Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы описываем эффективный метод для отдельных одноцепочечных ДНК двухцепочечной молекулы ДНК и РНК от экологической вирусных общин. Нуклеиновых кислот фракционированного использовании гидроксиапатита хроматографии с увеличением концентрации фосфата содержащих буферы. Этот метод позволяет изоляции всех типов вирусных нуклеиновых кислот из проб окружающей среды.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fadrosh, D. W., Andrews-Pfannkoch, C., Williamson, S. J. Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography. J. Vis. Exp. (55), e3146, doi:10.3791/3146 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Вирусы, в частности, бактериофаги (фаги), являются наиболее многочисленными биологических объектов на 1,2 Земле. Вирусы модулировать хост обилие клеток и разнообразия, способствовать круговорот питательных веществ, изменяет фенотип клетки-хозяина, и влиять на развитие как клетки-хозяина и вирусных сообществ через боковой перенос генов 3. Многочисленные исследования выявили ошеломляющие генетического разнообразия вирусов и их функциональных возможностей в различных природных средах.

Метагеномных методы были использованы для изучения таксономического разнообразия и функциональный потенциал комплекса вирусных ассоциаций, члены которых содержат одноцепочечных ДНК (оцДНК), двухцепочечной ДНК (дц) и РНК генотипов 4-9. Текущее строительство библиотеки протоколов, используемых для изучения экологических ДНК-содержащие и РНК-содержащих вирусов требует первоначального лечения нуклеазы, чтобы удалить nontargeted шаблонов 10. Тем не менее, полное понимание коллективных дополнением гена вируса и сообщества вирус разнообразие требует знания всех членов независимо от генома композиции. Фракционирование очищенных нуклеиновых кислот подтипов обеспечивает эффективный механизм для изучения вирусных ассоциаций, не жертвуя подмножество генетической подписью сообщества.

Гидроксиапатита, кристаллической форме кальция фосфата, был принят на работу в отделение нуклеиновых кислот, а также белков и микробов, с 1960 года 11. Эксплуатируя взаимодействия зарядов между положительно заряженными Са 2 + ионов гидроксиапатита и отрицательно заряженные фосфатные основой нуклеиновые кислоты подтипов, можно преимущественно элюировать каждой нуклеиновой кислоты подтипа независимо от других. Недавно мы заняты этой стратегии самостоятельно фракционирования геномов оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК-содержащих вирусов в подготовке секвенирования ДНК 12. Здесь мы представляем метод фракционирования и восстановления оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК вирусной нуклеиновой кислоты из смешанных вирусных ассоциаций использовании гидроксиапатита хроматографии.

Protocol

1. Подготовка решений

Перед выполнением гидроксиапатита хроматографии, фосфатные буферы должны быть подготовлены и гидроксиапатита должны быть надлежащим образом обезвоживания.

  1. 1М раствор фосфат, рН 6,8: в 1 л колбе растворяют 119.98g натрия фосфат однозамещенный в 1 л стерильной, DEPC обработанных H 2 O. Подготовка 1M натрия фосфат двузамещенный раствора в 1 л колбе, растворяя 141.96g натрия фосфат двузамещенный в 1 л стерильной, DEPC обработанных H 2 O. Комбинат моно-и ди-решений в соотношении 1:1. Место колбы на тарелке перемешать и смешать с помощью магнитной мешалки. Отрегулируйте рН до 6,8 путем добавления гидроксида натрия (для увеличения рН) или фосфорной кислоты (снижение рН).
  2. 0.12M фосфатного буфера: В 500 мл колбу, объединить 30 мл 1 М раствора фосфата, 6,8 рН, 2,5 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), и 5 мл 0,5 М ЭДТА. Добавить стерильной, DEPC обработанных H2O до объема 225ml. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавить стерильной, DEPC обработанных H2O до 250 мл. Автоклав.
  3. 0.18M фосфатного буфера: В 500 мл колбу, объединить 45 мл 1 М раствора фосфата, 6,8 рН, 2,5 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), и 5 мл 0,5 М ЭДТА. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в объеме 225ml. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в 250 мл. Автоклав.
  4. 0.20M фосфатного буфера: В 500 мл колбу, объединить 50 мл 1 М раствора фосфата, 6,8 рН, 2,5 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), и 5 мл 0,5 М ЭДТА. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в объеме 225ml. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в 250 мл. Автоклав.
  5. 0,40 М фосфатного буфера: в 500 мл колбу, объединить 100 мл 1 М раствора фосфата, 6,8 рН, 2,5 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), и 5 мл 0,5 М ЭДТА. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в объеме 225ml. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в 250 мл. Автоклав.
  6. "1,00 м фосфатного буфера" (фактическая концентрация фосфатов в этом растворе 0,91 М): В 500 мл колбу, объединить 30 мл 1 М раствора фосфата, pH6.8, 2,5 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), и 5 мл 0,5 М ЭДТА. Добавить стерильной, DEPC обработанных H2O до объема 225ml. Отрегулируйте рН до 6,8. Добавить стерильной, DEPC обработанных H 2 O в 250 мл. Автоклав.
  7. Гидроксиапатит гидратации: Масса из 1 г гидроксиапатита и добавьте к 50 мл трубки. Добавить в 6 мл 0.12M фосфатного буфера для гидроксиапатита и инвертировать перемешать. Перед использованием довести температуру до 60 ° С и тщательно перемешать. Магазин в течение длительного периода времени при температуре 4 ° C.
  8. Перед использованием равновесие все фосфатные буферы и увлажненной гидроксиапатита при температуре 60 ° C.

2. Подготовка Econo-колонки

  1. Закрыть кран. Промойте колонку несколько раз деионизированной Н 2 О, неоднократно инвертирующего столбца и декантации.
  2. Удалить из крана Econo-колонки и колонки автоклав для стерилизации.
  3. Замените и закрыть кран. Добавить 1 мл Sigmacote к стерильным Econo-колонки и пальто все стеклянные поверхности. Откройте кран и слейте.
  4. Прикрепите колонку к циркулирующим водяной бане и заданной температуры до 60 ° C. Для einsure наименьшее количество потерь тепла через колонку упаковки столбца в изоляционных агент, такой как алюминиевая фольга или изоляции пены трубы рекомендуется.
  5. Промыть Econo колонки дважды стерильной, без РНКазы H 2 O, затем дважды стерильной, РНКазы без 0.12M фосфатного буфера.

3. Hydroxypaptite хроматографии

  1. Убедившись, кран закрыт, постепенно добавить 2 мл заранее подготовленные, ресуспендировали гидроксиапатита на дно Econo-столбца, используя стерильные 2 мл серологические пипетки.
  2. Разрешить гидроксиапатита урегулировать под действием силы тяжести в течение 30 минут.
  3. Слейте буфер из колонки и закрыть кран. Комбинат нуклеиновых кислот с 0.12M фосфатного буфера в конечном объеме 500 мкл и инкубировать при температуре 60 ° С в течение 10 минут в блоке тепла или водяной бане.
  4. Быстро применять нуклеиновые кислоты, подготовленный в 0.12M фосфатного буфера с использованием гидроксиапатита 2мл серологические пипетки убедившись, чтобы не нарушить колонке.
  5. Разрешить нуклеиновых кислот для привязки к гидроксиапатита в течение 30 минут.
  6. Место 15мл трубку под колонки, откройте кран и собрать первоначальный образец, содержащий оцДНК. Закрыть кран.
  7. Добавить в 6 мл 0.12M фосфатного буфера для гидроксиапатита убедившись, чтобы не нарушить колонку, открыть кран, и собирать одноцепочечных ДНК в 15 мл трубки из предыдущего шага. Закрыть кран.
  8. Добавьте 1 объемом фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:25:1 о / о / о) решение трубки, смесь энергично и центрифуге при 3500 мкг в течение 15 минут. Передача супернатант, содержащий оцДНК к новым 15мл трубки.
  9. Повторите 3,76 и 3,87 использовании 6 мл из 0.20M фосфатного буфера к электроннойлютня и очистить РНК из колонки и обязательно использовать новые 15мл трубка для коллекции.
  10. Повторите 3,76 и 3,87 использовании 6 мл из 0.40M фосфатного буфера для элюирования и очистить двухцепочечной ДНК из колонки убедившись, что для использования новых 15мл трубка для коллекции.
  11. Повторите 3,76 и 3,87 использовании 6 мл в 1,00 м фосфатного буфера раздеться колонке любой остаточной дцДНК убедившись, что использование новых 15мл трубка для коллекции.

4. Обессоливание нуклеиновых кислот

  1. Передача 4-5 мл образца Amicon Ультра-4 центробежного фильтра устройства оснащены 30000 молекулярной массой отрезать Ultracel мембраны.
  2. Концентрат образца до <500 мкл, крутя при 6000 мкг, 30 ° C, 5 минут (или пока сосредоточены объем достигается) в фиксированных угла ротора. Отменить течь через.
  3. Добавить оставшуюся часть образца (ов) к Amicon Ультра-4 центробежного фильтра устройства и довести объем до 4-5 мл РНКазой свободного буфера 1X TE.
  4. Концентрат образца до <500 мкл, крутя при 6000 мкг, 30 ° C, 5 минут (или пока сосредоточены объем достигается) в фиксированных угла ротора. Отменить течь через.
  5. Добавить 4-5 мл РНКазы свободного буфера TE 1X к Amicon Ультра-4 центробежный фильтр устройства. Концентрат образца до <500 мкл путем центрифугирования при 6000 мкг, 30 ° C, 5 минут (или пока сосредоточены объем достигается) в фиксированных угла ротора. Отменить течь через.
  6. Повторите шаг 4,5 дополнительные 5 раз, чтобы полностью опреснения нуклеиновые кислоты образца (ов).
  7. Передача оставшейся выборке (ей) стерильную пробирку 1.7ml Эппендорф. Добавить 1/10th объема 3М ацетата натрия, рН 7,0, два тома по 100% этанола и 1 мкл из Glycoblue. Хорошо перемешайте на вортексе.
  8. Центрифуга на 28 000 мкг, 4 ° С, 60 минут. Декантировать убедившись, чтобы не нарушить гранул. Добавить 300 мкл 70% этанола. Спиновые на 28000 мкг, при комнатной температуре в течение 10 минут. Декантировать, сухой и ресуспендирования каждой фракции в соответствующий объем РНКазы без буфера ТЕ.

5. Представитель Результаты:

На рисунке 1 приведены методы, представленные для использования гидроксиапатита хроматографии для фракционирования оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК, нуклеиновых кислот из смешанных вирусных сборки. Метод основан на использовании взаимодействия зарядов между отрицательно заряженных фосфатных основы нуклеиновые кислоты и положительно заряженными Са 2 + ионов, присутствующих в гидроксиапатита и позволяет эффективное фракционирование нуклеиновых кислот подтипы (оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК) с увеличением концентрации фосфатного буфера 12.

Гидроксиапатита фракционирования в пробирке "сообщество" известных оцДНК (M13mp18), дц (лямбда) и РНК (MS2 и phi6) вирусные геномы показано на рисунке 2. Нуклеиновых кислот были объединены в равных концентрациях, примененная к гидроксиапатита колонку и элюировали использованием увеличением концентрации фосфатного буфера. Каждый нуклеиновые кислоты подтипа элюируется независимо от других с менее чем 9% средств, оставшихся с одной фракции в другую.

Применение этого метода для нуклеиновых кислот, выделенных из вирусного сообщества собраны из Чесапикского залива показано на рисунке 3. Общую нуклеиновые кислоты выход изолирован от очищенных вирусов была применена к гидроксиапатита колонке. Геномная материал, состоящий из оцДНК, РНК и дц был независимо элюировали 0.12M, 0.20M и 0.40M/1.00M концентрации фосфатного буфера соответственно. Двухцепочечной ДНК вымывается при концентрации фосфата 0.40M и 1,00 м, а в данном случае, доминирует над этим вирусным сообществом по сравнению с одноцепочечной РНК и генотипов. Это наблюдение согласуется с ожидаемым вирусных композиции сообществ морских и устьевых среде, где большинство извлекаемых нуклеиновые кислоты двухцепочечной ДНК 13.

Рисунок 1
Рисунок 1. Принципиальная схема гидроксиапатита методом хроматографии для фракционирования нуклеиновых кислот. Смесь оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК, подготовленный в 0.12M фосфатного буфера нагревается до 60 ° С и наносили на колонку гидроксиапатита поддерживается при постоянной 60 ° С с использованием оборотной воды ванны. Нуклеиновых кислот (оцДНК, РНК и дц) вымываются из гидроксиапатита с увеличением концентрации фосфат-содержащих буфера. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Американского общества микробиологии и первоначально был показан в Эндрюс-Pfannkoch и соавт. 2010 12.

Рисунок 2
Рисунок 2. Разделение известных вирусных нуклеиновых кислот с использованием гидроксиапатита хроматографии. Равные концентрации M13mp18 оцДНК, MS2 ssRNA, phi6 дсРНК и лямбда двухцепочечной ДНК (полосы 2-5, соответственно) были объединены (дорожка 6) и применяется к гидроксиапатита колонке. SinglE-ДНК (M13mp18), РНК (MS2/phi6) и двухцепочечной ДНК (лямбда) были независимо вымывают из гидроксиапатита колонки, используя 0.12M (дорожка 8), 0.18M (дорожка 9) и 0.40M/1.00M (дорожка 10) . 1 КБ лестнице (дорожки 1, 7) была использована для подтверждения генома размеров. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Американского общества микробиологии и первоначально был показан в Эндрюс-Pfannkoch и соавт. 2010 12.

Рисунок 3
Рисунок 3. Разделение вирусных нуклеиновых кислот, выделенных из сообщества в Чесапикского залива. Нуклеиновые кислоты были выделены и применены к гидроксиапатита колонке. оцДНК (полоса 0.12M), РНК (полоса 0.20M) и двухцепочечной ДНК (полосы 0.40M/1.0M) были независимо элюировали использованием фосфатного буфера концентрации 0.12M, 0.20M и 0.40M/1.00M, соответственно. Привет массовой ДНК Лестница (полоса L1) и 1 КБ Лестница (полоса L2) были использованы для визуального подтверждения приблизительной молекулярной массой и масса нуклеиновых кислот. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Американского общества микробиологии и первоначально был показан в Эндрюс-Pfannkoch и соавт. 2010 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Гидроксиапатита методологии хроматографии, представленная здесь, высокоэффективный и надежный инструмент для фракционирования нуклеиновых кислот из смешанных вирусных ассоциаций, когда целью является изучение общего состава нуклеиновых кислот сообщества. Как правило, оцДНК, РНК и дц будет вымывается из колонки фотонов фосфатного буфера концентрациях, превышающих примерно ~ 0 и 0.40M соответственно. Однако, каждый подготовки гидроксиапатит может иметь несколько иной состав и профиль элюирования, поэтому важно, чтобы проверить каждого препарата с использованием известных нуклеиновых кислот (например, из культивируемых подготовки вируса). Это позволит пользователю установить конкретные концентрации фосфат-содержащих буферы необходимых для элюции желаемого нуклеиновых кислот.

Ограничивающим фактором этого метода является количество доступных Са 2 + ионов, присутствующих в гидроксиапатита, которые могут связываться фосфат основой нуклеиновых кислот. Capacityamount из гидроксиапатита в столбце можно масштабировать вверх или вниз для колонки (продиктован размером с водяной рубашкой столбца и количество гидроксиапатита используется), а объем буферов, используемых для элюирования можно масштабировать вверх или вниз для размещения очень маленькие или очень большого количества входных нуклеиновых кислот, но в конечном счете ограничен размером с водяной рубашкой колонке.

Кроме того, партия техники, где нуклеиновых кислот, гидроксиапатит, и фосфат-содержащих буферы объединены в трубки, смешанные, и центрифугировали при низкой скорости является альтернативным путем выделения целевых нуклеиновых кислот. Эта стратегия может быть полезным в некоторых случаях, но не так надежны, как хроматографические методы, которые являются более точными и обеспечивают лучшую фракционирования нуклеиновых кислот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке Управления науки (BER), Министерство энергетики США, соглашение о сотрудничестве нет. Де-FC02-02ER63453, микробного генома Национального научного фонда Секвенирование Program (награда номерами 0626826 и 0731916). Мы благодарим Джона стекло за его техническую экспертизу и консультации и К. Эрик Wommack за его помощь в экологической лаборатории.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Econo-Column Bio-Rad 737-0717 0.7cm ID package/2
Hydroxyapatite Bio-Rad 130-0520 DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td>
Sodium Phosphate, Monobasic VWR international VW1497-01 Monohydrate, Crystal 500g
Sodium Phosphate, Dibasic VWR international VW1496-01 Anhydrous, Powder 500g
DEPC-treated Water Invitrogen AM9922 1L
10% SDS Solution Invitrogen 24730-020 UltraPure, 1L
0.5M EDTA Invitrogen AM9262 pH 8.0, 1L
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML
2ml serological pippette VWR international 89130-884 Polystyrene, Sterile
BD Falcon Centrifuge Tubes VWR international 21008-936 15ml, Sterile
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) Invitrogen 15593-031 UltraPure, 100ml
Amicon Ultra-4 Centrifugal Device EMD Millipore UFC803024 Ultracel-30 membrane
20X TE Buffer, Rnase free Invitrogen T11493 100ml
Glycoblue Invitrogen AM9516 15mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
  2. Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).
  3. Weinbauer, M. G. Bacteriophages: Evolution of the Majority. FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).
  4. Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes. Nature. 455, 830-830 (2008).
  5. McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression. PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).
  6. Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples. PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).
  7. Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. RNA Viruses in the Sea. FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).
  8. Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics. J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).
  9. Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics. J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).
  10. Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities. Science. 312, 1795-1795 (2006).
  11. Bernardi, G. Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite. Nature. 209, 779-779 (1965).
  12. Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages. Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).
  13. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics