أخذ البصمات من الحمض النووي المتفطرة الجذامية سلالات باستخدام متغير كرر جنبا الى جنب رقم (VNTR) -- تحليل قطعة الطول (FLA)

Immunology and Infection
 

Summary

الجذام ، والناجمة عن

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

دراسة انتقال الجذام أمر صعب بصفة خاصة منذ عامل المسبب للمرض ، المتفطرة الجذامية ، لا يمكن تربيتها في المختبر. المصدر الوحيد للبكتيريا ومرضى الجذام ، والمدرع المصابة تجريبيا والفئران عارية. وبالتالي ، فإن العديد من الأساليب المستخدمة في علم الأوبئة الحديثة ليست متاحة لدراسة مرض الجذام. على الرغم من عالمية واسعة النطاق للمخدرات برنامج العلاج لمرض الجذام التي تنفذها منظمة الصحة العالمية 1 ، يظل الجذام متوطن في كثير من البلدان مع ما يقرب من 250000 حالة جديدة كل عام. (2) M. كامل الجذامية تم تعيين الجينوم 3،4 وتم تحديد مواضع كثيرة وكرر شرائح أزواج القاعدة 2 أو أكثر (تسمى الصغرى وminisatellites) 5 سلالات السريرية م. قد تختلف الجذامية في عدد من القطاعات جنبا إلى جنب المتكرر (يكرر بالترادف قصيرة ، STR) في العديد من هذه المكاني. استخدمت جنبا إلى جنب 5،6،7 متغير عدد تكرار (VNTR) 5 تحليل للتمييز بين سلالات مختلفة من عصيات الجذام. بعض مواضع تبدو أكثر استقرارا من غيرها ، والتي تبين الاختلاف في الأرقام أقل أكرر ، في حين أن آخرين يبدو أن التغيير بسرعة أكبر ، وأحيانا في نفس المريض. في حين أن تقلب VNTRs معينة قد نشأت أسئلة تتعلق ملاءمتها لكتابة سلالة 7،8،9 ، فإن البيانات تشير إلى أن تحليل الناشئة مواضع متعددة ، والتي تتنوع في استقرارها ، ويمكن استخدامها كأداة الوبائية القيمة. وقد استخدمت عدة VNTR موضع التحليل (MLVA) 10 لدراسة تطور وانتقال مرض الجذام في عدة بلدان منها الصين 11،12 ، وملاوي 8 ، 10،13 الفلبين ، والبرازيل 14. MLVA ينطوي على خطوات متعددة. أولا ، يتم استخراج الحمض النووي DNA الجرثومي مع الأنسجة السريرية المضيف الخزعات أو شق الجلد مسحات (SSS). تتضخم ثم 10 والمكاني المطلوب من الحمض النووي المستخرج من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وتستخدم أجهزة الاشعال Fluorescently المسمى لمواضع مختلفة 4-5 في رد الفعل ، حيث يجري تضخيم 18 في مواضع ما مجموعه أربعة ردود الفعل ، ولا يجوز إخضاع 10 المنتجات PCR لهلام إستشراد agarose للتحقق من وجود شرائح الحمض النووي المطلوب ، ومن ثم المقدمة لتحليل طول جزء فلوري (FLA) باستخدام الكهربائي الشعري. passaged الحمض النووي من المدرع البكتيريا المعروفة مع عدد من النسخ لتكرار كل مكان يستخدم كعنصر تحكم إيجابية. ويتم فحص ثم chromatograms FLA الذروة باستخدام الماسح الضوئي وبرامج يتم تحويل جزء من طول عدد النسخ VNTR (أليل). أخيرا ، يتم تحليل VNTR النسخ المتنوعة لأنماط ، ويمكن استخدامها عند دمجها مع البيانات السريرية المريض لتتبع توزيع أنواع التوتر.

Protocol

والغرض من هذه المقالة هو تقديم الفيديو لمحة عامة عن سير العمل جنبا إلى جنب مع تنسيق البيانات وتفسيرها للباحثين التي قد يكون مجرد بداية هذا النوع من العمل (الشكل 1). وهو يتضمن مظاهرة تقنيات وبروتوكولات مبسطة ونصائح عملية وصفها في الأعمال المنشورة سابقا. 5،10

تدفق العمل العامة والمختبرات :

يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 3 مناطق عمل منفصلة لهذا النوع من البحوث. وينبغي أن يكون المختبر 1) في منطقة ما قبل PCR PCR مع غطاء (نظيف مربع الهواء أو منطقة معزولة العمل) لإعداد التمهيدي (تمييع ، وإعداد قسامة والاختلاط) ، 2) منفصلة الحيوي الآمن مجلس الوزراء للتداول وبالإضافة إلى ذلك الحمض النووي لمخاليط PCR ، و 3) منطقة عمل آخر - PCR لإعداد وتحميل المواد الهلامية وإعداد العينات للFLA. يجب أن تبقى الاشعال وعينات من الحمض النووي في الثلاجات والبرادات منفصلة. تلوث التمهيدي هي واحدة من المشاكل الرئيسية والمستمرة في معظم العمل المخبري من هذا النوع. يجب أن لا تستخدم لماصات الاشعال ويمزج PCR تستعمل لالحمض النووي. ينبغي أن تكون هناك مجموعات منفصلة من الماصات لمرحلة ما قبل PCR ، PCR ومجالات العمل بعد PCR. عموما ، يمكن للمرء أن الباحث عملية عينات 12-18 في فترة 12-24 ساعة باستخدام معيار المعدات المختبرية.

قبل بداية كل مرحلة من مراحل العمل :

  • ارتداء معطف المختبر وقفازات. يجب ارتداء القفازات في أي وقت يجري التعامل معها العينات البيولوجية والشعائل والحمض النووي وبروميد إيثيديوم. تغيير القفازات بشكل متكرر.
  • عمل في مجلس الوزراء هود PCR ، والسلامة البيولوجية لمجلس الوزراء أو تنظيف منطقة العمل.
  • استخدام ورقة أو لوحة جديدة مقاعد البدلاء.
  • إعداد أوعية نفايات مناسبة للسوائل ونصائح ماصة.
  • يمسح أسفل مع غطاء محرك السيارة من الداخل وماصات PCR مع الايثانول 70 ٪.
  • تعيين ماصات الموضوع ومجال العمل للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة قبل ان تصل PCR. (الأشعة فوق البنفسجية السطحية الملوثة crosslinks DNA الضوء.)
  • دائما استخدام الهباء نصائح ماصة للوقاية من المواد التي تحتوي على الحمض النووي ، والاشعال والكواشف PCR.
  • أنابيب الطرد المركزي أي / شرائط / لوحات تحتوي على السائل قبل الافتتاح لمنع هروب الهباء الجوي وانتقال التلوث عن طريق المناولة.

1. م. إعداد DNA الجذامية

السريرية التي تحتوي على عينات م. الجذامية يتم الحصول عليها من مرضى الجذام الذين يزورون عيادات الجلد. قد تكون عينات التشخيص الروتيني لكمة خزعات الجلد ، ومسحات الجلد أو مسحات فتحة الأنف. عموما ، لكمة أو الخزعات مسحات الجلد الشقوق هي أفضل لعلم الأوبئة الجزيئية لأنها نظيفة وتحتوي على كميات كافية من م. الجذامية. يجب الموافقة على استخدام هذه المواد لأغراض البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

  1. الحفاظ على عينات الخزعة أو شق الجلد مسحة في قارورة المسمار الحد الأقصى مع 1 مل من الايثانول 70 ٪.
  2. الطرد المركزي كل عينة في جهاز للطرد المركزي متغير مقاعد البدلاء في أعلى سرعة 12000 XG لمدة 15 دقيقة.
  3. إزالة طاف ووضعه في أنبوب microcentrifuge. إذا لزم الأمر ، قد يكون من المفيد لهذه العينات إعادة الطرد المركزي واستعادة الأنسجة إضافية أو الحمض النووي في وقت لاحق.
  4. إضافة مخزنة 500 ميكرولتر من الفوسفات الملحي (PBS) إلى عينات الأنسجة وينقع لمدة 1 ساعة المتبقية لتبادل المواد الحافظة الإيثانول وترطيب العينة.
  5. الطرد المركزي العينات في جهاز للطرد المركزي في المقعد العلوي 12000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل حل PBS في حاوية النفايات تملأ جزئيا مع محلول مطهر.
  6. استخراج الحمض النووي البكتيري باستخدام الدم DNEasy Qiagen ومجموعة الأنسجة التالية للمبادئ التوجيهية المقررة.
  7. وينبغي أن الحمض النووي المستخرج aliquoted الى 4 قوارير. 2 في مخزن aliquots -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل إذا / عندما يكون مطلوبا من استنساخ نتائج الاختبار أو عندما تصبح التكنولوجيات الجديدة المتاحة. متجر واحد في قسامة -20 درجة مئوية واحدة في 4 درجات مئوية لاستخدام أكثر إلحاحا.
  8. فإنه من الحكمة أن يعد "فارغة استخراج" جنبا إلى جنب مع عينات الأنسجة. تتعرض فارغة لجميع العلاجات نفسها المذكورة أعلاه ولكن دون أن يتم تنفيذ الأنسجة. PCR فارغة استخراج جنبا إلى جنب مع عينات من المرضى لضمان أن تقنية استخراج المشغل صحيحة وأنه الكواشف هي خالية من التلوث الحمض النووي.

2. التحضير التمهيدي

  1. يتم سرد الاشعال للمواضع التي هناك نوع السلالة الأكثر شمولا البيانات في الجدول رقم 1. يتم الجمع بين أربعة أو 5 الاشعال لPCR متعددة. واحد التمهيدي لكل مكان يحمل علامة على بعد 5 'الكيميائية الفلورية التي سيتم الكشف عنها خلال تحليل جزء الشعرية الكهربائي بطول (FLA).
  2. لكل تركيبة متعددة PCR ، هي الجمع بين المعلمة والتمهيدي التمهيدي عكس المقابلة لكل مكان في أنابيب إيبندورف منفصلة : الاشعال قدما في أنبوب واحد ، عكس في بلد آخر. مستعدون الاشعال الأسهم كما 100μM حلول (الشكل 2A) ، وجزء منهاغير المخفف 10X إلى تركيز من 10 ميكرومتر به الشركة المصرية للاتصالات (1X تريس - EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0). يتم تخزين aliquots المتبقية من الحلول ميكرومتر التمهيدي 100 في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  3. يتم خلط كميات متساوية من كل التمهيدي 10 ميكرومتر الناتج النهائي في تركيزات 2μM كل التمهيدي. عندما يتم إضافة مجموعات التمهيدي إلى خليط PCR (الجدول 3) ، وتركيز النهائي لكل التمهيدي ينخفض ​​إلى 0.2 ميكرومتر.

عندما تتم إضافة الاشعال مجتمعة إلى الخلائط PCR (الجدول 3) ، وتركيزات النهائية لإسقاط 0.2μM لكل منهما.

3. تضخيم الحمض النووي البكتيري باستخدام PCR المتعدد

  1. PCR الإعداد
    • سجل عدد العينات التي سيتم استخدامها ، وإعداد ورقة عمل مع الكواشف المطلوبة وأحجامها قبل جمع المواد البلاستيكية والمواد الضرورية الأخرى.
    • تسمية أنابيب معقمة / شرائط / لوحات لاستخدامها لPCR مع أرقام العينة. تذكر أن تشمل الضوابط الإيجابية والسلبية.
  2. مسح أسفل thermocycler بمحلول التنظيف (مثل التطهير ELIMINase) والبرنامج وفقا لجدول رقم 2. تغيير القفازات بعد التنظيف وقبل التعامل مع أجهزة الاشعال والكواشف الأخرى.
  3. إعداد PCR Mastermix فقا للجدول (3) وتسمية PCR الأنابيب / شرائط / لوحة مع مزيج التمهيدي وأعداد العينات التي سيتم استخدامها.
  4. 18μl قسامة من Mastermix لكل أنبوب عينة المسمى PCR أو جيدا. تغيير القفازات.
  5. مسح أسفل منفصلة السلامة البيولوجية مجلس الوزراء وماصات مع الايثانول 70 ٪ للمساعدة في تنظيف وتطهير منطقة العمل والأدوات ، ثم يخضع لمجال العمل وماصات للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقائق لعبور الارتباط أي ملوثات الحمض النووي. تغيير القفازات.
  6. في مجلس الوزراء الحيوية الآمنة والنظيفة ، إضافة 2μl من القالب الحمض النووي للMastermix في كل أنبوب PCR / لوحة جيدا للحصول على الحجم الكلي لل20μl (الشكل 2B). استخدم ماصة نصائح الهباء الوقاية لجميع المواد السائلة.
  7. أنابيب الطرد المركزي PCR / شرائط / لوحات لفترة وجيزة لخلط محتوياتها.
  8. وضع أنابيب العينات / شرائط / لوحة في thermocycler وبدء البرنامج PCR.
  9. عند اكتمال البرنامج ، وإزالة المنتجات من thermocycler وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الكهربائي.

4. هلام إستشراد المنتجات PCR

* لقد كان هذا البروتوكول القياسي لسنوات عديدة ، وخطوة اختيارية التي يمكن استخدامها إذا كان هو المطلوب من المنتجات PCR التأكيد قبل إرسالها للFLA.

  1. في منطقة منفصلة عمل ما بعد PCR ، وإعداد جيل agarose 2 ٪. استخدام 2.0g agarose powder/100ml من 1X TBE (تريس / البورات / EDTA) حل العازلة في قارورة. حرارة الخليط لحوالي 1،5-2 دقيقة في فرن الميكروويف. دوامة محتويات والتدفئة مرة أخرى إذا لزم الأمر بحل agarose. تبرد قليلا وصب جل في نموذج باستخدام مشط مع آبار كافية للعينات.
  2. إزالة المنتجات PCR من 4 درجة مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية.
  3. 2 5μl مزيج من الناتج PCR مع 1μl - 0.5 5X 6X أو هلام العازلة تحميل (العازلة تحميل يتوفر من شركات مختلفة ، أو قد يكون الخلط في المختبر. صفات متوفرة على الانترنت.)
  4. تحميل آبار الجل مع مزيج 6μl العازلة عينة / التحميل. إضافة إلى واحد سلم الجزيئية جيدا (ويفضل سلم غليان 20).
  5. تشغيل في هلام 100V لحوالي 90 دقيقة.
  6. تنقع في محلول بروميد هلام إيثيديوم عن 15-30 دقيقة ، ثم في الماء المقطر عالى النقاء لمبلغ مساو من الوقت.
  7. صورة هلام بينما يطبق ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ينبغي أن تكون هناك عصابة لكل من شرائح الحمض النووي 4-5 في الجمع بين (الشكل 3).
  8. التخلص من هلام وفقا لسياسة المؤسسة المواد الخطرة. ويمكن استخدام محلول بروميد إيثيديوم عدة مرات قبل التخلص السليم.

5. تحضير عينات للتحليل طول القطعة (FLA)

  1. في أنبوب إيبندورف النظيفة ، وإعداد خليط الرئيسية التي تحتوي على 12μl من مرحبا دي حل formamide من قسامة الطازجة و0.3μl من -500 GeneScan القياسية التحجيم ليز (سواء من النظم البيولوجية التطبيقية) لكل عينة لفحصها. (مرحبا ، دي formamide يبدل طبيعة كيميائيا حمض النووي قبل الشعرية الكهربائي ، مما يلغي الحاجة للتدفئة.) باستخدام 96 لوحة ضوئية جيدا رد فعل الجودة ، 12.3μl قسامة من مزيج formamide - ليز إلى كل بئر تستخدم لعينات وتعيين لوحة جانبا.
  2. عمل خريطة لوحة تشير السجلات التي عينة من الحمض النووي في كل بئر (الشكل 4A).
  3. باستخدام أنابيب / شرائط أو لوحة 96 - جيدا ، إضافة 1μl من الناتج PCR (من الجزء 3) إلى 59μl من نوعية المياه PCR خلق تخفيف 1:60 من المنتج PCR. ويمكن تعديل التخفيفات على أساس قوة الإشارات من خلال البيانات أو FLA سطوع العصابات هلام. أقل من التركيزات قد دناتكون كافية (1:120 أو 1:180).
  4. إضافة 1μl للمنتج PCR المخفف للتصحيح بشكل جيد في لوحة تحتوي على خليط formamide - ليز.
  5. ويمكن تعزيز الكفاءة والسرعة إلى حد كبير إذا تم أيضا PCR في صفيحة 96 - جيدا. ويمكن ببساطة سطر واحد حتى 3 لوحات من هذا القبيل في التسلسل : 1 بلايت مع منتجات PCR ، اللوحة 2 مع الماء المعقم للتخفيف من المنتجات PCR ، وبلايت 3 مع formamide وسلم التحجيم لتحليل طول القطعة. ماصة الأقنية يسمح لعملية سريعة التحضير FLA.

تحليل عينة عن طريق محلل الوراثية

  1. معايرة محلل الوراثية للكشف عن flurophores تطبيقها في التعليم الخاص بالشركة المصنعة. تأكد من استخدام صبغة بين مجموعة تضم ليز.
  2. تجديد مياه الشطف الحاويات وإضافة جديدة الاحتياطي قيد التشغيل مع EDTA (1X) (النظم البيولوجية التطبيقية) لغرف عازلة.
  3. إضافة السيليكون الشق قبل الحاجز إلى لوحة لوحة ومكان في علبة عقد تصميم. اضغط على "صينية" الموجود في محلل الوراثية لجلب المهاجم الاوتوماتيكى. درج على مكان الاوتوماتيكى وإغلاق الباب أمام محلل الوراثية.
  4. إنشاء أو استيراد جدول بيانات للتحليل. ملفات وارداتها يكون ملحق المعاهدة. والمفصول في الشكل. يمكن تعديل الملفات في Excel (مايكروسوفت) أو برامج مماثلة.
  5. يتم حقن هذه العينات في (طول 50 سم ، POP - 7 البوليمر) الشعرية من خلال تطبيق الجهد ضخ 1.6 كيلو فولت لمدة 15 ثانية. ويدير الكهربائي الشعري في جهد 15 كيلو فولت عند درجة 60 لل1800 ثانية. العملية كلها تستغرق حوالي 45 دقيقة.
  6. مرة واحدة في تشغيل كاملة ، يتم تحويل البيانات لتحليل كل عينة إلى ملفات بملحق FSA. وتوضع في طبق مجلد ملف (الشكل 4B). كل ملف البيانات هو ما يقرب من 100 كيلو بايت في الحجم ويمكن تخزينها على محرك أقراص محمول أو مضغوط وعبر البريد الالكتروني. يمكن الاطلاع على ملفات البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة ، مثل GeneMapper ABI أو ماسح الذروة.

6. تحليل النتائج طول القطعة

  1. تحليل البيانات من الفلورسنت الكهربائي الشعري يتطلب برامج خاصة. إذا كان مثل هذه البرامج ليست متاحة ، انتقل إلى الموقع النظم البيولوجية التطبيقية وتنزيل ماسحة الذروة. البرنامج مجاني ويعمل بشكل جيد جدا. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab؟cmd=catNavigate2&catID=603624
  2. ماسح بيك فتح و "البدء في المشروع الجديد" تليها "إضافة ملفات". تحميل المحدد. FSA ملفات البيانات في البرنامج ، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية.
  3. حدد (تمييز) و "تحليل" جميع الملفات المحملة. تأكد من تعيين كل عينة إلى الحجم القياسي ": GS500 (-250) وتحليل الأسلوب : تحجيم رد - PP اضغط على" تحليل ".
  4. دراسة حجم أزواج في قاعدة كل ذروة الملونة التي تنتجها شظايا الحمض النووي في العينات.
  5. سجل كل قيمة الذروة في حجم قاعدة أزواج وقارنه إلى ذروة سيطرة الإيجابية.
  6. وينبغي أن يصل إلى ذروته في عينات مراقبة إيجابية مقارنة مع العطف أعداد الأزواج الأساسية والأرقام المقابلة من يكرر بالترادف المدرجة في الجدولين 4-7.
  7. تحديد عدد شرائح قصيرة تكرار موجودة جنبا إلى جنب في كل أليل العينة مقارنة مع مراقبة إيجابية. نستخدم NHDP63 التسلسل الذي تم لعدد من النسخ في كل مكان VNTR يجري بحثها. 4
  8. إدخال البيانات المسجلة في جدول مقارن للتحليلات و / أو الرياضية. VNTR "بصمات" أو النسخ المتنوعة التي هي سلاسل من الأليلات في مواضع المعرفة التي هي سمة من م. سلالة الجذامية.

7. ممثل النتائج

سوف الكهربائي للهلام المنتجات PCR إنتاج نأمل الفرقة لكل مكان في الجمع التمهيدي (الشكل 3). في الشكل 3 ، وهناك 2 المقاطع لالجل : القسم العلوي والمختلط 1 PCR العينات وعينات الجمع بين الجزء السفلي 2. كل قسم يحتوي على 20 قاعدة الزوج سلم الجزيئية ، تليها المنتجات PCR تم الحصول عليها من عينات المرضى 8. 1 تركيبة لديها أيضا السيطرة السلبية وأخيرا السيطرة الايجابية (NHDP63 سلالة). (وكانت مجموعة ضوابط ل2 على هلام مختلفة.) لاحظ أن معظم العينات عرض بوضوح 5 العصابات ، 1 لكل مكان في الجمع. في بعض الحالات ، قد يكون الفرق متقاربة من بعضها البعض لتظهر كما مواضع منفصلة مما أدى إلى ظهور عصابات 4 فقط.

يتم سرد الأحجام amplicon المتوقع في الجدول 1. مختبر لدينا يستخدم NHDP63 سلالة M. كما الجذامية تحكم إيجابية. وقد تم دراسة نوعين من شرائح أكرر : مواضع الصغرية (مع تكرار قاعدة 1-5) ومواضع الساتل الصغير (مع شرائح أكبر من 5 أزواج قاعدة تتكرر عدة مرات).

تفسير البيانات من الملفات الكهربائي الشعري يعتمد على معايير 2 : وتفتيت الحمض النووي الداخلية التحجيم قياسية تسمى GeneScan - 500LIZ (ABI) ، والسيطرة الخارجية عينة من الحمض النووي البكتيري إيجابية تضخيمها.

وchromatograms FLA ، عرضها باستخدام البرمجيات ماسح الذروة ، يمكن أن ينظر في الأرقام 5B ، 5A و 6.

ذروة ماسح توفر بيانات عن حجم amplicon (محور س في أزواج القاعدة) وقوة الإشارة (المحور الصادي). (الشكل 5B) بيانات إضافية عن منطقة الذروة ، وما إلى ذلك تتوفر أيضا ، على الرغم من ارتفاع حجم وقيم الذروة هي الأكثر أهمية. عادة ما تعتبر قمم أقل من 100 وحدة في الارتفاع ضعيفة جدا إشارة إلى أن تكون موثوقة.

الشكل 6 يقارن السيطرة الايجابية (NHDP63) واثنين من عينات المرضى ، مما يدل على تفاوت في عدد من تكرار جنبا إلى جنب في مكان (GTA) 9. في السيطرة الإيجابية ، فإن التسلسل (GTA) تتكرر 10 مرات. وتم التحقق من VNTR NHDP63 وحجم amplicon من خلال التسلسل الجيني. 4 المريض PCR amplicon هو 3 غليان أصغر من السيطرة إيجابية تشير هناك وحدات تكرار سوى 9 ، في حين أن المريض لديه 6 amplicon التي هي 3 الغليان أكبر من الكشف عن 11 NHDP63 يكرر من (GTA). 2 المريض كان المؤشر منخفضا البكتيرية (BI) مع قليل أو بدون تكرار PCR الحمض النووي ، وبالتالي عدم وجود إشارة FLA.

صعوبة في تفسير البيانات FLA يحدث أحيانا نتيجة "التأتأة". خلال تفاعل PCR ، قد تنتج الحمض النووي بوليميريز الشظايا التي هي 1 أو أكثر يكرر أطول أو أقصر من أليل المصدر. وعادة ما يتم التعرف على هذه كما قمم أقل ارتفاع المحيطة ذروة الرئيسية. وأنها ستكون "على سلم' وهذا هو ، على العدد الصحيح من الأزواج الأساسية للجزء تكرار أكبر أو أصغر من ذروة الرئيسية. والنتيجة هي عائلة من قمم من نفس اللون. الشكل 7 يظهر هذا الموضع مع (TA) 10.

واجه صعوبة أخرى في بعض الأحيان مع FLA ينطوي على "+ A" أو "A - المخلفات. ، الذي يضيف بوليميريز الحمض النووي قاعدة واحدة [عادة الأدنين (A) إلى نهاية 3' من الجزء نسخ الحمض النووي هذا يظهر في FLA بوصفها ذروة إلى ذروة حق الرئيسي أو تلعثم أن الزوج هو 1 قاعدة أكبر من الذروة التي بلغها المجاورة كما هو مبين في الشكل 8. لا ينبغي الخلط بينه وبين ذروة الرئيسي أو تلعثم. تعتبر ذروة أعمالها الرئيسية والذيل نوع واحد. الذيل A - لا يغير من عدد من يكرر VNTR. (تم تصميم بعض مجموعات بوليميريز الحمض النووي على وجه التحديد لتعزيز A - المخلفات من أجل الحد من تأثير هذا الخلط. النهوض الشامل. A - المخلفات يميل إلى إنتاج الذروة واحدة بدلا من زوج من قمم).

استخراج الحمض النووي وتحتوي على كل المنتجات PCR M. الجذامية والحمض النووي للانسان ، ولكن مع استثناء (TA) 18 ، والاشعال ومحددة بما فيه الكفاية أنها تضخيم الحمض النووي البكتيرية فقط ، وهناك القليل أو لا تضخيم الحمض النووي البشري. (TA) 18 تنتج في كثير من الأحيان إلى ذروتها في أزواج قاعدة 242 التي يتم من الحمض النووي البشري وليس ينظر في عينات الحمض النووي passaged المدرع (الشكل 9).

العمر الافتراضي للأجهزة الاشعال جيدة عموما شريطة بقائهم في -20 درجة مئوية ، أزالت فقط للاستخدام الفوري ، ثم تخزينها في 4 درجات مئوية حتى استهلاكها. وينبغي أن يكون مستقرا في الاشعال 4 أسابيع 1-2 درجة مئوية لمدة. على الرغم من صنع تركيبات التمهيدي لPCR نوعا ما تستغرق وقتا طويلا ، فمن المستحسن أن تكون مستعدة بما فيه الكفاية مزيج التمهيدي فقط للاستخدام الفوري. تركيبات التمهيدي يبدو أن تتحلل إلى حد ما عند تخزينها لفترات طويلة.

وينبغي aliquoted TE أكبر من الأسهم ، ويمكن تخزينها aliquots المجمدة أو في درجة حرارة الغرفة. أكبر من aliquots 400μl - 200 هي جيدة لتمييع الأسهم التمهيدي مجففة أو مركزة (الشكل 2A). أصغر من 10-50 aliquots ميكرولتر مفيدة لاستكمال وحدات التخزين من تركيبات التمهيدي 3 و 4. TE غير مكلف ، وينبغي التخلص منها بعد الاستخدام aliquots.

مجموعات انزيم متعدد مكلفة جدا ويجب أن تبقى مجمدة (-20 درجة مئوية) حتى الاستخدام. بعد إعداد PCR ، ينبغي إرجاع أي حلول متعددة غير مستخدمة على الفور إلى 4 درجات مئوية. وملتيبليكس Qiagen الصغيرة PCR كيت يأتي مع مزيج من 3 أنابيب متعددة ، كل منها يحتوي على 0.85ml (850μl) من الحل ؛ كافية لتقارير إتمام المشروعات حوالي 65-70.

عموما ، فمن الأفضل لتجنب تكرار ، والتغيرات في درجة الحرارة الكبرى للمواد المستخدمة في هذا النوع من العمل بما في ذلك المختبرات الاشعال ، وعينات من الحمض النووي وحلول عدة متعددة. يجب أن يتم تخزين جميع المواد في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها ، وتحفظ بعد ذلك في 4 درجات مئوية حتى استهلاكها. يجب تخزين على المدى الطويل من الحمض النووي ان تكون على -80 درجة مئوية.

يجب تعقيمها جميع المواد التي تحتوي على قضى الأنسجة ، الاشعال و / أو الحمض النووي والتخلص منها عندما لم تعد هناك أي استخدام. يعامل جميع العيناتيجب أن يعامل مع إيثيديوم بروميد formamide أو أنها نفايات خطرة والتخلص منها وفقا لسياسة المؤسسة المواد الخطرة.

الجدول 1
الجدول رقم 1 : أحجام Amplicon لسلالة NHDP63

الجدول 2
الجدول 2 : دراجات للمعلمات PCR VNTR

الجدول 3
الجدول 3 : إعداد PCR

الجدول 4
الجدول 4 : دعوات لأليل المختلط 1

الجدول 5
الجدول 5 : دعوات لأليل المختلط 2

الجدول 6
الجدول 6 : يدعو لأليل المختلط 3

الجدول 7
الجدول 7 : دعوات لأليل المختلط 4

الشكل 1
الشكل 1 : VNTR - FLA مخطط تدفق العملية

الشكل 2
الشكل 2. (أ) إعداد الاشعال المختلط 1 العليا (إيبندورف مجاملة صورة أنبوب www.clker.com ). (ب) PCR إعداد (تقارير إتمام المشروعات لمدة 8) (إيبندورف مجاملة صورة أنبوب www.clker.com)

الشكل 3
الشكل 3. Agarose هلام من 1and تركيبات الحمض النووي VNTR 2 منتج PCR

الشكل 4A
الشكل 4B
الشكل 4. (أ) FLA خريطة اللوحة (ب) FLA ملفات البيانات : *. FSA

الشكل 5A
الرقم 5B
الشكل 5. (أ) FLA Chromatogram السيطرة الإيجابية (NHDP63) لمواضع المختلط VNTR 1 (ب) بيانات عن حجم ماسح الذروة amplicon وفرة من (GTA) 9

الشكل 6
الشكل 6. مقارنة عينات PCR إلى PC (NHDP63) لموضع (GTA) 9

الشكل 7
الشكل 7. الرئيسية وقمم التعتعة ل(TA) 10

الشكل 8
الشكل 8 : + (A - الذيل) قمم قمم بجوار الرئيسية أو تلعثم.

الشكل 9
الرقم 9 : (TA) 18 الذروة الرئيسي ، وقمم التعتعة الإنسان الذروة الحمض النووي

رقم 10A
الرقم 10B
الرقم 10 : (أ) من سلالة محمد التمايز يستند على بيانات الجذامية VNTR التمايز سلالة (ب) من م. بناء على بصمة الحمض النووي الجذامية MLVA

Discussion

جمع عينات من الجلد من مرضى الجذام يتطلب مهارة الأطباء أو الفنيين العاملين في عيادات الجلد. يجب التعامل مع العاملين في المختبرات هذه العينات الحرص على ارتداء المعاطف مختبر ، وقفازات واقية وارتداء العين والعمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية عند التعامل مع عينات من الأنسجة المصابة أو الإنسان المدرع. تطهير الأسطح والأدوات هي أيضا حرجة. العمل في بيئة نظيفة ، ومجلس الوزراء الحيوي المهم آمنة معقمة لتجنب تلوث عينات من الحمض النووي.

وقد أصبح استخراج الحمض النووي من السهل نسبيا بفضل لتطوير استخراج مجموعات من شركات مثل Qiagen. يجب أن يتبع توجيهات بعناية. يجب أن تبقى جميع العينات الباردة عندما لا تكون قيد الاستعمال. تجنب تكرار ، والتغيرات في درجة الحرارة القصوى للعينات.

ويمكن طلب الاشعال DNA المستخدمة في هذا العمل من مختلف الشركات التي قد ورد ذكرها في قائمة المراجع الأدب في نهاية هذه الورقة. وينبغي الحرص على العمل مع أجهزة الاشعال في بيئة حرة في الحمض النووي لتجنب التلوث. الاشعال يأتي على شكل مسحوق جاف ، ويجب أن تكون مختلطة مع الشركة المصرية للاتصالات والمخففة لتركيز 100μM ، ثم فصل في كميات صغيرة (الشكل 2A). مزيد من الحلول المخففة هي عمل الاشعال لتركيزات 10μM. مرة أخرى ، لا تستخدم عينات من الحمض النووي في مناطق / اغطية التي تستخدم فيها أجهزة الاشعال والمعدة.

وينبغي أيضا أن تظل المنتجات PCR الباردة عندما لا تكون قيد الاستعمال.

وهناك 3 ٪ تحضير هلام agarose إعطاء أفضل فصل الفرقة الحمض النووي ، ولكنه يأخذ وقتا أطول لتشغيل. النوعي لأغراض محض ، 2 ٪ لا يكفي عادة. إيثيديوم حل بروميد تستخدم لتلوين الحمض النووي في الهلام هو agarose genotoxin نشطة للغاية أن يمتص من خلال الجلد. التعامل مع هذا الحل والمواد الهلامية ملطخة باستخدام عناية كبيرة ويجري دائما تأكد من ارتداء القفازات. غسل اليدين جيدا بعد التعامل مع عينات الحمض النووي أو أي مواد بروميد إيثيديوم. التخلص من بروميد إيثيديوم حل تلطيخ والغسيل والمواد الهلامية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. لا الهلام المطلوبة بشكل روتيني ، ويمكن القضاء على هذه الخطوة مرة واحدة وضعت أساليب FLA. حان الوقت والمستهلكة كاشف.

الحل formamide المستخدمة في إعداد العينات للFLA أيضا سامة للغاية وينبغي التعامل معها بحذر. غسل اليدين بعد الاستخدام. التخلص منها المبادئ التوجيهية التالية المؤسسية.

ويمكن قراءة نتائج FLA الذروة باستخدام برنامج ماسح أمرا صعبا. وقد وضعت مجموعة أساسية من المكالمات أليل (عدد يكرر جنبا إلى جنب) في CSU (الجداول 4-7). (وتجدر الإشارة إلى أن الجداول 4-07 مايو لا يكون شاملة وكما غيرها من سلالات M. الجذامية يتم دراستها ، ويمكن الاطلاع على نسخة الأليلات مع الأرقام خارج النطاقات المذكورة.) واحد تحديا خاصا يتضمن "تلعثم" القمم. هذه هي الحدود القصوى للعائلات ، وخصوصا من تقارير المعاملات المشبوهة التي تنطوي فقط 2-3 يكرر الزوج القاعدة ، مثل (TA) 10. اختيار أحيانا ذروة الصحيح لقراءة صعبة (الشكل 7). في هذا الشكل ، والذروة في السيطرة الإيجابية في غليان 190 هو ذروة الرئيسية. انخفاض يصل إلى ذروته في الارتفاع التي هي 2 أو 4 أو 6 أزواج حتى قاعدة أكبر أو أصغر من ذروة رئيسية تسمى "قمم تلعثم". يمكن A - المخلفات أيضا أن يسبب الارتباك. وصفت في وقت سابق من A - المخلفات في النص والشكل 8. أخيرا ، إذا كانت منتجات وفيرة للغاية PCR في العينات ، قد تظهر مع القمم ارتفاعا مزدوجة. في هذه الحالة ، وقراءة في مركز شكل الذروة. (انظر الشكل 6 ، 6 مرضى).

إدارة البيانات يمكن أن تكون مهمة هائلة لهذا النوع من العمل. فمن المهم لتسجيل جميع المعلومات ذات الصلة لجميع التجارب مثل : تاريخ المهمة أو الداخلي ، المشغل ، الشريط / لوحة خرائط وأوامر FLA ، وظروف PCR وصفات ، وتواريخ المواد الهلامية والصور الفوتوغرافية ، ودرجات حرارة التخزين ، والتخفيفات قالب الحمض النووي ، FLA مواقع إلكترونية يمكن تخزين الملفات ، الخ. تنظيم جيد وإدارة البيانات تنقذ ساعة من الوقت الذي يقضيه يبحث عن قطعة معينة من المعلومات في المستقبل.

وقد عمل المختبر الموصوفة هنا يحدث لعدة سنوات في جامعة ولاية كولورادو وغيرها من المواقع في جميع أنحاء العالم. صورة كبيرة مما كافة البيانات التي تم جمعها الوسائل والكيفية التي يمكن من استخدامها في المستقبل بدأت في الظهور. أرقام 10A 10B وتوضح كيف يمكن استخدام هذه البصمات الحمض النووي للتمييز بين مختلف م. سلالات الجذامية بين البلدان (10A) ، أو حتى بين العائلات (10B). وقد تبين أن الأسرة والمجتمع الحالات مرتبطة تحمل M. الجذامية متشابهة أو متطابقة من أنواع الضغط VNTR. الأمل هو أنه قد يكون من الممكن الحصول على مزيد من التبصر في وضع (ق) من انتقال مرض الجذام بحيث يمكن تطويرها لنظام الكشف المبكر عن شبكات النقل لهؤلاء الناس موسقد ر المعرضين للخطر ، والعلاج بالعقاقير العلاجية التي تبدأ قبل انجاز تلف دائم العصبية والجلدية.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقدم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة / NIAID منح RO1 - AI - 63457 الأذربيجانية ومنح تكملة RO1 - AI - 63457 S1. نعترف مساهمات جميع الأعضاء الحاليين والسابقين للفريق المختبر والمتعاونين معهم.

References

  1. World Health Organization. Chemotherapy of leprosy for control programmes. Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).
  2. Cole, S. T. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 409, 1007-1011 (2001).
  3. Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).
  4. Groathouse, N. A. Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).
  5. Young, S. K. Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India. Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).
  6. Monot, M. Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).
  7. Kimura, M. Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens. J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).
  8. Weng, X. iaoman Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study. J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).
  9. Weng, X. Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation. Infection, Genetics and Evolution. (2010).
  10. Sakamuri, R. M. Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines. J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).
  11. Fontes, A. N. B. Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients. Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics