Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Biology
 

Summary

Uma abordagem confiável e útil para detectar modificações das histonas em genes específicos de plantas é descrito. A abordagem combina cromatina imunoprecipitação (chip) e real-time PCR quantitativo. Ela permite a detecção de modificações das histonas em genes específicos, com um papel em diversos processos fisiológicos.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of Histone Modifications in Plant Leaves. J. Vis. Exp. (55), e3096, doi:10.3791/3096 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Estrutura da cromatina é importante para a regulação da expressão gênica em eucariotos. Neste processo, a remodelação da cromatina, a metilação do DNA e modificações covalentes nas caudas amino-terminal de histonas H3 e H4 desempenham papéis essenciais 1-2. H3 e H4 modificações das histonas incluem metilação de lisina e arginina, acetilação da lisina e fosforilação de resíduos de serina 1-2. Essas modificações estão associadas tanto com a ativação do gene, a repressão, ou um estado preparado de gene que suporta a ativação mais rápida e robusta de expressão após a percepção de sinais apropriados (micróbio-padrões moleculares associados, luz, hormônios, etc) 3-7.

Aqui, apresentamos um método para a detecção confiável e sensível de modificações específicas da cromatina em genes de plantas selecionadas. A técnica é baseada na reticulação de (modificado) histonas e DNA com formaldeído 8,9, extração e sonicação da cromatina, cromatina imunoprecipitação (CHIP) com a modificação de anticorpos específicos 9,10, de reticulação de histona-DNA complexos, e gene-específicos em tempo real, PCR quantitativo. A abordagem tem se mostrado útil para detectar modificações específicas histonas associadas C 4 fotossíntese em 5,11 milho e imunidade sistêmica em 3 Arabidopsis.

Protocol

1. Reticulação de material vegetal

  1. Colheita 1-2g de folhas de Arabidopsis (6 a 10 centímetros de diâmetro de roseta) em um tubo plástico de 50 ml e encher-se para 40mL com tampão de reticulação.
  2. Certifique-se de folhas de ficar imersa, por exemplo, encher um direito adaptado esponja do filtro acima da superfície buffer. Em seguida, coloque os tubos em um dessecador.
  3. Vácuo infiltrado por 10min. A cada tubo adicionar 2,5 ml de glicina 2M para parar de reticulação, e inverter os tubos para justificar a dispersão igual de glicina.
  4. Vácuo infiltrado por outro 5min e descarte de fluidos, enquanto o corte de folhas em uma peneira.
  5. Lave as folhas duas vezes com 1L de água em um copo de vidro, em seguida, deixa secar bem com papel toalha.
  6. Coleta de folhas em um tubo de plástico fresco e congelar em nitrogênio líquido. Loja deixa a -80 ° C até o isolamento da cromatina.

2. Isolamento de cromatina

  1. Folhas foram moídas com argamassa e pistilo que foram mantidas em nitrogênio líquido até o uso.
  2. Transferência de pó para um tubo plástico de 50 mL e suspendê-tampão de extração 30mL # 1.
  3. Incubar por 15 min a 4 ° C em um agitador vertical.
  4. Filtrado de suspensão por quatro camadas de miracloth em um tubo plástico de 50 mL fresco.
  5. Rotação por 20min em 2800 xg, a 4 ° C.
  6. Remover o sobrenadante e pellet suspender com um pincel em tampão de extração 1mL # 2. Primeiro adicionar um pequeno volume de tampão # 2, então suspender o pellet com um pincel, em seguida, adicione o restante do buffer.
  7. Transferência de suspensão para um tubo de microcentrífuga 1,5 ml e girar para 10min a 12.000 xg, a 4 ° C.
  8. Enquanto isso, prepare-microcentrífuga 2mL tubos contendo tampão de extração 1,5 ml # 3.
  9. Remover o sobrenadante do tubo girou (passo 2.7) e suspender sedimento em 300 ul de tampão de extração n º 3. Primeiro adicionar um pequeno volume de tampão # 3, suspender pellet com um pincel, e depois adicionar o buffer restante.
  10. Pipeta com cuidado o pellet suspenso (passo 2.9) em cima do tampão de extração 1,5 mL # 3 preparada no passo 2.8. Certifique-se que as duas fases não se misturam. Rotação por 1h a 16.000 xg, a 4 ° C.
  11. Remover o sobrenadante e pellet suspender cromatina com um pincel em 300 ul de tampão de sonicação.
  12. Sonicate cromatina com um sonotrodo, ou em um banho ultra-sônico, para um tamanho de DNA de aproximadamente 400pb. Quando sonicando, fazer cromatina certeza não vai ser aquecido acima de aproximadamente 30 ° C para proteger sensíveis ao calor ligações cruzadas. A duração da sonicação precisa ser determinado experimentalmente, porque varia significativamente entre os dispositivos sonicação diferentes. Para orientação, as definições para dois dispositivos diferentes são fornecidos:

Para sonicação com uma marca Bandelin sonotrodo expor cromatina em tubo de microcentrífuga de 0,6 ml cinco vezes a 20 explosões com configurações de 25% de energia de ciclo, = 50. Ao fazê-lo amostra, fresco após cada 20 rajadas º em banho de gelo.

Para sonicação com um banho de ultra-som Bioruptor Diagenode, preencha banho com água e gelo e sonicate dez vezes por 30 segundos em tubos de microcentrífuga 1,5 ml com ajuste de 'alto'. Depois a cada 30 segundos, as amostras de fresco por mais 30 segundos.

  1. Spin-sonicado amostra para 5min a 16.000 g a 4 ° C para precipitar o material não dissolvido. O sobrenadante pode ser usado diretamente para imunoprecipitação. Alternativamente, as amostras podem ser de choque congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

3. Imunoprecipitação

  1. Prepare os tubos de 2 mL de microcentrífuga contendo proteína-A 40μL. Agarose e 1.8mL de anticorpos de ligação de tampão Adicionar 200μL da preparação da cromatina (passo 2.13).
  2. Incubar os tubos por 1h em um agitador vertical.
  3. Descarte de proteína-A agarose contas e usar o sobrenadante para imunoprecipitação.
  4. Remover uma alíquota de 40μL para determinar a concentração de cromatina ('input').
  5. Adicionar 30μL de proteína-A. Agarose ea quantidade de anticorpos específicos de modificação que está indicado na tabela abaixo de reagentes e equipamentos específicos para suspensão da cromatina 400μL sonicado
  6. Incubar por 2.5h ou durante a noite em um agitador vertical a 4 ° C.
  7. Spin down contas de 2min em 440 x g.
  8. Lavar talão pellet com 900μL de cada tampão de lavagem (veja a lista abaixo). Para cada buffer, contas incubar no buffer de 10min em um agitador vertical a 4 ° C, em seguida, girar para a 2min a 440 xg, elimine o sobrenadante e adicionar o próximo buffer.
    1. Tampão de lavagem pouco sal
    2. Tampão de lavagem de alta sal
    3. LiCl tampão de lavagem
    4. TE tampão de lavagem
  9. Após a última lavagem, remover completamente qualquer solução remanescente.

4. De crosslinking de histonas e DNA, e purificação de DNA precipitado

  1. Adicionar 100μL de reticulação de-buffer para o pellet agarose e amostra 'input' do 40μl a partir do passo 3.4, mix de 5min em um misturador vórtice, as amostras de spin, e incubate a 65 ° C durante a noite.
  2. Purificar DNA com DNA comercial ou kit de purificação de PCR.
  3. Tipicamente 5μl de uma diluição de 1:05 do eluído finais são suficientes para executar convencionais lugar específico quantitativa em tempo real de RT-PCR (RT-qPCR).

5. Tabela de buffers

Buffer de reticulação
Butirato de sódio 10mM
Sacarose 400mm
Tris-HCl, pH 8,0 10mM
β-mercaptoetanol 5mM
Formaldeído 3% (v / v)
Tampão de extração # 1
Butirato de sódio 10mM
Sacarose 400mm
Tris-HCl, pH 8,0 10mM
β-mercaptoetanol 5mM
Inibidor de Protease completo 1x
Tampão de extração # 2
Butirato de sódio 10mM
Sacarose 250mm
Tris-HCl, pH 8,0 10mM
β-mercaptoetanol 5mM
MgCl 2 10mM
Triton X-100 1% (w / v)
Inibidor de Protease completo 1x
Tampão de extração # 3
Butirato de sódio 10mM
Sacarose 1.7M
Tris-HCl, pH 8,0 10mM
β-mercaptoetanol 5mM
MgCl 2 2mM
Triton X-100 0,15% (w / v)
Inibidor de Protease completo 1x
Tampão de sonicação
Tris-HCl, pH 8,0 25mM
EDTA-NaOH, pH 8,0 5mM
SDS 0,5% (w / v)
Inibidor de Protease completo 1x
Tampão de ligação do anticorpo
Tris-HCl, pH 8,0 50mM
EDTA-NaOH, pH 8,0 1mM
NaCl 150mm
Triton X-100 0,1% (w / v)
Tampão de lavagem pouco sal
NaCl 150mm
SDS 0,1% (w / v)
Triton X-100 1% (w / v)
EDTA-NaOH, pH 8,0 2mM
Tris-HCl, pH 8,0 20mM
Tampão de lavagem de alta sal
NaCl 500mM
SDS 0,1% (w / v)
Triton X-100 1% (w / v)
EDTA-NaOH, pH 8,0 2mM
Tris-HCl, pH 8,0 20mM
LiCl tampão de lavagem
Cloreto de lítio 250mm
Nonidet-P40 1% (v / v)
Desoxicolato de sódio 1% (w / v)
EDTA-NaOH, pH 8,0 1mM
Tris-HCl, pH 8,0 20mM
TE tampão de lavagem
EDTA-NaOH, pH 8,0 10mM
Tris-HCl, pH 8,0 1mM
Tampão Decrosslinking
Tris-HCl, pH 6,8 62,5 mm
NaCl 200mM
SDS 2% (w / v)
TDT 10mM

6. Resultados representativos:

Expressão do gene Arabidopsis thaliana defesa PR2 codifica uma β-1,3-glucanase com atividade antimicrobiana 12, foi induzido por benzothiadiazole (BTH), um análogo sintético do ácido salicílico hormônio vegetal 3. Figura 1 demonstra que a ativação de PR2 expressão é associada a um aumento na acetilação de resíduos de lisina na histona H3 e H4 do promotor PR2. Como a densidade diminui nucleosome durante a ativação do gene 13, os valores de acetilação das histonas foram normalizados para o sinal obtido com um anticorpo para uma região invariante de 3 histonas.

Figura 1
Figura 1 BTH induz acetilação das histonas no promotor PR2 em Arabidopsis. As plantas foram tratadas com 100μM BTH ou um controle de pó molhável. Após 72h, foram coletadas folhas e cromatina foi isolado. O sinal obtido após precipitação com acetilação anticorpos específicos (como indicado na figura) foi normalizada para o sinal obtido por precipitação com um anticorpo para um domínio invariante de histona H3. Cromatina precipitado foi quantificada por RT-qPCR. Dados são padronizados para níveis de modificação das histonas na ausência de tratamento BTH.

Discussion

Etapas mais críticas no protocolo são a reticulação de DNA e histonas, o tipo ea quantidade de material foliar, moagem do material, ea sonicação de cromatina. Para uma discussão mais detalhada dessas questões, ver refs. 9 e 10.

Sonicação e crosslinking:

É importante para interromper cromatina durante a sonicação a fragmentos de cerca de 400pb. Sonicação exaustiva irá destruir cromatina interrompendo DNA e histonas, enquanto que sonicação insuficiente vai deixar fragmentos de cromatina longo. Estes afetam a especificidade do método, porque modificações das histonas distal do locus testados não podem ser discriminados de alterações local. Eficiência sonicação é melhor testado através da recolha de cromatina 20μL de amostras de DNA antes e depois sonicação, de reticulação e histonas, isolando o DNA e determinar o comprimento do DNA cortado por eletroforese em gel de agarose. RNAse deve ser adicionado às amostras antes de eletroforese, porque a preparação da cromatina ainda contém grandes quantidades de RNA nesta fase de purificação que pode interferir com a visualização de DNA fragmentado. As amostras são úteis para imunoprecipitação da cromatina se o DNA de cromatina não-cortado é maior do que 10kbp, enquanto que o DNA de cromatina sheared forma uma mancha com intensidade máxima do sinal em torno de 400pb de DNA.

Rotineiramente usamos 3% (v / v) de formaldeído para crosslinking cromatina em folhas intactas, mas 1% (v / v) de formaldeído pode ser suficiente na maioria dos casos. Em nossas mãos, as concentrações de formaldeído baixo permitem menor tempo de sonicação e sinais de fundo em reações consequente PCR. No entanto, quantidades insuficientes de formaldeído muitas vezes resultam em baixa reprodutibilidade do sinal de PCR entre os experimentos independentes. Isso pode ser devido a penetração insuficiente de folhas com formaldeído em baixas concentrações. Certifique-se de trocar o seu estoque de formaldeído com freqüência como o composto tende a polimerizar com o tempo. As soluções de formaldeído são estáveis ​​apenas para cerca de um mês, e este período é prolongado por quase estabilização metanol. É aconselhável a análise de diferentes concentrações de formaldeído durante a configuração de condições experimentais.

Quantidade de material vegetal e de moagem:

É importante para se infiltrar pequenas quantidades de material foliar em um grande volume de tampão para evitar que as folhas grudem umas nas outras. Folha furando muitas vezes resulta em infiltração insuficiente de formaldeído. Além disso, o material vegetal muito vai bloquear os poros do tecido miracloth. A eficiência de moagem depende consideravelmente usando um almofariz e um pilão, com o ajuste perfeito. Rotineiramente moer com nitrogênio líquido refrigerado pilão na ausência de nitrogênio líquido adicional de três vezes por 50 segundos até que o material é moído para um pó fino.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Ciência (DFG) ea Iniciativa de Excelência dos governos federal alemão e do Estado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein-A-Agarose Roche Group 11 134 515 001 depends on the antibody class
Protein-G-Agarose Roche Group 11 243 233 001 depends on the antibody class
Anti-hyperacetyl-H4 EMD Millipore 06-946 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K5 EMD Millipore 07-327 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K8 EMD Millipore 07-328 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K12 EMD Millipore 07-595 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K16 EMD Millipore 07-329 we used 5μL
Anti-acetyl-H4K18 EMD Millipore 07-354 we used 1μL
Anti-acetyl-H3K9 EMD Millipore 07-352 we used 5μL
Anti-acetyl-H3K14 EMD Millipore 07-353 we used 1μL
Anti-trimethyl-H3K4 Diagenode pAB-003-50 we used 5μL
Anti-dimethyl-H3K4 EMD Millipore 07-030 we used 5μL
Anti-monomethyl-H3K4 Abcam ab8895 2,5 -10μL
Anti-H3 Abcam ab1791 we used 1μL to check histone density
Bioruptor Diagenode UCD-200 TO
Sonotrode MS72 Bandelin
Miracloth Calbiochem 475855
Complete Protease Inhibitor Roche Group 11836145001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
  2. Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
  3. Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
  4. Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
  5. Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
  6. Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
  7. Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
  8. Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
  9. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
  10. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
  11. Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
  12. Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
  13. Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics