Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Biology
 

Summary

Fare embriyoları için etilen glikol tabanlı Vitrifikasyon yöntemi açıklanmıştır. , Sadeliği ve düşük embriyonik toksisite diğer yöntemler için avantajlı olduğunu ve bu nedenle farelerin kendilenmiş ve gen modifiye fareler de dahil olmak üzere birçok suşları, genel olarak uygulanabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mochida, K., Hasegawa, A., Taguma, K., Yoshiki, A., Ogura, A. Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification. J. Vis. Exp. (57), e3155, doi:10.3791/3155 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fare embriyo Kriyoprezervasyon birçok suşu farelerin genetik modifikasyon tarafından üretilen ve sayısı sürekli geçen yıl artmaktadır çünkü, biyomedikal bilimler destekleyen bir teknolojik temelini oluşturmaktadır. Onun teknik gelişme, daha sonra, 1980'lerin sonlarında 2 geliştirilen vitrifikasyon yöntemleri takip 1970'lerde 1 yavaş dondurma yöntemleri ile başladı. Genellikle, ikinci teknik çabukluk, basitlik, ve kurtarılan embriyoların yüksek beka avantajlıdır. Ancak, içerdiği cryoprotectants son derece toksik ve sonraki embriyo gelişimi etkileyebilir. Bu nedenle, teknik çözümleri 4 soğutulur bile, farelerde belirli suşları için geçerli değildi ° C embriyo işleme sırasında toksik etkisini azaltmak için. RIKEN BioResource Merkezi, 5000'den fazla farklı genetik geçmişleri ve fenotipleri ile fare suşlarının 3 korunur ve bu nedenle bir vitrifikasyon te optimizechnique ile ortam sıcaklığı 4 sırlama ve çözülme (veya daha doğrusu, sıvılaştırılarak) sonra yüksek embriyo hayatta kalma faydaları, farelerin birçok farklı suşları embriyolar cryopreserve yapabilirsiniz.

Burada, merkezimizde başarıyla kullanılmakta olan fare embriyoları için bir vitrifikasyon yöntemi sunuyoruz. Kriyoprezervasyon çözüm yerine DMSO embriyolar 5 toksisite en aza indirmek için etilen glikol içerir. Aynı zamanda, sırasıyla Devitrifikasyon önlenmesi ve osmotik ayarlama için Ficoll ve sakaroz içerir. Embriyolar, oda sıcaklığında ele ve 5 dakika içinde sıvı azot transfer edilebilir. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Biz de kritik bir ste çünkü ayrıntılı olarak vitrifiye embriyolar çözülme sürecinin nasıl geliştiğini anlatabilircanlı farelerin etkin kurtarma için p. Bu metodolojileri, güvenli ve maliyet-etkin bir şekilde daha sonra kullanmak için fare suşlarının korunması gereken araştırmacı ve teknisyenler için yararlı olacaktır.

Protocol

Deney genel şeması Şekil. 1.

1. Reaktif Hazırlama

  1. Lütfen aşağıdaki grafiğe göre, 100 ml cam şişe taban orta (burada PB1 olarak bilinen) olun:
    MW mM mg/100
    NaCl 58,4 136,98 800,0
    KCl 74,6 2,68 20,0
    KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0
    Na 2 HPO 4 .12 H 2 O 358,14 8,04 288,1
    MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0
    180,2 5,56 100,0
    Na piruvat 110 0,33 3,6
    CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2
    Penisilin G 6.0 (yaklaşık)
  2. Ficoll-sakkaroz (FS) çözümü:
    1. 14 ml, 50 ml tüp PB1 çözüm için aşağıdaki kimyasallar ekleyin.
      Ficoll 70 6.0 g
      Sakaroz 3.424 g
      BSA 42.0 mg
    2. Ficoll 70 PB1 çözüm sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın ve iyice çalkalayınız.
    3. BSA, üzerinde tam bir çözülme kontrol ettikten sonra, çözüm yüzey eklemek ve bunu tutmakBSA kadar 4oC tamamen çözülmüş (> 4 saat veya gece boyunca).
  3. 50 ml tüp dengeleme çözümü (EFS20) ve vitrifikasyon solüsyonu (EFS40):
    • EFS20:% 20 (v / v) etilen glikol,% 24 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.4 mol / L sakkaroz
    • EFS40:% 40 (v / v) etilen glikol,% 18 (w / v) Ficoll ve BSA PB1 0.3 mol / L * sakaroz
      * BALB / c veya ICR gerginlik embriyolarında 6 cryodamage daha duyarlıdır, çünkü, 0.9 mol / L sakkaroz sakaroz konsantrasyonu artırır.
    EFS20 çözüm EFS40 çözüm
    Etilen glikol 1 ml 2 ml
    FS çözüm 4 ml 3 ml
  4. Filtrasyon ile 0.45 mikron filte kullanarak çözüm sterilizer. 4, 5 ml polistiren tüpleri ve mağaza alikotları olun ° C Bunlar yaklaşık 6 ay için kullanılabilir.
  5. 0.75 M sakkaroz (TS1) içeren embriyo çözülme çözüm hazırlanması
    1. PB1 7.7 g sakaroz (adım 1.1 hazırlanan) çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın.
    2. 90 mg BSA çözüm yüzey üzerine ekleyin ve tamamen eriyene kadar stand it bırakın.
    3. Çözüm filtrasyon ile sterilize edin.
    4. 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir.

    Not: TS1, aynı zamanda piyasada bulunan M2 hazırlanmış olabilir.
    1. 7.7 g sakaroz M2 çözülür ve toplam hacim 30 ml getirmek.
    2. Yavaşça sallayarak sakaroz tamamen eriyene kadar karıştırın.
    3. Çözüm filtrasyon ile sterilize edin.
    4. 4oC kısım ve saklayın. Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir.
  6. TS2 (çözülme çözüm: 0.25 M sukroz) içeren
    1. Uygun olarak, PB1 veya M2 20 ml hacmi 10 ml TS1 seyreltilir.
    2. 4 ° C'de kısım ve mağaza Yaklaşık 1 ay süreyle kullanılabilir.

2. 2-hücre Mouse Embriyolar, Vitrifikasyon

  1. Doğal çiftleşme ya da in vitro fertilizasyon teknikleri geleneksel 2-hücreli fare embriyoları hazırlayın.
  2. Kısım cryotube içine 50 ul EFS40. Bundan sonra, oda sıcaklığında vitrifikasyon prosedürünün geri kalanını gerçekleştirmek.
  3. EFS20 35 mm veya 60 mm plastik Petri kabı alt kısım 50 ul.
  4. Kültür ortamı sadece minimum miktarda kılcal bir bardak kullanarak EFS20 30 embriyolar aktarın. 2 dakika için bir zamanlayıcı başlayın.
    Not: embriyolar açılan alt yerleştirin. Bu embriyoların verimli dehidratasyon yapar. Stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin. Şekil olarak Susuz embriyolar çekmiş, bir morfoloji göstermektedir. 2A.Onlar yeterince kurutulmuş değilseniz, 1 veya 2 dakika bekleyin.
  5. Yaklaşık 1,5 dakika, çözümün sadece asgari miktarı ile EFS20 damla embriyolar pick up. Adım 2.1 'de hazırlanan cryotube EFS40 aktarabilirsiniz. Not: En iyi sonuç için, tüm embriyolar yaklaşık 2 dakika EFS40 aktarılır, böylece embriyolar toplayıp zamanlamasını ayarlayın.
  6. 1 dakika bekleyin.
  7. Cryotube doğrudan sıvı azot (LN 2) içine koyun.

3. Vitrifiye 2-hücreli Fare Embriyolar Çözülme

  1. Çözülme önce, kurtarılan embriyolar embriyo kültür ortamı 10 ul damla (3.13 adım) bir yemek hazırlayın. CO 2 inkübatör petrol ve yer ile çanak kullanana kadar örtün. Not: Bu deneyde kullanılan rutin embriyo kültürü için herhangi bir ortam olsa da, M16 orta gibi yüksek ozmolarite medya önermektedir.
  2. 37 ° C'ye kadar TS1 Sıcak
  3. Bir yüz maskesi ve cryogloves koyun. LN 2 t açınank ve embriyoları içeren bir cryotube almak.
  4. Tüpün üst hızla açmak ve LN 2 atın. Sonraki aşamada dondurma TS1 önlemek için 30 saniye bekleyin.
  5. Tüpe TS1 850 ul (37 ° C) ekleyin ve çözüm eşit eriyene kadar nazik pipettings (25 saniye içinde on kat) tarafından çözüm karıştırmak için bir 1000ul pipet kullanın.
  6. , Plastik bir 60 mm Petri kabında (ya da bir saat camı) (Şekil 3A) tüp tüm hacim aktarın . Not: Adım 3.14 CO 2 inkübatör yerleşene kadar Embriyolar oda sıcaklığında (22-25 ° C) ele alınmalıdır.
  7. 3 dakika süreyle bir zamanlayıcı başlayın.
  8. Embriyoları içeren orta çanak (Şekil 3B) yüzeyine yayılmış kadar çanak TS1 yaklaşık 2 dakika, hafifçe sallayın. Not: Bu TS1 için transfer yüzeyine yakın yüzen embriyolar nedeniyle dibe yardımcı olacaktır.
  9. Th üzerine üç 50 ul TS2 damla koyune kap (Şekil 3C).
  10. TS1 3 dakika sonra, bir stereomikroskopta embriyo morfolojisi kontrol edin, onlar biraz çekmiş olmalı. TS1 önceki embriyo morfolojisi (Şekil 2B) ve daha sonra (Şekil 2C). Not: embriyoların hala şiş, 3 dk ile 1 TS1 içinde saklayın.
  11. Embriyoların Pick up ve TS2 ilk damla (Şekil 3D) aktarabilirsiniz. 3 dk için Sayacı başlat
  12. 3 dakika sonra, üçüncü bir damla (Şekil 3E) sonra ikinci damlasına kadar embriyo transferine ve .
  13. Adım 3.1 hazırlanan kültür ortamı embriyoların transferi. Embriyolar Şekil şeklinde. 2D.
  14. CO 2 inkübatör yerleştirin çanak. Yaklaşık 10 dakika sonra, TS2 yapılmıştır sakaroz yıkamak için kültür ortamı sonraki düşüş embriyo transferi.
  15. Embriyo transferi kadar CO2 inkübatör kültür devam edin.
    Not: Transferi Embryçözülme, gün alıcı kadın siyon hatası os. , In vitro Uzun kültür farelerin bazı suşları embriyo canlılığı azalabilir .

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Çözülme Tablo 1 ve 2'de sunulmuştur ve in vivo embriyo geliştirme sonra In vitro. Bu protokolün avantajları, farelerde farklı suşları çözülme ve geniş uygulanabilirliği sonra embriyoların yüksek beka.

Gerginlik Toplam tüpler Sayısı Vitrifiye embriyoların sayısı Kurtarılan (No (%)) Morfolojik olarak normal (No (%)) Blastosist geliştirme (No (%))
C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87)
BALB / CA 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84)
ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Tablo 1, ortak fare suşlarının vitrifiye çözülmüş embriyoların in vitro- geliştirme

Embriyoların Durumu Alıcı kadın sayısı Embriyoların No transfer İmplantasyonu siteleri (No (%)) Canlı yavrular (No (%))
Taze 12 180 141 (78.3) 110 (61.1)
Vitrifiye 16 242 202 (83.5) 125 (51.7)

(Tablo 2). C57BL/6J farelerde vitrifiye çözülmüş embriyoların in vivo- geliştirme.

Şekil 1
Şekil 1Deney dengeleme, vitrifikasyon ve embriyo çözülme de dahil olmak üzere genel şeması.

Şekil 2
Şekil 2 çözülme her aşamada embriyo morfolojisi.

Şekil 3
Şekil 3 embriyo prosedür Eritme. Tüm işlemler, oda sıcaklığında yapılır. (A) cryotube TS1 (37 ° C) 850 ul ekleyin ve bir plastik tabak üzerine cryotube çözümün tüm hacim transferi. Şu anda, embriyoların Şekil gösterildiği gibi şişmiş bekliyoruz. 2B. (B), çanak yüzey üzerinde yavaşça sallayarak Spread çözüm. (C) üç 50 ul damla TS2, plastik tabak yerleştirin. (D), TS2 ilk damlasına kadar embriyolar transfer. Şekil olarak 3 dakika sonra, embriyolar shurunken bekliyoruz. 2C. (E), onları seri transferKalan TS2 içine ly sonra kültür ortamına düşer ve.

Discussion

1985 2 Rall ve Fahy fare embriyo vitrifikasyon ilk rapordan bu yana, çözdürme sonrası embriyo beka artırmak için bazı teknik iyileştirmeler yapılmıştır. En başarılı değişiklikler düşük toksisite ve membran geçirgenliği yüksek, çünkü bir dölveriminin olarak etilen glikol kullanımı sağlandı. Gibi avantajlar sağlar; bize 4 oda sıcaklığı donma embriyolar ele diğer vitrifikasyon yöntemleri soğuk ısılarda teslim embriyo gerektirir ve her zaman BALB / c 6 farelerin bazı suşları için geçerli değildir. Ilk etilen glikol bazlı vitrifikasyon Kasai ve ark tarafından geliştirilmiştir. 1990 5,7. Orijinal bir yöntem olarak plastik kaplar payet için optimize edilmiş olduğundan, biz biraz laboratuvarlarda daha kolay erişilebilir ve fiziksel hasarlara karşı daha dayanıklı cryotubes için protokol değiştirdiniz. Bu nedenle, burada açıklanan Vitrifikasyon yöntemi uygulaması olması olabiliraraştırma modelleri gibi bir çok laboratuar fareleri kullanarak licable. Aynı yöntem morula ve blastosist aşamalarında 8 ve sıçan embriyolar 9, fare embriyoları için de kullanılabilir . Ancak, son zamanlarda cryotubes kalitesi, donma-çözülme sonrası embriyoların sağkalım oranları etkileyebileceğini bulduk. Bu nedenle, iç yüzey sırlama embriyolar (bkz. Tablo özel reaktifler ve ekipman gibi) önce düzgünlük için cryotubes incelemek için esastır.

Vitrifikasyon yöntemleri geleneksel yavaş dondurma yöntemlerine göre birçok avantajı var, ancak doğal olarak ulaştırma amacı açısından bir dezavantaj var. Vitrifiye embriyolar aşağıda -120 tutulmalıdır ° C canlılığını korumak amacıyla, kuru nakliyatçılar genellikle güvenli taşınması için kullanılır. Kuru nakliyatçılar ağır ve hantal, ve bunların gidiş-dönüş, özellikle uluslararası taşımacılık, pahalı. Biz şimdi yeni bir vitrifikasyon yöntemi henüz gelişmekte olanvitrifiye embriyolar en az 7 gün 10 için (-80 ° C ile ilgili) kuru buz sıcaklığında saklanan olabilir. Bu yöntem, yeni nesil vitrifikasyon olmalıdır.

Disclosures

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Acknowledgements

Bu çalışmada Milli BioResource Projesi ile işbirliği içinde yürütülen Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji, Japonya.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin Merck & Co., Inc. 12657
Ethylene glycol Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 058-00986
Ficoll 70 GE Healthcare 17-0310-10
Glucose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 041-00595
NaCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 191-01665
KCl Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-03545
KH2PO4 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 169-04245
Na2HPO4·12H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 500-04195
MgCl2 ·6H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 135-00165
CaCl2 ·2H2O Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 031-00435
Penicillin G Sigma-Aldrich P-4687
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P-8574
Sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 196-00015
M16 medium Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Sigma-Aldrich M7167
Cryotube Sumitomo Bakelite Co., Ltd. MS-4501 “Cryogenic Vial”

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
  2. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  3. Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
  4. Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
  5. Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
  6. Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
  7. Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
  8. Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
  9. Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
  10. Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).

Comments

14 Comments

  1. Please, one question about the medium EFS²0 and EFS40:
    Are they prepared simply using the proportions described in the table EG/FS 1:4 and EGFS ²:5 (table), or is it the another formula described in the text (EFS²0: ²0% (v/v) etthylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA. Thanks in advance .Cleide from Brazil.

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 17, 2012 - 2:23 PM
  2. Thank you for your interesting.
    The first, we prepare FS solution consist of 30% (w/v) Ficoll and 0.5 mol/L sucrose in PB1 with BSA. And mix with ethylene glycol 1:4 or ²:3 for preparation of EFS²0 and EFS40, respectively. Finally, EFS²0 consists with ²0% (v/v) ethylene glycol, ²4% (w/v) Ficoll and 0.4mol/L sucrose in PB1 with BSA.
    Keiji from Japan

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 18, 2012 - 12:44 AM
  3. Thanks Keiji for your response.
    I have another question: what embryo culture medium did you use until cryopreservation?
    You have very good results.
    congratulations
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 18, 2012 - 3:28 PM
  4. I have always used CZB medium (Chatot CL, et al. 1989, J. Reprod. Fertil. 86:679-688) containing 5.6 mM glucose, 0.1 mg/ml PVA, and 3.0 mg/ml bovine serum albumin after IVF for around ²0 hrs and after cryopreservation until embryo transfer.
    The data in table 1 were obtained with CZB medium.
    I also recommend you to use KSOM medium instead of CZB medium.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 20, 2012 - 9:53 PM
  5. Ok Keiji.
    Thank you very much.
    best regards
    Cleide

    Reply
    Posted by: Cleide S.
    May 21, 2012 - 9:56 AM
  6. Keiji,
    I'm very interested in your protocol. I've just a question about the preparation of the PB1 solution. Do you just dissolve all the components in the order of your list in 100mL distilled H²0 or do you readjust the pH?
    Thanks in advance.
    Maryline from Belgium

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 6, 2012 - 4:49 AM
  7. Thank you for your interesting.

    About PB1 preparation , you can also find the protocol in the book, "Manipulating the Mouse Embryo" as modified D-PBS.
    We can prepare this solution to dissolve all components in the order of our list.

    However, usually we prepare PBS (-) solution first, which consists of NaCl, KCl, Na²HPO4 and KH²PO4.
    Then, after preparation of x100 concentrated MgCl² and CaCl² solutions, respectively, each 0.1 ml solution are slowly added in 98 ml of PBS(-) solution with gently mixing.
    Because this PBS(+) solution can be stored in refrigerator for several months.
    Before using, we dissolve other reagents, glucose, Na pyruvate and penicillin G.
    This PB1 solution can be used for at least a few weeks by storing in refrigerator.
    In the other hand, we can buy the powder or tablet of PBS(-) from some companies.

    And we do not adjust the pH.

    I hope this coment will be a help for you.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    July 8, 2012 - 11:05 PM
  8. Thank you very much! Your coment is really helpful.
    Maryline

    Reply
    Posted by: Maryline K.
    July 9, 2012 - 2:36 AM
  9. Hello,
    I wanted to try this method using 8-cell embryo. I noticed that the freezing media the PB1 is with BSA. How much BSA do you add?

    Thanks,
    Agnes
    Thanks,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2016 - 5:30 PM
  10. Thank you for your interesting.

    PB1 contains 3 mg/ml of BSA. Finally, vitrification solution (EFS40) contains 1.26 mg/ml of BSA.

    And this method is effective for the embryos at each stage from 1-cell to early blastocyst include 8-cell stage.

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    April 6, 2016 - 8:30 PM
  11. Hello,
    I tried the procedure but I found out that it is very hard to see the embryos after transferring them in EFS20. They floated and changed shape. I lost half the number of the embryos that I collected. Is there any practical tip that you can tell me to avoid this problem?
    Also, could I harvest the embryos in M2 and freeze them using you freezing media?

    Thanks again.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2016 - 1:22 PM
  12. Thank you for your interesting.

    If you can release embryos with small volume of medium near the bottom of EFS20 solution, you can find all embryos in small area. And we also recommend that it becomes easy to discover embryos at the surface of EFS20 solution by control of the light with the adjustment lever.

    The developmental ability of embryos will decrease at outside of incubator. However, the embryos must be left outside of incubator more than 10 min., the medium contains HEPES (ex. M2, HEPES-KSOM) or PB1 solution should be used.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:13 AM
  13. Hi,

    I think there is a mistake in the step 1.2.1: Add the following chemicals to 14 ml of PB1 solution in a 50 ml tube.
    Shouldn't it be 20ml?

    Thanks,
    Tony

    Reply
    Posted by: Tony N.
    April 28, 2016 - 4:16 AM
  14. Hi, Tony

    You are right.
    Total volume will be 20 ml.
    The conical tube of 50 ml is useful for preparation of this solution.

    Thank you.

    Keiji

    Reply
    Posted by: Keiji M.
    May 2, 2016 - 1:20 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics