس من الضروري التخلص منها مسبقا تعقيم العصي والمسواك أن ملتهب مع الموقد بنسن خميسق منع هباء لا لزوم لها من بوغ تشكيل البكتيريا وعبر تلوث الأسطح المختبر أو لوحات أجار مع جراثيم.
  2. التسمية حول حافة الجزء السفلي (وليس غطاء) من لوحة أجار مع اسمك على الأقل، من تاريخ، ونوع من النمو المتوسط، ونوع الكائن الحي إلى أن مطلي على المتوسط.
    • يجب أن تكون لوحات جافة تماما دون التكثيف على الغطاء وقبل تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة قبل خط الطلاء. إذا تم تخزين لوحات في C ° 4، إزالتها أو حتى عدة ساعات في اليوم السابق. تنتشر بها في أكوام صغيرة لا تحمل لوحات متداخلة من أكثر من 2-3 والسماح لهم الجافة.
  3. يمكن أن العينة التي سيتم تلقيح متتالية لوحة تكون إما تعليق من الخلايا في مرق أو مستعمرة موجودة من آخر لوحة أجار. لتبدأ، فمن المستحسن أن يتم استخدام عينة واحدة فقط لتطعيم لوحة واحدة. لتوفير الوقت والمواد، ويمكن استخدام لوحة واحدة لعصيدة متعددةولكن مرة واحدة فقط ليه كنت في إتقان streaking عينة واحدة على طبق من ذهب.
  4. لرباعي الأولى، يتم اختيار عينة صعودا وموزعة على حوالي ربع سطح المتوسطة باستخدام، على نحو سلس السريع، ذهابا وإيابا الحركة (لوحة A من الشكل 3). رفع النصف السفلي من لوحة مقلوب من على مقاعد البدلاء. نقل حلقة، والعصا، أو مسواك ذهابا وإيابا عدة مرات عبر السطح آغار من حافة إلى وسط اللوحة.
    • إذا كان اللقاح هو تعليق الخلية، الحصول على ملء غانة مع حلقة معدنية أو 5 حتي 10 ميكرولتر مع micropipettor تأكد من دوامة دوامة أو تعليق الخلية قبل إزالة الطلاء على قسامة ل. استخدام تقنية العقيم أثناء تنفيذ هذه الخطوة، المشتعلة ليس فقط ولكن أيضا حلقة حافة الزجاجة أو أنبوب قبل وبعد إزالة اللقاح. أيضا، لا تلمس جوانب أنبوب أو زجاجة مع حلقة أو برميل من micropipettor. إذا pipetting على اللقاح، موزعة على تعليق خلية في appropriate مكان على لوحة ثم استخدام حلقة، والعصا أو مسواك لنشر ما يزيد على الربع الأول من اللوحة.
    • إذا كان اللقاح هو من مستعمرة أخرى وحة، المس بلطف مع مستعمرة الحلقة، أو عصا مسواك ثم انتشر خلال الربع الأول من اللوحة. تأكد يتم تبريد حلقة معدنية قبل لمس المستعمرة. لضمان حلقة ليست ساخنة جدا، لمسها بخفة على لوحة أجار في مجال معين حيث لا streaking سيحدث. وهناك حاجة فقط عدد قليل من خلايا المستعمرة، وليس مستعمرة بأكمله.
    • إذا باستخدام حلقة معدنية، اللهب باستخدام ناسخ بنسن قبل الحصول على اللقاح لوحة (لوحة B من الشكل 3). بدء من حوالي 3-4 بوصة الحلقة، مع الأسلاك في غيض من مخروط الأزرق، أهم جزء من اللهب. ينبغي أن تصبح حمراء معدنية ساخنة. نقل سلك حتى الشعلة تقترب من الحلقة. يمنع هذا التلاعب هباء من البكتيريا المتبقية على حلقة من استخدام السابقة.
    • المشتعلة يقتلالبكتيريا (وإن لم يكن جراثيم) وتيارات الحمل الحراري من الهواء الساخن منع الملوثات المحمولة جوا من الاستقرار على غيرها من السلك المعدني خلال التلاعب اللاحقة.
    • إذا باستخدام مسواك العقيمة شقة، عقد نهاية الضيقة بلطف بين الإبهام والبنصر بزاوية ° 10 الى 20 في المتوسط، واستخدام واسعة لنهاية خط الأرباع. في حالة استخدام حلقة أو عصا خشبية، لأنه عقد مثل قلم رصاص في نفس الزاوية. لا تضغط الثابت بحيث الحلقة، أو عصا مسواك تحفر في أجار.
  5. بعد الانتهاء من رباعي الأولى، عكس وتعيين أسفل الظهر في لوحة غطاء على مقاعد البدلاء. تخلص من العصا أو مسواك أو إعادة اللهب حلقة معدنية كما هو موضح في الخطوة رقم 4.
  6. تحويل طبق بتري 90 درجة إلى خط الربع الثاني. رفع النصف السفلي من لوحة مقلوب من على مقاعد البدلاء ثم المس الحلقة، عصا أو مسواك لرباعي الاول بالقرب من نهاية خط آخر. باستخدام ذهابا وإيابا نمط، عبر أكثر من جامعة الدول العربية1/2 طن من الشرائط في الربع أول تحرك بعد ذلك إلى الربع الثاني فارغ. قلب وتعيين أسفل الظهر في لوحة غطاء على مقاعد البدلاء مرة يتم تعبئة رباعي الثاني.
    • الحلقة، يجب أن العصا أو مسواك أبدا العودة من بداية الشوط الأول من الشرائط في الربع الأول حيث أودع معظم اللقاح الأصلي.
    • وينبغي أن تستخدم حلقة جديدة من البلاستيك، عصا خشبية أو مسواك لكل رباعي.
  7. كرر الخطوة رقم 6 مرتين لالأرباع الثالثة والرابعة.
    • تأكد من التخلص من عصا أو مسواك أو إعادة اللهب حلقة معدنية بين كل رباعي.
    • تجنب الخوض في الربع الأول عندما streaking الربع الرابع.
  8. احتضان لوحة رأسا على عقب بحيث التكثيف الذي يتراكم على غطاء لا بالتنقيط على المستعمرات.

3. صب الإجراءات اللوحة: في عينة مختلطة من تعداد الخلايا البكتيرية

هذه الطريقة في كثير من الأحيان استخدامد لحساب عدد من الكائنات الحية الدقيقة في عينة مختلطة، الذي يضاف إلى المتوسطة أجار المنصهر قبل التصلب والخمسين. نتائج عملية في المستعمرات موزعة بشكل متجانس في جميع أنحاء المتوسط ​​الصلبة عند مطلي التخفيف العينة المناسبة. يتم استخدام هذه التقنية لإجراء تعداد لوحة قابلة للحياة، والتي يتم تعداد إجمالي عدد وحدات تشكيل مستعمرة في أجار وعلى سطح أجار على لوحة واحدة. لوحة قابلة للحياة تهمة توفير وسيلة موحدة العلماء لتوليد منحنيات النمو، لحساب تركيز الخلايا في الأنبوب الذي تم مطلي العينة، ودراسة تأثير البيئات المختلفة أو ظروف النمو على بقاء الخلية البكتيرية أو معدل النمو.

  1. التسمية حول حافة الجزء السفلي (وليس غطاء) من طبق بيتري العقيمة الفارغة ولكن مع اسمك على الأقل، من تاريخ، ونوع من النمو المتوسط، ونوع الكائن الحي التي يمكن ان تضاف الى المتوسطة أجار ذاب.
    • وتشمل عامل تخفيف إذا بلاتجي التخفيفات المسلسل، أو سلسلة من التخفيفات المتكررة، مما يؤدي إلى انخفاض في تركيز منهجية من الخلايا في العينة. إعداد التخفيفات المسلسل ضروري إذا كان عدد الخلايا في عينة يتجاوز قدرة لوحة أجار، الذي هو مجموعة ذات دلالة إحصائية 30 حتي 300 وت م. إذا كان هناك أكثر من 300 CFU على طبق من ذهب، بعد ذلك سوف تكون المستعمرات المزدحمة والتداخل.
  2. الحصول على أنبوب يحتوي على 18 مل من المتوسط ​​آغار ذاب.
    • وينبغي الاستغناء عن أجار المتوسطة في أنابيب الاختبار وتعقيمها مسبقا في الأوتوكلاف. في نفس اليوم أنه مطلوب للتجربة، ينبغي ذاب أجار في باخرة لمدة 30 دقيقة ثم نقل إلى حمام الماء C ° 55. وينبغي أن ذاب أجار فقط بقدر ما هو مطلوب للتجربة كما أنه لا يمكن إعادة استخدامها.
    • عشر دقائق قبل صب لوحات، ينبغي نقل الأنابيب من أجار ذاب من 55 درجة مئوية إلى حمام الماء كتلة الحرارة على العملatory مقاعد البدلاء تعيين في 48 ° C. وبمجرد أن تصل درجة الحرارة هذه أجار، وانها مستعدة لضخ. إذا أجار حار جدا، قد يكون قتل البكتيريا في العينة. إذا أجار هو بارد جدا، فقد يكون المتوسط ​​العقدي طدت مرة واحدة.
  3. الحصول على عينة الخاص بك، التي ينبغي أن تكون إما ثقافة مرق أو تعليق من الخلايا التي تنتجها الخلايا خلط من مستعمرة إلى المخزن المؤقت أو المالحة.
    • ويمكن اشتقاق عينات من سلسلة التخفيف من عينة واحدة.
    • يجب أن يكون حجم العينة مطلي أن يكون بين 0.1 و مل 1.0.
  4. فتح غطاء طبق بتري فارغة، والاستغناء عينتك في منتصف لوحة (لوحة A من الشكل 4). إغلاق الغطاء.
    • استخدام تقنية العقيم طوال هذا الإجراء.
    • إما استخدام ماصة المصلية أو لنقل micropipettor عينتك إلى لوحة. السيطرة على تدفق العينة بحيث لا ينفق من لوحة.
  5. إزالة الغطاء من الحوض(ه) من أجار ذاب، وتمرير حافة أنبوب مفتوح من خلال لهب الموقد بنسن لل.
  6. فتح غطاء طبق بتري تحتوي على عينتك وصب بعناية في أجار (لوحة B من الشكل 4). إغلاق الغطاء ثم خلط العينة مع أجار بواسطة يحوم بلطف لوحة.
  7. السماح للأجار لترسيخ جيدا قبل بليت قلب للحضانة.

4. انتشار الداخلي اللوحة: تشكيل المستعمرات البكتيرية منفصل عن التهم لوحة، الإثراء، التحديد، أو فحص

هذه التقنية عادة يستخدم لكائنات دقيقة منفصلة الواردة في وحدة تخزين عينة صغيرة، الذي ينتشر على سطح لوحة أجار، مما أدى إلى تشكيل مستعمرات منفصلة موزعة بالتساوي على سطح مطلي أجار عند تركيز مناسب من الخلايا. بالإضافة إلى استخدام هذه التقنية لوحة العد قابلة للحياة، التي العدد الإجمالي للمستعمرة تشكيل وحدات على الغناءيتم تعداد جنيه وحة والمستخدمة لحساب تركيز الخلايا في الأنبوب الذي تم مطلي العينة، يتم استخدام الطلاء بشكل روتيني انتشار في تجارب تخصيب، والاختيار، والفرز. النتيجة المرجوة لهذه التجارب الثلاث هو عادة نفس لوحة التهم، التي لتوزيع المستعمرات المنفصلة يشكل عبر سطح أجار. ومع ذلك، فإن الهدف من ذلك هو عدم نضمن أن تكون جميع خلايا قابلة للحياة تشكل المستعمرات. بدلا من ذلك، يجب فقط تلك الخلايا ضمن السكان التي لديها التركيب الوراثي خاصة النمو. يمكن استخدام الإجراء لوحة انتشار على تقنية لوحة بور لتجربة التعداد إذا كان الهدف النهائي هو عزل المستعمرات لمزيد من التحليل لتنمو المستعمرات إتاحتها على سطح أجار في حين أنها أصبحت جزءا لا يتجزأ من أجار مع لوحة بور الإجراء.

هناك نوعان من الاستراتيجيات المذكورة هنا لانتشار الإجراء طبق من ذهب. أول (الطريقة A) ينطوي على استخدام القرص الدوار والزجاج أو المعدن ريال عمانيد على شكل عصا الهوكي. الثاني (الطريقة B)، ويشار إلى أن "أسلوب كوباكابانا"، ينطوي تهز الخرز الزجاجي المعقم مسبقا. كلا تسهيل نشر حتى من الخلايا عبر السطح أجار.

طريقة A: انتشار الطلاء مع القرص الدوار والزجاج أو قضيب معدني

  1. التسمية حول حافة الجزء السفلي (وليس غطاء) من لوحة أجار مع اسمك على الأقل، من تاريخ، ونوع من النمو المتوسط، ونوع الكائن الحي إلى أن مطلي على المتوسط.
    • وتشمل عامل تخفيف الطلاء إذا التخفيفات المسلسل.
    • يجب أن تكون لوحات جافة تماما دون التكثيف على الغطاء وقبل تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة قبل الطلاء الانتشار. إذا تم تخزين لوحات في C ° 4، إزالتها أو حتى عدة ساعات في اليوم السابق. تنتشر بها في أكوام صغيرة لا تحمل لوحات متداخلة من أكثر من 2-3 والسماح لهم الجافة.
  2. مركز اللوحة على القرص الدوار (الشكل 5).
  3. كنت الحصول علىص العينة، التي ينبغي أن تكون ثقافة مرق أو تعليق من الخلايا التي تنتجها الخلايا خلط من مستعمرة إلى المخزن المؤقت أو المالحة.
    • ويمكن اشتقاق عينات من سلسلة التخفيف من عينة واحدة.
    • يجب أن يكون حجم العينة مطلي أن يكون بين 0.1 و مل 0.2.
  4. فتح غطاء طبق بتري، والاستغناء عينتك على وسط آغار. إغلاق الغطاء.
    • استخدام تقنية العقيم طوال هذا الإجراء.
    • استخدام micropipettor لنقل عينتك إلى لوحة. السيطرة على تدفق العينة بحيث لا ينفق من لوحة.
  5. تراجع قضيب الزجاج أو المعدن قضيب (وتسمى أيضا رش) في كوب من 70٪ (V / V) الايثانول.
    • تنبيه: لا تغمس لرش الساخن في دورق من الكحول.
    • يجب أن الإيثانول لمس فقط الجزء السفلي من رش وبوصة الأولى من الجذع.
  6. استنزاف وإشعال الإيثانول الزائد عن طريق تمرير من خلال لهب من الكعكEN الموقد.
    • يجب الشعلة السفر طول ورش الجذعية التي جاءت في اتصال مع الايثانول ثم اطفاء بسرعة.
    • يجب الدورق لاطلاق النار الصيد الإيثانول، لا داعي للذعر! وضع غطاء زجاجي فوق الكأس، والتي سوف اخماد النار بسرعة.
  7. فتح غطاء لوحة أجار، وعقد الغطاء في يدك اليسرى مع الإبهام والسبابة. تبريد رش عن طريق لمس إلى أجار على طول الحافة بالقرب من الحافة.
    • لا تلمس أجار حيث تم إضافة الخلايا. فإن رش الساخنة قتل الخلايا.
  8. مع يدك اليسرى (مع الاستمرار في الضغط على غطاء لوحة أجار)، وتدور ببطء القرص الدوار.
    • على الرغم من الأفضل تجنبها، إذا كان يجب وضع غطاء عليها، ضع وجهه لأسفل على سطح تطهيرها داخل المجال المعقم للناسخ بنسن. مع غطاء أن ينبري، هناك فرصة أكبر للتلوث من حركات الأجسام أو اليدين، وخلق تيارات الهواء التي تسببالكائنات الحية الدقيقة وجزيئات الغبار أن ينزل إلى السطح الداخلي للغطاء.
  9. مع يدك اليمنى، أمسك رش بلطف على سطح أجار وتنتشر تدريجيا العينة بالتساوي على لوحة بأكمله. نقل رش ذهابا وإيابا عبر لوحة والقرص الدوار هو الغزل.
  10. السماح لاستيعاب العينة بدقة (5 دقائق على الأقل) قبل لوحة للقلب لالحضانة.

الطريقة ب: انتشار الطلاء مع الخرز الزجاجي: "أسلوب كوباكابانا"

  1. التسمية حول حافة الجزء السفلي (وليس غطاء) من لوحة أجار مع اسمك على الأقل، من تاريخ، ونوع من النمو المتوسط، ونوع الكائن الحي إلى أن مطلي على المتوسط.
    • وتشمل عامل تخفيف الطلاء إذا التخفيفات المسلسل.
  2. فتح غطاء لوحة أجار، وعقد الغطاء في يدك اليسرى مع الإبهام والسبابة. ثم فتح أنبوب زجاجي أو زجاجة تحتوي على تعقيم مسبقا GLالحمار الخرز. مع حقكم اللهب، ومن ناحية حافة أنبوب أو زجاجة ثم الاستغناء بعناية 10-12 الخرز الزجاجي المعقم على لوحة أجار (الشكل 6). إغلاق غطاء من لوحة، واللهب حافة أنبوب أو زجاجة مرة أخرى قبل إعادة تركيب الغطاء ووضعه جانبا.
    • صب بلطف حبات من الأنبوب أو الزجاجة بضعة سنتيمترات فوق أجار حتى لا ترتد حبات من طبق بيتري.
    • استخدام الخرز الزجاجي التي هي 4 مم في القطر. تعقيم الزجاجات لهم في أنابيب الاختبار أو في الأوتوكلاف في C ° 121 بشأن دورة الجافة (الإعداد الجاذبية) لمدة 30 دقيقة.
    • واحد الاستفادة من استخدام الخرز بدلا من رش هو أن هناك حاجة لا تضع أي حاويات مفتوحة من الإيثانول لالمشتعلة المتكررة.
  3. فتح غطاء لوحة أجار، والاستغناء عينتك على وسط آغار. إغلاق الغطاء.
    • استخدام تقنية العقيم طوال هذا الإجراء.
    • قسامة 100 حتي 150 ميكرولتر من العينة في اللوحة. هذاوحجم تيسير نشر حتى من الخلايا. استخدام micropipettor لنقل عينتك إلى لوحة. السيطرة على تدفق العينة بحيث لا ينفق من لوحة.
  4. تنتشر العينة عن طريق هز بلطف الخرز عبر سطح أجار 6-7 مرات. لضمان خلايا موزعة بالتساوي، واستخدام الحركة الأفقية تهتز.
    • لا دوامة حبات أو آخر كافة الخلايا في نهاية المطاف على حافة اللوحة.
    • تلميح: إذا فعلت بشكل صحيح، فإن الإجراء يبدو وكأنه "maracas تهز".
  5. تدوير 60 درجة ثم لوحة يهز أفقيا مرة أخرى 6-7 مرات.
  6. تدوير 60 درجة وحة للمرة الثانية ويهز أفقيا مرة أخرى. الآن، يجب عليك تحقيق الانتشار حتى من الخلايا عبر السطح أجار.
  7. عند الانتهاء انتشار الطلاء، ينبغي استيعاب العينة وسطح أجار يجب أن تكون جافة. صب قبالة الخرز الملوثة في كوب جمع ملحوظ تحتوي على 10٪ الكلور.
    • لاتجاهل الخرز في سلة المهملات! سيتم تشطف حبات المستعملة وتعقيمها، وإعادة تعقيم لهم للاستخدام من جديد.
    • ملاحظة: إذا كان سطح أجار لا تزال رطبة بعد اهتزاز ثلاث مرات، والسماح للجلوس لوحة لعدة دقائق للسماح للسائل لتمتصه أجار، ثم كرر الخطوات من 4-6 حتى # سطح اللوحة يظهر الجافة.
  8. عكس لوحة للحضانة.

5. لينة إجراء تراكب أجار: تشكيل لويحات لعزل وتعداد بالعاثية (الفحص البلاك)

ويشيع استخدام هذه التقنية لكشف وتحديد الجراثيم (بالعاثية)، أو الفيروسات البكتيرية التي تتراوح في حجمها 100 حتي 200 نانومتر. هناك حاجة إلى مجهر إلكتروني لرؤية جزيئات بالعاثية الفردية. ومع ذلك، يمكن الكشف عن وجود الجزيئات المعدية وبالعاثية لويحات على صفيحة أغار (7A الشكل). فاجات لا يمكن نسخ الخلايا المضيفة لهم خارج البكتيرية، لذلك لإكثارد كشف يتطلب خلط وفاجات الخلايا المضيفة معا قبل الطلاء. لإجراء تراكب أجار لينة، والاستغناء عن وحدة تخزين صغيرة، وعموما في نطاق من 50 إلى 200 ميكرولتر ميكرولتر من تعليق بالعاثية في أنبوب يحتوي على نحو 10 8 البكتيريا (خلايا المضيف) التي تنتشر بالتساوي في 2،5-3،0 مل من لينة (0.5 إلى 0.7٪ [ث / V])، أجار المغذيات المذابة. يسكب الخليط الناتج على سطح (1،5 حتي 1،9٪ [ث / V]) لوحة من الصعب المغذيات آجار. وهزت لوحة بما فيه الكفاية لضمان أن أجار لينة تغطي كامل السطح من أجار الثابت. ثم يتم وضع لوحة على سطح مستو حتى طبقة أعلى أجار كان لديها الوقت لترسيخ وبعد ذلك يمكن وضعها في الحاضنة.

مع مرور الوقت، وخاصة تعليق غائم من الخلايا البكتيرية، ويشار إلى حديقة، تصبح مرئية في جميع أنحاء المتوسط ​​أجار لينة (7B الشكل). تشكل لويحات إذا بالعاثية يصيب واحدة من الخلايا البكتيرية، يعيد داخل الخلية ه، ثم lyses الخلية الإفراج عن فاجات ذرية ما يصل الى 100 ​​(ويعرف أيضا باسم، وحجم الانفجار). نشر الجزيئات بالعاثية جديدة في أجار لينة، اصابة البكتيريا في المنطقة المحيطة الخلية البكتيرية هي lysed. بعد دورات متعددة من العدوى وتحلل، وغائم التعليق الخلية البكتيرية في أجار لينة يختفي، تاركا منطقة تسمى لوحة المقاصة. كل لوحة تحتوي على جزيئات بالعاثية أكثر من 10 وكلها متطابقة وراثيا إلى الجسيمات المعدية بالعاثية الأصلي. لأن لوحة تنشأ من الجسيمات بالعاثية واحد، قد يكون عد الرقم الناتج من وحدات وحة التشكيل (PFU) ويمكن حساب تركيز الأصلي، أو عيار، لتعليق بالعاثية. هذا النوع من التجارب، ودعا الى فحص لوحة، كما يوفر وسيلة موحدة العلماء لتوليد منحنيات النمو من خطوة واحدة، للتحقيق في مدى خصوصية المضيف، وتنبيغ الخلايا البكتيرية للتجارب الجينية.

  1. <STRONG> إعداد مؤشر البكتيريا: إن ثقافة تنمو باطراد من سلالة بكتيرية المضيف بحاجة إلى أن تكون مستعدة لتجربة أجار تراكب الناعمة. كل مضيف ومتطلبات النمو الخاصة. مطلوب بين 0.3 و 0.5 مل مل من تعليق البكتيريا مؤشر لكل لوحة. إذا تم إعداد قارورة من البكتيريا المؤشر (على سبيل المثال، 25 مل)، ينبغي تقسيم الثقافة إلى أصغر مأخوذة (مثل، 5 مليلتر مأخوذة الاستغناء في أنابيب معقمة المسمار وتوج) لتقليل إمكانية التلوث المتبادل. يجوز إبقاء الأنابيب على الجليد (C ° في 4) حتى جاهزة للاستخدام في التجربة. استخدام تقنية العقيم لتطعيم المرق المغذي المعقم ثم احتضان وفقا لمواصفات من سلالة بكتيرية. يجب التخلص من بقايا الثقافات في نهاية اليوم.
  2. إعداد أنابيب الامتصاص: مكان اثنين أنابيب microcentrifuge العقيمة في رفوف. تسمية غطاء "فج]" أولا وأنبوب غطاء "التحكم" الثاني الأنبوب.
    • نموذجييتم إعداد التخفيفات لي المسلسل من بالعاثية لست] ومطلي وفي هذه الحالة ستضاف أنابيب microcentrifuge إضافية إلى رف وصفت مع عامل تخفيف.
    • وينبغي بذل الأسهم بالعاثية جديدة من اللوحات واحدة وتخزينها في C. ° 4 تفصيل جسيمات بالعاثية، ينبغي أن تكون درجة حرارة تصل إلى أسهم درجة الحرارة المحيطة قبل إلى تنفيذ تجربة.
    • يجب التعامل مع الاسهم بالعاثية بلطف - لا دوامة أو الماصة بقوة.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من العينة بالعاثية الخاص بك إلى الأنبوب الأول ثم إضافة 50 ميكرولتر من العازلة بالعاثية إلى أنبوب الثاني، الذي سيكون بمثابة السيطرة السلبية لفحص اللوحة.
    • استخدام تقنية العقيم في جميع التلاعب من بالعاثية والبكتيريا.
  4. إضافة 500 ميكرولتر المقبل من البكتيريا مؤشر إلى كل أنبوب امتصاص.
    • والخلايا البكتيرية تترسب في القاع من أنبوب إذا يجلس على مقاعد البدلاء في الجليد أو لفترات طويلة من الزمن. إذا كانت الثقافة ليست مزيجإد قبل إزالة أحد قسامة للتجربة، وسيتم نقل ما يكفي من الخلايا البكتيرية لا إلى أنبوب امتصاص. يجب أن يكون هناك عدد كاف من المستعمرات البكتيرية التي شكلت في أجار لينة (أي حديقة) للكشف عن اللوحات. استخدام خلاط دوامة بلطف لاعادة تعليق البكتيريا المؤشر إلى التعليق متجانسة قبل نقل إلى أنابيب مأخوذة الامتزاز.
  5. مزج الخلايا البكتيرية وبالعاثية بواسطة عبها بلطف الأنابيب.
  6. احتضان بالعاثية / خليط البكتيريا لمدة 15-20 دقيقة (وليس أكثر من 30 دقيقة) عند درجة حرارة مناسبة لسلالة المؤشر.
  7. إعداد أجار لينة لوحات أجار والمغذيات الثابت: على الرغم من الامتزاز يحدث، ومكان اثنين من أنابيب لينة أجار (ذاب سابقا وتخزينها في C ° 55) في كتلة التدفئة في مقاعد البدلاء المختبر الخاص بك وضعت في 46-48 ° C.
    • يجب أن تكون لينة أجار ذاب معايرتها لدرجة حرارة كتلة التدفئة لمدة 10-15 دقيقة. إذا ذاب لينةأجار يجلس لفترة أطول من 15 دقيقة، وسوف تبدأ في ترسيخ وستشكل كتل عندما سكب على أجار الثابت. إذا ذاب لينة أجار يجلس أقل من 10 دقيقة، وسوف تكون ساخنة جدا إذا أضيف إلى بالعاثية / خليط البكتيريا، قتل خلايا المضيف قبل الطلاء. ونتيجة لذلك، قد لا تشكل حديقة واللوحات قليلة أو لا تكون قد كشف.
    • إعداد إضافية أنابيب لينة إذا أجار تصفيح التخفيفات التسلسلي للالمحللة بالعاثية.
  8. التسمية حول حافة الجزء السفلي (وليس غطاء) من اثنين من المواد الغذائية الصلبة لوحات أجار لوحة باسمك على الأقل، من تاريخ، ونوع من النمو المتوسط، و "فج]" أو "السيطرة" المقابلة لأنابيب الامتصاص.
    • وتشمل لوحات إضافية المسمى مع عامل تخفيف الطلاء إذا التخفيفات المسلسل.
    • يجب على لوحات أجار الصعب أن تكون جافة تماما دون التكثيف على الغطاء وقبل تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة قبل إضافة أجار لينة. إذا تم تخزين لوحات في C ° 4، بإزالتها عدة ساعات أو حتى داذ من قبل. تنتشر بها في أكوام صغيرة لا تحمل لوحات متداخلة من أكثر من 2-3 والسماح لهم الجافة. والرطوبة الزائدة في طبقة الآجار الثابت تسبب التخفيف من أجار لينة، والسماح لنشر بالعاثية بسهولة أكبر من خلال أجار لينة خلال تشكيل اللوحة. ونتيجة لذلك، سوف زيادة حجم اللوحة.
  9. لوحة الامتزاز أنابيب واحد في وقت كما يلي: استخدام micropipettor P1000 لنقل جو معقم و مطهر فإن الفيروس / خليط البكتيريا (يجب أن يكون حوالي 550 ميكرولتر) إلى أنبوب لينة ثم أغار تدوير بسرعة من بين راحتي يديك لخلط محتوياتها. لا تهز الأنبوب بحيث يتم إدخال فقاعات الهواء. عقد الأنبوب في يدك اليسرى، افتح غطاء لوحة أجار الثابت مع يدك اليمنى وتصب على الفور محتويات الأنبوب على سطح لوحة أجار الثابت. قبل أن يغلق الغطاء، لوحة صخرة بلطف ولكن بسرعة لنشر أجار ذاب الناعمة على كامل سطح لوحةقبل أن لديه الوقت لترسيخ. تجنب الرش على أجار لينة ذاب على الجانبين من طبق بيتري. إغلاق الغطاء.
  10. كرر الخطوة رقم 9 لجميع أنابيب الامتصاص، أنبوب واحد في كل مرة.
  11. وضع لوحات على سطح مستو والسماح لهم للوقوف دون عائق حتى يتم توطد أجار لينة.
    • عادة 30 دقيقة كافية.
  12. عكس لوحات للحضانة.
    • قد تكون مكدسة لوحات متعددة ومسجلة معا ثم مقلوب للحضانة.

بعد الحضانة، قد يتم تفتيشها لوحات لويحات. ينبغي أن يكون فقط المراقبة السلبية في الحديقة من البكتيريا (أي ثقوب إرشادية لويحات). لويحات تختلف من حيث المظهر والحجم والشكل والشاملة. يمكن أن تكون معزولة وهناك نوع معين من بالعاثية خليط غير متجانس من لويحات من اللكم بعناية مركز واحد لوحة مع مسواك معقمة ونقل اللقاح إلى ر ميكروسنتريفوج العقيمةأوبي تحتوي على 100 حتي 1000 ميكرولتر من مرق أو المخزن المؤقت بالعاثية. يمكن مطلي هذه المحللة باستخدام نفس الإجراء المذكورة أعلاه. على الأقل 3-6 المتعاقبة واحد وحة العزلة ضرورية لضمان أنه قد تم الحصول على بالعاثية النقي. يجب أن تضعف في كثير من الأحيان لأكثر من مجموعة والمحللة الكبيرة (10 -1 إلى 10 -10) لإيجاد عيار التي تنتج غير متداخلة لويحات على طبق من ذهب. عدد يختلف تبعا لحجم اللوحة.

6. طبق الإجراءات اللوحة: نقل الخلايا لفحص والمسوخ Auxotrophs

هذه التقنية تسمح المقارنة بين نمو الخلايا الأولية على لوحة لوحات الثانوية، وسيلة لتوليد خلايا الشاشة لاختيار النمط الظاهري. أولا الأساسي أو الرئيسي، وتلقيح لوحة مع الخلايا إما عن طريق انتشار الطلاء على تخفيف المستعمرات التي تنتج واحد أو نقلهم إلى لوحة في نمط المكاني المحدد من قبل علامات الشبكة. لوحات تحتوي على وسائل الإعلام الثانوي مع النمو inhibيتم تلقيح itors أو وسائل الإعلام التي تفتقر إلى المغذيات خاصة مع الخلايا من المستعمرات على لوحة الأولية. ويرد نمط المكاني للالمستعمرات الأولى عن طريق الضغط على قطعة من المخمل إلى لوحة الأولية. الخلايا البكتيرية التمسك المخملية لأن لديهم قدر أكبر من التقارب لمن المخمل لأجار. بصمة من الخلايا على والمخمل ثم يتم نقلها إلى لوحات الثانوية متعددة مع نمو الخلايا مما يعكس نمط مستعمرة ذاته في لوحة الأولية. وبعبارة أخرى، من مثل وجود ختم مطاطي، والتي تحاكي نمط النمو من لوحة واحدة إلى أخرى. هذه التقنية هو مفيد لأنه يسمح ليتم عرضه على عدد كبير نسبيا من المستعمرات في وقت واحد لكثير من الظواهر في تجربة واحدة.

  1. إعداد لوحة الأساسي: تسمية حول حافة الجزء السفلي (وليس غطاء) من لوحة أجار مع اسمك على الأقل، تاريخ، ونوع متوسطة النمو.
  2. علامة من شبكة على الجزء السفلي من لوحة معاثنين على الاقل من خطوط عمودية متباعدة بالتساوي واثنين على الأقل من خطوط أفقية متباعدة بشكل متساو. عدد المربعات الناتجة عن ذلك.
  3. استخدام المسواك قبل تعقيمها لتطعيم كل مربع مع عينة الخلية. لكل عينة، الداب وسط الساحة. لا تغطي كامل مساحة مع الخلايا (الشكل 8) وإلا سوف العينة كسا الأرض عندما حضنت وتلوث الساحات المحيطة.
    • وسيتم تلقيح كل مربع مع عينة مختلفة، المستمدة إما من الثقافات مرق أو مستعمرات على آخر لوحة.
  4. وعكس احتضان لوحة الأولية، والتي سوف تستخدم وسائل الإعلام لتطعيم الثانوية المختلفة.
  5. تطعيم لوحات الثانوية: المكدس لوحة الابتدائية والثانوية جميع لوحات. مع علامة، وجعل علامة على الجانب التوجه لوحات. تأكد من أن العلامة على الجانب السفلي من كل لوحة، وليس الغطاء.
  6. الحصول على قطعة قماش القطيفة معقمة ووضعه على كتلة اسطوانية (Figure 9). قفل القماش القطيفة في مكان مع حامل. لاحظ علامة التوجه على الكتلة.
    • يجب أن تكون كتلة نفس حجم الجزء السفلي من طبق بتري (10.2 القطر سم). ينبغي أن يأتي مع عصابة التأمين الذي القماش القطيفة المشابك إلى كتلة الطلاء في حين طبق الاصل.
    • يجب أن يكون قماش القطيفة (15.2 × 15.2 سم مربع) مسبقا تعقيمها. كومة 10 أو 12 الساحات نظيفة ثم لف عليهم في رقائق الألومنيوم ثم ضع لهم في الأوتوكلاف في C ° 121 بشأن دورة الجافة (الإعداد الجاذبية) لمدة 30 دقيقة. قبل استخدامها في تجربة الطلاء طبق الاصل، تأكد من أنها جافة تماما عن طريق وضعها في فرن دافئ لعدة ساعات. نلاحظ أن المربعات القطيفة قد تحتاج إلى إزالة linted مع اخفاء الشريط قبل التعقيم.
    • ويمكن الساحات القطيفة إعادة استخدامها. بعد أن تم تطهير الساحات القطيفة المستخدمة في الأوتوكلاف، ينبغي أن تشطف في الماء العادي وإعادة تعقيمها كما هو موضح أعلاه.
    • كتلة اسطوانيةوينبغي تطهيرها ك والمشبك بين الاستخدامات مع موجز شطف في 70٪ (V / V) أو الإيثانول 10٪ الكلور.
  7. إزالة الغطاء وقلب لوحة الأولية. يصطف علامة على لوحة التوجيه مع علامة على الكتلة. خفض صفيحة بحيث سطح أجار على اتصال مع القماش القطيفة على كتلة اسطوانية. ولكن برفق اضغط لأسفل بالتساوي مع راحة يديك على الجزء الخلفي من لوحة الأولية ومن ثم رفع بعناية لوحة الأولية بعيدا عن الكتلة. استبدال غطاء على طبق من ذهب.
    • ويمكن استخدام الانطباع المخملية من الخلايا الأولية من لوحة لتطعيم حوالي 7-8 لوحات الثانوية قبل انطباعا مع احتياجات المخملية جديدة في هذا الشأن.
  8. كرر الخطوة رقم 7 مع كل من لوحات الثانوية.
    • كعنصر تحكم إيجابية، وينبغي أن لوحة مشاركة في سلسلة تكون وسيلة أجار فيه جميع السلالات اختبار يجب أن ينمو. تم نقل هذه الطريقة يمكنك التأكد من أن الخلايا لجمع كل الثانويةأتيس في هذه السلسلة. خلاف ذلك، قد يكون يرجع انعدام النمو على وسيط اختبار خاص لنقل الخلية غير كافية بدلا من النمط الظاهري للسلالة.
    • لتجنب ايجابيات كاذبة، ينبغي أن يؤمر لوحات الثانوية من الأقل إلى الركيزة الأكثر ملاءمة. خلاف ذلك، يمكن نقل المواد الغذائية بين لوحات مما يتيح لخلايا أن تنمو على وسيلة غير المواتية.
  9. عكس لوحات واحتضان.
    • ملاحظة: عند فحص لوحات الثانوية للنمو، تأكد من التمييز بين النمو وبصمة و. هذا الأخير هو نتيجة سلبية.

7. تنظيف مساحة العمل

  1. إيقاف تشغيل الموقد بنسن ثم وضع بعيدا كل اللوازم بما في ذلك الثقافات على لوحات أو في أنابيب، ووسائل الإعلام اضافية، والكواشف الأخرى.
    • لا تسمح الثقافات القديمة، سواء على لوحات أو في أنابيب، لتتراكم على مقاعد البدلاء المختبر أو في مناطق التخزين. هذه العينات، والتي هي سيئة السمعة مصادر التلوثمثل القوالب والأنواع البكتيرية غير المرغوب فيها، ينبغي التخلص منها في أقرب وقت لم تعد هناك حاجة إليها.
  2. مكان الملوثة ابوار (قفازات، نصائح ماصة، kimwipes)، والأواني الزجاجية (أنابيب وقوارير وزجاجات)، والنفايات الخطرة (الثقافات البكتيرية أو حلول بالعاثية، لوحات المستخدمة) في وعاء التخلص السليم. عند العمل مع E. غير المسببة للأمراض سلالة بكتيريا (BSL-1)، يتم إنشاء فقط غير المعدية النفايات الخطرة. عند تنفيذ هذه الإجراءات مع نفس الكائنات المسببة للأمراض (BSL-2 أو أعلى)، يتم إنشاء النفايات الخطرة المعدية. بغض النظر عن تصنيف بيولوجية، يجب تعقيمها أو تطهيرها من النفايات الخطرة قبل التخلص منها. اتبع الإرشادات الموضحة في BMBL (5 إد ال.)، وكذلك تلك التي توفرها البيئة المؤسسية صحتك والسلامة قسم للتخلص الفوري والصحيح للمخاطر بيولوجية ولدت خلال التجربة.
  3. تنظيف منطقة العمل مع مطهر.
  4. غسل اليدينجيدا بالصابون والماء الدافئ المطهر قبل مغادرة المختبر.

8. ممثل النتائج

لوحة خط وتقنيات. ويرد تطبيق نموذج لطلاء خط في الشكل 1. ويستخدم هذا الإجراء لعزل المستعمرات البكتيرية من مزارع الخلايا المختلطة هو إلى حد بعيد واحدة من أهم التقنيات لماجستير في علم الأحياء المجهرية وعلم الوراثة الجزيئي. كل مستعمرة يمثل السكان من الخلايا التي تكون متطابقة وراثيا. للتطبيقات المصب العديد من الضروري أن تبدأ مع مستعمرة واحدة أو ثقافة نقية البكتيرية التي تم إنشاؤها بواسطة وسائل الإعلام مع بتلقيح الخلايا من مستعمرة واحدة. على سبيل المثال، يمكن فحص الخلايا الفردية مورفولوجية داخل مستعمرة باستخدام مجهر الضوء. يمكن تعيين الهوية الجينية تسلسل الجينات الصغيرة الوحيدات الريباسي RNA من الحمض النووي الجيني معزولة عن ثقافة الخلية بدأت مع مستعمرة واحدة.ويمكن أن توصف خصائص التمثيل الغذائي عن طريق إخضاع الخلايا لمختلف المقايسات الكيميائية الحيوية والفسيولوجية. يمكن فقط عن طريق أداء مثل هذه التجارب مع الثقافات نقية للمرء أن يكون بعض من الخصائص وارجع الى الكائنات الدقيقة خاصة. لا تحجب النتائج وفقا لاحتمال أن تكون ملوثة الثقافة. قد تحدث أخطاء فنية إذا لم يتم الحفاظ على العقم من الأداة المستخدمة لخط الخلايا عبر لوحة في جميع أنحاء الداخلي. نسيان اللهب حلقة أو استرداد مسواك جديدة بين الأرباع تجعل من الصعب الحصول على مستعمرات واحد. لا يمكن بعض الأنواع البكتيرية تكون معزولة في الثقافة نقية كما أنها تعتمد على وجود علاقة تعاونية مع أنواع أخرى البكتيرية لمتطلبات النمو معينة. ويشار إلى syntrophs، لا يجوز أن تزرع هذه الكائنات تحت ظروف شارك في الثقافة، لذلك المستعمرات (إذا شكلت) دائما وسوف تتألف من نوعين أو أكثر. واجه تحديا آخر في المختبر عند تنفيذلوحة خط الإجراء مع البكتيريا المستمدة من العينات البيئية هو أن الخلايا تظهر خصائص النمو التي تحيد عن سلالات مختبر التقليدية مثل E. القولونية. متكلسة سلالات بكتيرية مثل هذه المستعمرات قد تنتج الخيطية التي هي (على العكس من مجموعات ضيقة من الخلايا) مع فرع من الفروع التي تنتشر على قسم كبير من لوحة أجار، وبالتالي الحرارية للاختراق من قبل أداة خط لوحة، أو محاطة كبسولة لزجة لذلك لا يمكن أن المستعمرات الفردية يمكن تمييزها. هذه الخصائص تجعل من الصعب على تنقية المستعمرات واحدة بواسطة تقنية خط لوحة.

بور لوحة وتقنيات. مع تقنية بور لوحة، وتشكل المستعمرات في أجار وكذلك على سطح المتوسطة أجار وبالتالي توفير وسيلة مريحة لحساب عدد خلايا قابلة للحياة في العينة. ويستخدم هذا الإجراء في مجموعة متنوعة من التطبيقات الصناعية. على سبيل المثال، فإن من الأهمية بمكان لمياه الصرف الصحي TREمصنع atment، وهي المسؤولة عن تنظيف النفايات السائلة (مثل مياه الصرف الصحي، الاعادة من مصارف المياه) التي تم إنشاؤها بواسطة خصائص المنزلية والتجارية، والصناعية، وكذلك الممارسات الزراعية، وتحليل عينات المياه بعد عملية تنقية واسعة النطاق. يتم إعادة استخدام مياه الصرف الصحي المعالجة (المياه غير الصالحة للشرب) في مجموعة متنوعة من الطرق - لأغراض الري من المحاصيل غير الغذائية في الزراعة، لبيغ الصحية في المساكن، وأبراج التبريد الصناعية في - لذلك يجب أن تكون خالية من المواد الكيميائية والتلوث الميكروبي. يجب تنقية مياه الشرب (مياه الشرب) وفقا لمعايير وكالة حماية البيئة ويتم اختبارها باستخدام طرق الطلاء الميكروبيولوجية التي تسمح تعداد الكائنات الممرضة للإنسان محددة. هو مبين في الشكل 10 والمستعمرات البكتيرية الناجمة عن البكتيريا الموجودة في خلايا عينة مياه تم جمعها من نافورة الشرب العامة. فمن غير المرجح مسببات الأمراض البكتيرية تنتج هذه المستعمرات نظرا للتدابير تنقية لمياه الشرب، إلا أن الميكروبات هي كلحيث يمكن والتلوث السلالات غير المسببة للأمراض حتى الحد الأدنى فقط، وليس القضاء عليها تماما. وكمثال آخر، وهي شركة الصيدلانية يحتاج إلى تقييم درجة التلوث الميكروبي، أو bioburden، دواء جديد من خلال تخزين وانتاج ونقل. بواسطة أخذ عينات من المخدرات خلال مختلف مراحل عملية الطلاء والعينات باستخدام الإجراء بور لوحة، والحمل الميكروبي، أو عدد من البكتيريا الملوثة، يمكن تحديد بسهولة. تدابير وقائية يمكن بعد ذلك وضعت للحد من التلوث الميكروبي أو القضاء عليها. واحد من الأخطاء الأكثر شيوعا الفنية التي تحدث عند تنفيذ هذه التقنية بور غير كافية لوحة خلط العينة مع المستعمرات أجار ذاب يسبب تتجمع معا مما يجعل التهم لوحة غير دقيقة. خطأ آخر هو كثرة صب أجار ذاب عندما يكون الطقس حارا جدا، مما أسفر عن مقتل العديد من الخلايا البكتيرية في العينة. هذا الخطأ سوف تؤثر أيضا على دقة التهم لوحة إعطاء الأرقام التي تمثل وكيل اله مجموع عدد الوحدات مستعمرة تشكيل في العينة.

انتشار تقنية لوحة. انتشار هذه التقنية هو لوحة مماثلة للإجراء بور لوحة في فائدته كوسيلة لأداء التهم لوحة قابلة للحياة. ومع ذلك، لأن توزع بالتساوي المستعمرات التي تشكل باستخدام تقنية الانتشار عبر لوحة سطح المتوسطة أجار، يمكن عزل الخلايا من المستعمرات الفردية واستخدامها في التلاعب التجريبية التالية (على سبيل المثال، كما اللقاح لوحة خط أو مرق الثقافة). ثلاثة تطبيقات شائعة في انتشار هذه التقنية التي لوحة عنصر مهم لتخصيب والاختيار والفرز التجارب. في جميع التطبيقات الثلاثة، يمكن فصل نوع من الخلايا المطلوبة من الخليط وتعرض في وقت لاحق إلى أي عدد من الاختبارات، والكيمياء الحيوية الفسيولوجية، أو وراثية.

تجربة تخصيب ينطوي تصفيح ثقافة مختلطة على وسيط أو احتضان لوحات في هnvironmental الظروف التي تحبذ نمو الكائنات الحية الدقيقة داخل تلك العينة التي تظهر خصائص التمثيل الغذائي المنشود، وخصائص النمو، أو السلوكيات. هذه الاستراتيجية لا تمنع نمو الكائنات الأخرى ولكن النتائج عن زيادة في عدد الكائنات الحية الدقيقة المطلوب النسبية للآخرين في الثقافة. وهكذا، فإن المستعمرات التي تشكل على الأرجح يحمل لوحة تخصيب خصائص المظهرية التي تعكس النمط الجيني المطلوب. على سبيل المثال، إذا كان هدفك هو لزراعة البكتيريا المثبتة للنيتروجين من عينة بيئية تحتوي على خليط من الأنواع أكثر من 1000 البكتيرية المختلفة، والطلاء ثم العينة على وسيط التي تعاني من نقص النيتروجين لإثراء هذه البكتيريا التي يمكن أن تنتج هذا المركب من الجو باستخدام قدرات التمثيل الغذائي التي تقدمها مجموعة من الجينات المطلوبة لتحديد النيتروجين.

تجربة اختيار الطلاء ينطوي على ثقافة مختلفة على وسيلة تسمح فقط تلك الخلايا التي يخدعتين جين معين أو مجموعة من الجينات في النمو. هذا النوع من التجارب هو شائع في مختبرات البيولوجيا الجزيئية عندما تحويل سلالات بكتيرية تحتوي على المضادات الحيوية مع البلازميدات الجينات المقاومة. إذا كان هدفك هو لزراعة الخلايا فقط المؤتلف، أو تلك التي كانت في البلازميد بنجاح، ثم الطلاء العينة على وسيط التي استكملت مع التركيز المناسب من المضادات الحيوية سوف تختار لتلك الخلايا التي تظهر المقاومة لهذا الدواء خاصة.

تجربة الفحص ينطوي على تصفيح ثقافة مختلفة على وسيلة تسمح لكافة خلايا قابلة للحياة في النمو، ولكن يمكن تمييز الخلايا مع النمط الجيني المطلوب من الخلايا الأخرى على أساس النمط الظاهري الخاصة بهم. مرة أخرى، هذا النوع من التجارب هو شائع في مختبرات البيولوجيا الجزيئية عند تنفيذ المقايسات الطفرات أو الجينات إلى الاستنساخ البلازميدات. والمثال الكلاسيكي، كما هو مبين في الشكل 11، يجعل من استخدام الجينات ENCO lacZقرع β-غالاكتوزيداز، وهذا الانزيم تمكن خلايا على استقلاب X-غال (5-برومو-4-كلورو-3-β-indolyl-D-galactopyranoside)، وهي ركيزة من التناظرية الركيزة الطبيعية، اللاكتوز. الانقسام من X-β-غال من غالاكتوزيداز يسفر عن منتج الأزرق غير قابلة للذوبان. وبالتالي، إذا كان يحتوي على X-المتوسطة غال، ومطلي عينة تحتوي على خلايا الجينات إما مع lacZ البرية من نوع (الوظيفية) أو متحولة (غير عملي) على هذه الوسيلة، وبعد الحضانة ثم البرية من نوع الخلايا وإيواء وظيفية lacZ سوف الجين الأزرق تظهر المستعمرات في حين أن الخلايا الصباغية متحولة مع الجين lacZ غير وظيفية سوف تظهر المستعمرات ("الأبيض") unpigmented.

واجهت مشكلة تقنية في معظم الأحيان عند أول تعلم كيفية تنفيذ هذه التقنية انتشار لوحة غير متساو من الخلايا تنتشر عبر السطح أجار. عند استخدام القرص الدوار وقضيب الزجاج، يمكن استيعابها بسرعة كبيرة جدا العينة بحيث تشكل المستعمرات فقط بالقرب من مركز اللوحة. Wالدجاجة تفعل "أسلوب كوباكابانا"، وملتف في الخرز الزجاجي بدلا من هز عبر السطح أجار. ونتيجة لذلك، العديد من المستعمرات تنمو على طول الحافة الخارجية للوحة. في كلتا الحالتين توزيع الناتج من المستعمرات لا الاستفادة من المساحة المتاحة حتى اكتمال الخلايا قد تتجمع معا وتنمو لتصبح المستعمرات متداخلة مما يجعل لوحة تهم غير دقيقة أو تمييز من أنواع الخلايا غير مجدية.

لينة وتقنيات آجار تراكب. ويمكن استخدام الإجراء أقرب إلى أسلوب انتشار استخدام لوحة لحساب المستعمرات البكتيرية لحصر عدد بالعاثية. في حين تنتشر بين 30 و 300 الخلايا البكتيرية على سطح أجار لوحة العد (وت م / مل)، وخلط بين 100 و 400 الجزيئات المعدية بالعاثية مع 10 الخلايا المضيفة 8 حتي 10 سبتمبر لوحة العد (PFU / مل) ضمن طبقة من أجار لينة تنتشر عبر السطح من المغذيات آجار الثابت. إلا إذا أثبت خلاف ذلك، يفترض عموما رقبعة خلية واحدة البكتيرية يقسم وتتراكم أعداد كبيرة من خلايا متطابقة جينيا في كتلة واحدة تسمى مستعمرة. كما نوقش سابقا، وهذا الافتراض غير صحيح عندما تنمو الخلايا في باقات (أي أزواج، tetrads، وسلاسل، أو مجموعات) أو عرض خصائص النمو مثل الكبسولات التي تعيق تشكيل مستعمرة واحدة. يتم إجراء افتراض مماثلة لتشكيل لوحة، لوحة في أن كل نشاط يمثل من بالعاثية واحد. هذه العبارة صحيحة إذا واحد فقط بالعاثية يصيب أحد أنواع بكتيريا. ماذا يحدث إذا الجسيمات بالعاثية متعددة تصيب جرثومة واحدة؟ هذه المشكلة تتعلق المعلمة إحصائي الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند إجراء التجارب مع بالعاثية - تعدد العدوى (وزارة الداخلية) - واصفا نسبة الجسيمات المعدية بالعاثية إلى عدد من الخلايا المضيفة في عينة. لأن بعض الخلايا كثف أكثر من بالعاثية بينما الخلايا الأخرى بالعاثية واحد فقط أو أي كثف، ينبغي إصابة السكان من الخلايا المضيفة في وزارة الداخلية منخفضة ر (≤ 1)س تقليل احتمال أن تكون مصابة خلية بأكثر من الجسيمات بالعاثية واحد. توظيف وحدة لوحة التشكيل (PFU) وتعريف وظيفي يتجنب هذه المضاعفات عند تنفيذ التهم لوحة لحساب عيار بمخزون بالعاثية.

كما هو مبين في الشكل 12، مورفولوجيا البلاك يختلف عن بالعاثية مختلفة. بعض اللوحات الصغيرة بالعاثية توليد (لوحة A) في حين أن آخرين تؤدي إلى ويحات كبيرة (لوحة B). وهناك عدد من المتغيرات تؤثر على حجم اللوحة. هناك أسباب فنية تساهم في تقلب هذا. على سبيل المثال، وسائل الإعلام كاملة وسميكة الدعم أجار الصعب تطوير لويحات أكبر لأنه لا يمكن الحفاظ على النمو الخلايا المضيفة بالعاثية لفترة أطول من الزمن. وهناك كثافة عالية من الطلاء الخلايا المضيفة (> 10 9 وت في لوحة) قد يسبب انخفاضا في حجم اللوحة. وباستخدام تركيزات أقل من أجار لينة زيادة معدل انتشار الجسيمات بالعاثية في أجار لينة وبالتالي زيادة حجم اللوحات. أذكر عشريمكن نشرها على هذا المعدل زيادة تحدث عن غير قصد إذا لوحات أجار الصعب لا تجف تماما بحيث الرطوبة الزائدة أو التكثيف في طبق يخفف أجار لينة في تراكب. وهذا الإشراف الفني تسفر عن نتائج غير متسقة فيما يتعلق بحجم لوحة لبالعاثية معينة.

حجم اللوحة أيضا يرتبط إلى عدد من الأحداث الخلية المضيفة بما في ذلك كفاءة الامتزاز، ومدة الفترة الكامنة (الفترة الزمنية من امتزاز بالعاثية إلى تحلل للخلية المضيفة)، وحجم الانفجار (عدد ذرية الصادرة عن عدوى واحدة). ويمكن ملاحظة خليط غير متجانس من أحجام الجسيمات إذا وحة بالعاثية تصيب الخلايا المضيفة في مراحل مختلفة من نمو البكتيريا. على سبيل المثال، تلك التي كثف خلال المرحلة المبكرة الأسي جعل أكبر لويحات مع بالعاثية أكثر ذرية من تلك التي كثف في مرحلة متأخرة الأسي. وكقاعدة عامة، التحللي بالعاثية إنتاج لوحات واضحة في حين مستذيب ويحات بالعاثية عكر النموذج. حويفر، وبعض بالعاثية التحللي إنتاج أنماط مثيرة للاهتمام مثل لوحة في "عين الثور" هو موضح في الشكل 12B. وتحيط هذه اللوحات واضح من هالة عكر لأنه لم يتم تلك الخلايا على حافة اللوحة هي lysed بالكامل أو قد تكون مقاومة للعدوى بالعاثية. A "عين الثور" نمط لوحظ مع بالعاثية المعتدلة هي لوحة مع مركز عكر تحيط بها حلقة واضحة. هذا التشكل يعكس وزارة الداخلية وعلم وظائف الأعضاء من الخلية المضيفة فيما يتعلق بقرار تحلل-استذابة. عندما يصاب 1 الخلايا مع بالعاثية، وزارة الداخلية منخفضة وتنمو الخلايا بسرعة بسبب وفرة المواد الغذائية؛ معا هذا يسهل نمو التحللي. كما هي الخلايا هي lysed أكثر وأكثر، وزارة الداخلية، ويزيد من أشكال اللوحة واضحة. Lysogens في وسط اللوحة، ومع ذلك، تستمر في النمو لأنها ليست محصنة ضد تحلل مما أدى إلى لوحة واضحة مع مركز عكر.

يمكن تعديل هذه التقنية تراكب لوحة المقايسات مع الفيروسات حقيقية النواة. فيوعاثية ويحات شكل من الاشكال على نفس العشب من الخلايا البكتيرية في أجار لينة، والفيروسات حقيقية النواة تشكل لويحات على أحادي الطبقة من الخلايا التي تغطيها مادة هلامية. A أحادي الطبقة هي ورقة متموجة من الخلايا المتزايد جنبا إلى جنب على سطح الطبق والثقافة، ولمس بعضها البعض ولكن لا ينمو على رأس واحد آخر. لتنفيذ هذا النوع من الفحص لوحة، إضافة إلى مأخوذة من الفيروسات monolayers عرضة من الخلايا حقيقية النواة. ثم يتم تغطية أحادي الطبقة المتوسطة مع الاغاروز القائمة على المواد الغذائية - وهذا جل ما يقيد انتشار الفيروسات ذرية أطلق سراحهم من الخلايا المصابة إلى الخلايا المجاورة في أحادي الطبقة. وفقا لذلك، يتم إنتاج منطقة كروية، أو لوحة، الذي يحتوي على الخلايا التالفة عن طريق الإفراج من virions. لمساعدة التصور من الأصباغ، واللوحات التي يمكن تطبيقها الخلايا الحية وصمة عار في الثقافة خلية تقديم التناقض بين الخلايا المصابة وغير المصابة.

يتم استخدام تقنية تراكب لينة أجار لتجارب أخرى من المقايسات البلاك. أولا، من قignificant أن نتذكر أن أغار من الصعب المغذيات هي مصفوفة الدعم الذي يسمح نمو البكتيريا. الثانية، يمكن للأجار لينة تستخدم لالتراكب على تكوين مختلف المواد الغذائية من أجار الثابت. وبهذه الطريقة، يمكن للأجار لينة بمثابة وسيلة لسلالات بكتيرية لفحص خصائص النمو المختلفة أو الخصائص الأيض. على سبيل المثال، يتم استخدام تقنية تراكب الشاشة لللبكتيريا القدرة على تتحلل السليلوز (الخشب وTeather 1982). تزرع المستعمرات واحد على وسيط غير انتقائية أجار الثابت لينة ثم أغار تحتوي على 0.1٪ (W / V) وينتشر كاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) على سطح أجار الثابت. بعد الحضانة، وغمرت المياه مع وصمة عار لوحات تصور أن يسمح مناطق المقاصة حول المستعمرات في أجار لينة. ويتسبب المقاصة بواسطة الإنزيمات التي يفرزها حلمهي البكتيريا كسر السليلوز في المتوسط. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت هذه التقنية للكشف عن تراكب البكتيريا التي تمنع نمو methanogeالأركيا NIC الموجودة في الكرش من الماشية (جيلبرت وآخرون 2010). العزلات البكتيرية تزرع من العينات البيئية على المغذيات آجار المتوسطة الثابت ثم يتم overlayed مع المستعمرات التي تحتوي على أجار لينة ثقافة methanogens. بعد الحضانة، يتم تفتيشها لوحات لمناطق تثبيط النمو في مختلف أنحاء المستعمرات. هذه الطريقة تحدد سلالات بكتيرية التي تنتج من مثبطات methanogens في أجار لينة.

الأخطاء الأكثر شيوعا التقنية التي تحدث مع تقنية تراكب أجار لينة يتم صب ذاب أجار لينة عندما إما حار جدا أو بارد جدا. سيقتلون إذا كان الجو حارا جدا، والخلايا البكتيرية مختلطة في المتوسط ​​قبل الطلاء. إذا كان باردا جدا، ثم سوف أجار لينة تشكل كتل عندما سكب على أجار الثابت. وفي كلتا الحالتين، فإن النتائج ستكون غامضة أو غير قابل للقراءة في أحسن الأحوال.

طبق الاصل لوحة الداخلي. نقل الثقافات من نوع واحد من المواد الغذائية المتوسطةلآخر لاختبار متطلبات النمو يصبح شاقة للغاية إذا كان هناك أكثر من سلالات قليلة. الطلاء طبق الاصل هي طريقة الفرز التي تسمح في وقت واحد من عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة. على سبيل المثال، بعد mutagenizing ثقافة البرية من نوع الخلايا، يمكن للمرء أن تنتشر لوحة التخفيفات من الثقافة للحصول على لوحات مع المستعمرات واحد. لوحات الأولية تحتوي على المتوسطة التي تدعم نمو جميع الخلايا بما في ذلك من النوع البري prototrophs، التي تجميع كل المركبات المطلوبة للنمو، وauxotrophs متحولة، التي تحمل طفرة جينية في طريق السكروز مما يجعلها غير قادرة على تجميع المركبات الأساسية للنمو خاصة. من الطلاء خليط من الخلايا على وسيلة كاملة، يمكن أن تؤخذ العناصر الغذائية في عداد المفقودين حتى من البيئة. للتمييز بين prototrophs وauxotrophs، يمكن تكرارها على المستعمرات وسيلة ممكنة. فقط سوف prototrophs تكون قادرة على النمو. لأن الحفاظ على نمط المكاني للوحة الرئيسية، comparisعلى لوحة الثانوي مع لوحة الأساسي يسمح تحديد المستعمرات متحولة. لتحديد أي مجمع المسوخ لم تعد قادرة على تجميع، يمكن تكرارها المستعمرات على وسائط الحد الأدنى تستكمل مع مركبات معينة (على سبيل المثال، والأحماض الأمينية، ومصادر الكربون والفيتامينات، وما إلى ذلك). وبهذه الطريقة، يمكن فحص المئات من المستعمرات في نفس الوقت باستخدام الإجراء طبق الاصل لوحة. خطأ واحد التقنية التي يمكن أن تحدث وباستخدام لوحات أجار التي هي رطبة جدا، مما تسبب في المستعمرات معا لتشويه تلويث كل الثقافات على اللوحة. هذا يؤدي إلى نتائج غير موثوق بها تماما أن. خطأ آخر هو تطبيق التقنية الكثير من الضغط عند نقل الخلايا من القطيفة لوحات الثانوية. مرة أخرى، بعد احتضان لوحات الثانوية، قد تتداخل المستعمرات الناتجة انتاج الظواهر النمو يعزى إلى التلوث بدلا من auxotrophy.

ليس كل أنواع الجراثيم هي من النوع البري prototrophs، وبالتالي فإن طبق الاصل-Pويمكن استخدام الإجراء في وقت متأخر في وقت واحد لفحص مختلف السلالات البرية من نوع لمتطلبات النمو مميزة. كما هو مبين في الشكل 13، "اللمسات" من الخلايا من أربع سلالات مختلفة الزائفة البكتيرية كانت مطلية من نسختين على لوحة تحتوي على شبكة بعلامات وسائل الإعلام كاملة دعا YTA (لوحة A). سلالات ثم تم تكرارها على ثلاث لوحات الثانوية (لوحات B، C، D و) تتألف من الحد الأدنى من المتوسط ​​(MSA) تستكمل مع مصدر الكربون مختلفة (أسيتاميد، اللاكتوز، وجليكاين، على التوالي). تظهر النتائج ان اثنين من سلالات الزائفة الأربعة (P. الزنجارية P. والشتوتسرية) غير قادرين على المتزايد على هذه المصادر الكربون الثلاثة. كعنصر تحكم، وتكرار السلالات على لوحة المركز الرابع برصيد المتوسطة YTA لتأكيد تم نقل الخلايا في جميع أنحاء الداخلي. حيث أن جميع السلالات الاربع تنمو على لوحة التحكم YTA، وأوجه القصور النمو عرضت على لوحات الثلاثة السابقة في سلسلة موثوق بها. وجدولتها نتائج متماثلة الطلاء في الجدول 1. خطأ واحد جعلت عادة يتم تفسير بصمة من النمو على طبق الثانوية نتيجة إيجابية. على سبيل المثال، مقارنة النمط الظاهري من P. الزنجارية P. إلى أن من الشتوتسرية على MSA + أسيتاميد (لوحة B). هذا الأخير يعرض بصمة للنمو، والتي هي نتيجة سلبية، ويمكن أن يحدث إذا يتم نقل المواد الغذائية من لوحة السابقة مع الخلايا الأم. لا نمو الخلايا الجديدة تحدث لأنه المغذيات المفقودة ليست متاحة لخلايا ذرية. فمن السهل الخلط بين بصمة مع النمو الفعلي. إذا كنت في شك، ينبغي تكرار التجربة باستخدام طريقة بديلة مثل خط الطلاء الخلايا الأولية من لوحة على وسائط الثانوية.

الشكل 1
الشكل 1. مثال واحد من المستعمرات على لوحة. المجالات الوردي بالقرب من مركز اللوحة هي مستعمرات marcesc السراتيةENS، وهي سالبة الجرام، على شكل قضيب Proteobacterium في الأمعائيات الأسرة. بسبب تفضيله لبيئات رطبة، والكائنات الحية الدقيقة التي توجد عادة هذا النمو في زوايا احواض الاستحمام، في أحواض المغسلة، في الجص والبلاط، وعلى ستائر الحمام. S. الذابلة من السهل أن ندرك أنه ينتج صبغة حمراء تسمى بروديجيوزين. تم إنشاء المستعمرات على هذه اللوحة باستخدام تقنية خط لوحة، مع المستعمرات واحد الظهور في المربع الرابع بعد الحضانة في C ° 30 لمدة 24 ساعة. الأرباع الثلاثة الأخرى نمو تظهر متموجة في الخلايا التي تترسب على سطح أجار تطورت المستعمرات متداخلة.

الشكل 2
الشكل 2. الأدوات المستخدمة في لوحة خط تقنية. من الأعلى إلى الأسفل، كما هو موضح هي المسواك (لا بالارض وإيابا)، حلقة الأسلاك، وحلقة البلاستيكية، والعصي الخشبية. عادة يتم نقل المسواكلكوب زجاجي صغير مع نهاية اسعة ثم إلى أسفل مغطاة احباط عند تعقيمها لتعقيم قبل استخدامها. يتم نقل العصي الخشبية إلى 18 ملم أنابيب الاختبار ثم تعقيمها لتعقيم قبل الاستخدام.

الشكل 3
الشكل 3 (A) الإنتصارات لوحة التقنية باستخدام طريقة رباعي. حلقة ما قبل تعقيمها، يتم استخدام عصا أو مسواك لنشر العينة عبر ربع سطح أجار مع، على نحو سلس سريع الحركة ذهابا والرابع، من الحافة إلى مركز اللوحة. ويتكرر هذا الإجراء لكل من الأرباع الأربعة من لوحة. بعد الحضانة، يبدو نمو الخلايا على طول مسار الأداة المستخدمة لإيداع الخلايا على اللوحة. يجب فصل الميكانيكية من الخلايا في عينة مختلطة باستخدام هذه التقنية تؤدي إلى المستعمرات واحد في الربع الرابع (انظر الشكل 1 للحصول على مثال). ويشار إلى المستعمرات واحد لتشكيل وحدات مستعمرة (كفو). (B) عند استخدام حلقة معدنية للخط الطلاء، يجب تعقيمها باستخدام شعلة الموقد بنسن قبل الاتصال مع اللقاح أو المتوسطة أجار. يذكر أن أهم جزء من اللهب غيض من مخروط الأزرق. عقد مقبض الأداة، ضع السلك في اللهب حول 3-4 بوصة من الحلقة. ترك الأمر لفترة كافية لسلك لتصبح أحمر حار. نقل سلك حتى الشعلة تقترب من الحلقة. تأكد يتم تبريد حلقة معدنية قبل لمس اللقاح.

الشكل 4
الشكل 4. صب لوحة التقنية. (A) والاستغناء عن وحدة تخزين صغيرة من عينة (بين 0،1 حتي 1،0 مل) في جو معقم و مطهر طبق بتري ولكن فارغة عقيمة مع 5،0 مل باستخدام ماصة المصلية. (B) أجار ذاب معايرتها إلى درجة حرارة من 48 درجة تقريبا ثم يسكب في طبق C بيتري مع العينة. بعد إغلاق الغطاء، لوحة وملتف بلطف لمزج العينة وذاب أجار. ولا يسمح للأجار لترسيخ لنحو 30 دقيقة ثم يتم عكس لوحات للحضانة.

الشكل 5
الشكل 5. انتشار تقنية لوحة مع القرص الدوار ورش الزجاج. بعد يتم وضع لوحة أجار على القرص الدوار، وصغر حجم العينة (0.1 إلى 0.2 مل) هو الاستغناء جو معقم و مطهر على مركز اللوحة باستخدام micropipettor. وتعقيم رش عن طريق غمس ذلك في كوب من الايثانول تمر بعد ذلك من خلال شعلة الموقد بنسن لإشعال الإيثانول الزائد. قبل إجراء اتصالات مع العينة، ينبغي تبريد رش عن طريق لمس إلى أجار بالقرب من حافة اللوحة. يتم نقل بلطف ذهابا وإيابا رش من خلال عينة عبر لوحة في حين أن القرص الدوار هو الغزل ببطء. يسمح هذا الإجراء التدريجي ولكن حتى نشر من العينة عبر السطح أجار. بعد إغلاق الغطاء، يجب تعيين لوحة على مقاعد البدلاء U الأعلىndisturbed مدة لا تقل عن 5 دقائق للسماح للعينة لاستيعاب تماما في أجار قبل بليت قلب للحضانة.

الشكل 6
الشكل 6. انتشار تقنية مع لوحة الخرز الزجاجي (الطريقة كوباكابانا). وتدفقت الخرز الزجاجي التي تم تعقيمها مسبقا في الأوتوكلاف على سطح لوحة أجار يجلس على مقاعد البدلاء أعلى. A صغر حجم العينة (100 حتي 150 ميكرولتر) والاستغناء عن جو معقم و مطهر على وسط آغار باستخدام micropipettor. مع غطاء لوحة مغلقة، يتم استخدام الحركة الأفقية للتحرك بلطف تهز حبات ذهابا وإيابا عبر لوحة 6-7 مرات، ونشر العينة. ويتكرر هذا الإجراء بعد الدورية لوحة 60 درجة. يتم تكرار الحركة تهتز للمرة الثالثة بعد آخر تناوب 60 درجة. مرة واحدة العينة قد استوعبت تماما في المتوسط ​​آغار، وسكب من الخرز في كوب يحتوي على مواد التبييض 10٪. اللوحات ثم يتم مقلوب للحضانة.

الشكل 7
الشكل 7. أجار لينة تستخدم تقنية تراكب لعزل وتعداد بالعاثية استنادا إلى تشكيل لويحات (وتسمى أيضا فحص اللوحة). يمكن (A) يتم الكشف عن وجود بالعاثية كمناطق المقاصة، أو لويحات، على التعليق متموجة من المستعمرات البكتيرية نموا في أجار لينة. بالعاثية T4 هو ضراوة، بالعاثية الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل يصيب مضيفه، كولاي، مما تسبب في الخلايا المضيفة لليز والافراج عن بالعاثية ذرية. بعد جولات متعددة من العدوى وتحلل، وE. المجاورة الخلايا القولونية في المنطقة المجاورة المحيطة الخلية المضيفة المصابة الأصلي يختفي تاركا لوحة تحتوي على مليارات الجزيئات بالعاثية T4. بالعاثية T4 اللوحات التي تنتج ما يقرب من 1 ملم في القطر. في هذه التجربة، 200 ميكرولتر من التخفيف -5 10 من (أ) 2 × 10 PFU الأسهم / مل 8 من بالعاثية T4كانت مختلطة مع ما يقرب من 300 ميكرولتر من E. خلايا الإشريكية مؤشر أعد ثقافة، نموا مطردا في الغازي C. ° 37 تم إضافة كل من بالعاثية والبكتيريا إلى أجار EHA أنبوب، مختلطة لينة، ثم سكب على سطح لوحة أجار EHA الثابت. ملاحظة أنه ليس من الضروري السماح لبالعاثية والبكتيريا كثف قبل الطلاء في هذه الحالة. بعد السماح للأجار لينة لترسيخ دون عائق لمدة 20 دقيقة، والمقلوب لوحات وحضنت في C ° 37 لمدة 24 ساعة. (B) في حال عدم وجود اصابة الجسيمات بالعاثية، النتائج نمو البكتيريا في التعليق غائم من الخلايا في أجار لينة في المستعمرات التي تكون غير مرئية منفصلة. بدلا من ذلك، حتى العشب من الخلايا البكتيرية، وفي هذه الحالة E. كولاي، وأشكال في جميع أنحاء طبقة ناعمة أجار بالكامل.

الرقم 8
الشكل 8. إعداد لوحة الابتدائي (ماجستير) مع العينات البكتيرية. للحفاظ على عينات تنظيم، يمكن وضع علامة على الجزء السفلي من لوحة إلى شبكة الساحات ومرقمة الناتجة عن ذلك. يمكن تعيين كل عينة مربع على الشبكة. أظهرت أمثلة على أنماط التلقيح الصحيح مقابل غير صحيحة. ومن الناحية المثالية، يتم نقل عدد صغير من الخلايا إلى وسط الميدان باستخدام أداة التلقيح المعقمة مثل مسواك ل"DAB" العينة (خلية # 4). الأخطاء الشائعة التلقيح، مثل تلك التي صورت في الخلية # 5 ("التصحيح") والخلية # 6 ("التعبئة")، نتيجة فرط في العينات البكتيرية بعد الحضانة، وبالتالي تلويث الساحات المجاورة.

الشكل 9
الشكل 9. المقلدة لوحة التقنية المستخدمة لنقل الخلايا من المرحلة الابتدائية إلى الثانوية لوحات لشاشات النمط الظاهري. يتم محاذاة علامة على لوحة الأولية مع علامة على الكتلة القطيفة ثم غطت لوي الأحمر للسماح للسطح أجار الاتصال القماش. يتم نقل الخلايا من لوحة إلى القطيفة بواسطة الضغط برفق ولكن بشكل متساو لأسفل على لوحة الأولية مع نصائح الاصبع. سيؤدي هذا الإجراء إلى ترك بصمة من العينات الخلية على القطيفة في نمط المكاني نفس لوحة الأولية. يتم استخدام نفس الإجراء لنقل الخلايا من القطيفة لوحة الثانوي. ويمكن تلقيح ما يصل الى 7-8 لوحات الثانوي باستخدام نفس الانطباع لوحة أساسي على القطيفة. يجب تلقيح لوحة مشاركة من القطيفة بمثابة مراقبة إيجابية. ينبغي أن يكون وسيلة تدعم نمو جميع سلالات اختبار، وضمان ما يكفي من نقل الخلية وقعت في جميع أنحاء سلسلة كاملة من لوحات. بعد الحضانة، قد يتم تفتيشها لوحات الثانوية وسجل للنمو مقابل عدم النمو. وهكذا، يمكن فحص سلالات بكتيرية متعددة في نفس الوقت على وسائل عدة النمو في تجربة واحدة.

_upload/3064/3064fig10.jpg "/>
الشكل 10. نتيجة مثال باستخدام تقنية بور وحة. تم الاستغناء عينة مل 1.0 من المياه التي تم جمعها من نافورة الشرب العامة في طبق بتري معقمة فارغة. ذابت ثم لكنه سكب YTA المبردة في الطبق مع العينة. وأجار الواردة أيضا 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد لمنع نمو الخمائر والعفن التي قد تكون موجودة في عينة المياه. بعد يحوم بلطف إلى مزيج، تم تعيين لوحة على سطح مستو وسمح للأجار لترسيخ تماما. وحضنت لوحة في C ° 37 لمدة 48 ساعة. أظهرت نتيجة هذه التجربة. لاحظ الفرق في المظهر من سطح المستعمرات، والتي هي كبيرة ودائرية الشكل، مقابل المستعمرات تحت السطح، والتي هي صغيرة جدا وغير منتظمة الشكل لأن المتوسطة طدت يمنع نشر في مستعمرة تحت السطح.

الشكل 11
الشكل 11. </ STRONG> نتيجة مثال باستخدام لوحة انتشار التقنية. تم استخدام "أسلوب كوباكابانا" لوحة مزيج من خلايا الإشريكية القولونية عن تجربة الفرز. في هذه الحالة، على المديين المتوسط ​​النمو (LB) يحتوي على X-غال، لذلك هذه الخلايا الوظيفية تعبر عن انزيم β-شكل مستعمرات زرقاء بينما غالاكتوزيداز تلك الخلايا مع طفرة في جين وغير قادر بالتالي lacZ للتعبير عن شكل انزيم β الوظيفية-غالاكتوزيداز المستعمرات البيضاء. غالبا ما يشار إليها باسم "شاشة زرقاء / بيضاء"، يمكن نوعين من المستعمرات تتميز بسهولة عن بعضها البعض على لوحة واحدة.

الشكل 12
الشكل 12. نتيجة الفحص مثال لوحة باستخدام تقنية أجار لينة تراكب. المعروضة هي لويحات تشكلت على سلالة المتفطرة المضيف اللخنية MC 2 155 (ATCC 700084) من قبل اثنين من مختلف فتاهالأعمار: (A) Mycobacteriophage المدمرات و(B) MSSS Mycobacteriophage. تم عزل هذه بالعاثية من قبل الطلاب في المختبر بالطبع UCLA MIMG 103L في ربيع عام 2010. M. اللخنية هو Actinobacterium غير المسببة للأمراض وينتمي إلى عائلة من المتفطرات يتضمن مسببات الأمراض القليلة المعروفة يسبب الأمراض الخطيرة مثل السل (الدرن M.، M. الإفريقي، M. البقرية) والجذام (M. الجذامية). وحضنت حوالي 50 ميكرولتر من التخفيف -2 10 من المدمرات والتخفيف من 10 -3 MSSS مع 500 ميكرولتر كل من M. اللخنية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم يخلط مع MBTA (أجار لينة) وسكب على MHA (أجار الثابت) لوحات. بعد السماح للأجار لينة لترسيخ دون عائق لمدة 20 دقيقة، والمقلوب لوحات وحضنت في C ° 37 لمدة 48 ساعة. لاحظ الأشكال التضاريسية لوحة متميزة تنتجها كل بالعاثية. المدمرات (A) الصغيرة تشكل (متوسط ​​قطرها حوالي 1 مم)، لويحات واضحة مميزة للبالعاثية التحلليبينما MSSS (B) تطور كبير "عين الثور" لويحات مع مراكز واضحة وتحيط بها هالة عكر (متوسط ​​قطرها حوالي 3.2 مم). قد تكون مؤلفة حلقة ضبابي من البكتيريا التي تقاوم العدوى بالعاثية. هذا النمط يختلف عن ذلك التي شكلتها بالعاثية مستذيب، والتي تنتج لوحات عكر.

الشكل 13
الشكل 13. نتيجة مثال باستخدام طبق الاصل لوحة الداخلي. تم اختبار أربعة سلالات الزائفة (P. الزنجارية، P. الكريهة، P. المتألقة، والشتوتسرية P.) في تكرار للنمو على ثلاثة مصادر مختلفة الكربون: أسيتاميد، واللاكتوز جليكاين. (A) لوحة الأساسي هو وسيلة كاملة (YTA) تلقيح مع السلالات الاربع على النحو المشار إليه. بعد الحضانة في C ° 30 لمدة 24 ساعة، وجميع السلالات الاربع تنمو على YTA. وقد استخدم لوحة الأولية لوحة متماثلة على الحد الأدنى من البياناتالمتوسط ​​أبعد (MSA) تستكمل مع مصدر الكربون واحد: أسيتاميد (B)، اللاكتوز (C)، وجليكاين (D). كان لوحة مشاركة في سلسلة إيجابية السيطرة YTA لوحة (E). كما هو موضح، وتظهر سلالات أنماط النمو المتغير التالي الحضانة على لوحات الثانوية. ملاحظة أنه يصعب أحيانا التمييز بين النمو وبصمة من الخلايا. على سبيل المثال، مقارنة بصمة إنشاؤها بواسطة P. الشتوتسرية على لوحات MSA ثلاثة إلى أي نمو على لوحات الثلاثة نفسها من P. الزنجارية. كلاهما نتائج سلبية بالمقارنة مع أنماط النمو التي أظهرتها P. والكريهة P. المتألقة. تم نقل بيد أن جميع سلالات الخلايا تنمو على التحكم لوحة إيجابية تؤكد للجميع لوحات الثانوية في هذه السلسلة. وجدولتها نتائج هذه التجربة في الجدول 1.

YTA
(الابتدائي)
MSA +
أسيتاميد
MSA +
اللاكتوز
MSA +
جليكاين
YTA
(التحكم)
P. الزنجارية + - - - +
P. الكريهة + + + + +
P. المتألقة + + + + +
P. الشتوتسرية + - - - +

الجدول 1. ملخص النتائج الطلاء طبق الاصل. وأشار النمو وعلامة الجمع (+) وأي نمو ممثلة علامة ناقص (-). YTA هو وسيلة كاملة (الخميرة أجار تريبتون) وMSA هو وسيلة الحد الأدنى (الحد الأدنى من الأملاح أجار). واستكملت لوحات MSA مع مصدر واحد كما هو مبين الكربون.

Discussion

الكائنات الدقيقة زراعة ينطوي على عدد من الطرق والطلاء، والتي تتطلب أن يتم الحفاظ تقنية العقيم طوال التلاعب من الخلايا وسائل الإعلام. وصفت خمسة إجراءات مختلفة في هذا البروتوكول. على الرغم من أن تستخدم هذه التقنيات بشكل روتيني الطلاء لمعالجة البكتيريا وبالعاثية، فإنها يمكن أيضا أن تطبق على ثقافة خلايا الثدييات والكائنات الدقيقة حقيقية النواة التي تستخدم عادة في علم الوراثة الجزيئية مثل الخميرة (أي خميرة الخباز، المبيضات البيض، السكيراء pombe)، والطحالب والبروتوزوا ( أي Volvox، المتلحفة، الأميبا، المتناعلة)، والديدان الخيطية (أي Caenorhabditis ايليجانس). هناك أيضا العديد من (وحتى أكثر تعقيدا) أشكال مختلفة من الطلاء كل أسلوب اعتمادا على الهدف التجريبية أو الكائن قيد الدراسة. وبالتالي، فمن المهم أن لا فقط تحديد الأسلوب الأكثر ملائمة لتجربة الكائنات الحية الدقيقة أو هدف معين ولكن أيضا لتكييف هذه المنهجية رقبعة نتائج تجريبية معالجة مناسبة على سؤال البحث أو المشكلة.

بعض من أكثر التطبيقات الحالية للتقنيات الطلاء التي تمت مناقشتها في هذا البروتوكول ينطوي التقدم التكنولوجي الذي تحقق الإنتاجية العالية للنتائج التجارب اكتشاف الفحص والمخدرات. على سبيل المثال، استخدام تسلسل الجينوم مراكز "أسلوب كوباكابانا" لمكتبات استنساخ انتشار الطلاء، والتي هي E. تحول الخلايا القولونية مع البلازميدات تحتوي على شظايا الحمض النووي المستمدة من الجينوم من الكائنات الحية الدقيقة. لأن يتم إعداد العشرات من لوحات كبيرة (وتسمى الصواني الأحيائي) في آن واحد، يتم استخدام لوحة شاكر الآلي لزعزعة الخرز الزجاجي للدفعة كاملة من الصواني. وعلاوة على ذلك، عند اختيار المستعمرات من هذه اللوحات بعد الحضانة، يتم استخدام منتقي مستعمرة الروبوتية لجمع الخلايا من المستعمرات حسب الاقتضاء على اللقاح للمرق LB في 384 جيدا microplates لهذا الفحص الفرز الفائق الإنتاجية، ومبادئ الإجرائية للانتشار فتقنية أواخر تطبيق التكنولوجيا ولكن يسمح أن تتم بشكل مختلف الخطوات وتوسيع نطاقها للسماح لعدد كبير من العينات لتحليلها في وقت واحد وضمن فترة زمنية قصيرة.

التكنولوجيا الحيوية وشركات الأدوية استثمار موارد كبيرة في تطوير تكنولوجيا عالية الإنتاجية لأكثر التقنيات الأساسية في علم الأحياء المجهرية وعلم الوراثة الجزيئي. على سبيل المثال، هناك متعدد القنوات micropipettors لأداء عمليات نقل الصوت ليصل إلى 8 أو 12 عينة في وقت واحد. بل هناك محطات العمل الروبوتية التي مناورة رئيس ماصة 96-قناة! وتشمل هذه الجهود فرق متعددة التخصصات من العلماء، علماء الأحياء الاقتران التي تمتلك الخبرة المنهجية مع المهندسين ومبرمجي الكمبيوتر الذين يمكن تطوير الأجهزة اللازمة لتنفيذ العمليات الميكانيكية المرتبطة التجارب. بغض النظر عن التطبيق البحوث، والهدف المشترك من قبل شركات تطوير هذه التكنولوجيات هو نفسه - لأتمتة laboratoعمليات راي والأدوات والنظم والأدوات، مما يجعلها أقل كثافة اليد العاملة وأكثر كفاءة.

Disclosures

ليس لدي ما تكشف.

Acknowledgements

شكر خاص لساندرز كوري في تصاميم IROC لإعداد الرسوم التوضيحية وكريس Reddi وBhairav ​​شاه في جامعة كاليفورنيا لإنشاء نموذج الثقافات ومساعدة وأرقام. وقدمت التمويل لهذا المشروع من قبل HHMI (HHMI منحة رقم 52006944).

Materials

1. Yeast Tryptone Agar (YTA)

Yeast extract 2.0 g
Tryptone 10.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.0

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use.

2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source

NH4Cl 1.0 g
NH2HPO4•2H2O 2.14 g
KH2PO4 1.09 g
MgSO4•7H2O 0.2 g
Carbon source* 1.0 g
Trace salts solution** 10.0 ml
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.0

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

* Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine.

** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).

FeSO4•7H2O 300.0 mg
MnCl2•4H2O 180.0 mg
Co(NO3)2•6H2O 130.0 mg
ZnSO4.7H2O 40.0 mg
H2MoO4 20.0 mg
CuSO4•5H2O 1.0 mg
CaCl2 1000.0 mg
HCl (0.1 N) up to 1000.0 ml

3. EHA soft agar (0.65 % w/v)

Agar 6.5 g
Tryptone 13.0 g
NaCl 8.0 g
Na Citrate•2H2O 2.0 g
Glucose 3.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

4. EHA hard agar (1.2% w/v)

Agar 12.0 g
Tryptone 13.0 g
NaCl 8.0 g
Na Citrate•2H2O 2.0 g
Glucose 3.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)

100 mM CaCl2 stock* 1 ml
7H9 liquid medium: Neat ** 50 ml
2XTA *** 50 ml

Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution.

* 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution.

** 7H9 liquid medium: Neat

7H9 broth base 4.7 g
40% glycerol stock 5 ml
Distilled water up to 900.0 ml

Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)

7H9 broth base 4.7 g
Agar 1.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C.

6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)

7H10 agar base 19.0 g
40% glycerol stock 12.5 ml
Distilled water 887.5 ml

Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:

AD supplement (pre-warmed to 37°C)* 100 ml
50 mg/ml Carbenicillin ** 1.0 ml
10 mg/ml Cycloheximide ** 1.0 ml

* AD supplement

NaCl > 17 g >
Albumin (Fraction V)> 100 g>
Dextrose (D-Glucose)> 40 g>
Distilled water> up to 2000.0 ml>

Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C.

** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days.

7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)

Tryptone 10.0 g
Yeast extract 5.0 g
NaCl 10.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water up to 1000.0 ml
pH 7.5 at 25°C

Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF).

Table of specific reagents:

Name of the reagent Company Catalogue number
Yeast extract Becton Dickenson 212750
Tryptone Becton Dickenson 211705
Agar Becton Dickenson 214030
NH4Cl Acros Organics 123340010
NH2HPO4•2H2O Sigma-Aldrich 30435
KH2PO4 Fisher Scientific BP 303-500
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 230391
Acetamide Sigma-Aldrich A-0500
Lactose Fisher Scientific L6-500
Glycine Sigma-Aldrich G-7126
FeSO4•7H2O Sigma-Aldrich F8048
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M-3634
Co(NO3)2•6H2O Sigma-Aldrich 230375
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z4750
H2MoO4 Acros Organics 213621000
CuSO4•5H2O Sigma-Aldrich 209198
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
HCl Fisher Scientific A144-212
Cycloheximide Sigma 038K1561
Carbenicillin Cellgro 46-100-RG
NaCl Fisher S271-1
Na Citrate•2H2O Fisher S279-500
Glucose (Dextrose) BD 215530
7H9 broth base BD 271310
7H10 agar base BD 262710
Glycerol Shelton IB15760
Albumin (Fraction V) Fisher S71907
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Teknova X1205
Dimethylformamide (DMF) Sigma D4551
Ethanol Fisher CDA19
Chlorine Bleach Chlorox 02490/06644884
CiDecon (disinfectant) Decon Laboratories, Inc. 8504

Table of specific equipment:

Name of equipment Company Catalogue number Experiment
Metal loops American Educational Products S17352 Streak plating
Disposable plastic loops Fisher 22-363-602 Streak plating
Wooden sticks Fisher 23-400-104 Streak plating
Flat Toothpicks American Educational Products S67859 Streak plating
Turn tables Fisher 08-758Q Spread plating
Glass rods Bellco Glass NC9004380 Spread plating
4 mm glass beads Fisher 11-312B Spread plating
Velveteen cloth Bel-Art Products 09-718-2 Replica plating
Cylindrical block Bel-Art Products 09-718-1 Replica plating

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).
  2. US Department of Health and Human Services (DHHS). Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
  4. Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. Fields Virology. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).
  5. Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens. Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).
  6. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. BioTechniques. 23, 648-650 (1997).
  7. Karam, J. D. Molecular Biology of Bacteriophage T4. ASM Press. Washington, DC. (1994).
  8. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. Fundamental Virology. 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).
  9. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  10. Miller, J. H. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).
  11. Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures. BioTechniques. 39, 188 (2005).
  12. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  14. Sanders, E. R., Miller, J. H. I. Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution. ASM Press. Washington, DC. (2010).
  15. Slonczewski, J. L., Foster, J. W. Microbiology - An Evolving Science. 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).
  16. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).
  17. Wise, K. Preparing Spread Plates Protocols. Available from: http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols (2006).
  18. Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies. BioTechniques. 30, 738-742 (2001).
  19. American Type Culture Collection (ATCC). Available from: http://www.atcc.org/ (2012).
  20. EPA Microbiology Home Page. Available from: http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html (2012).
  21. The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. Available from: http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html (2012).
  22. Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. Available from: http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html (2012).
  23. Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). Available from: http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics (2012).
  24. Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). Available from: http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm (2012).
  25. Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss (2012).
  26. United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. Available from: http://water.epa.gov (2012).
  27. American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html (2012).
  28. Introductory Course in Microbiology. Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html (2012).

Comments

2 Comments

  1. I am not sure why you keep lots of care flaming your clean loop starting at the base and then up to the loop, but in contrast, flame directly the loop when it is full of bacteria.
    My suggestion is to flame always starting from the bottom of the wire and then up to the loop, which in theory may reduce the amount of aerosols produced.

    Reply
    Posted by: Ed K.
    June 8, 2012 - 11:02 PM
  2. Shouldn't the scientist be using gloves?

    Reply
    Posted by: Josh F.
    June 30, 2012 - 3:15 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats