Изоляция и характеристика Hoechst Низкий CD45 Отрицательный Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Biology
 

Summary

В этой статье мы покажем изоляции мышиного резидент легких мезенхимальные стволовые клетки (легких MSC), их расширение, характеристика и анализ иммуномодулирующими свойствами.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chow, K. S., Jun, D., Helm, K. M., Wagner, D. H., Majka, S. M. Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (56), e3159, doi:10.3791/3159 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ткань резидент мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются важными регуляторами восстановления тканей или регенерация, фиброз, воспаление, ангиогенез и образование опухолей. Взятые вместе, эти исследования показывают, что резидент MSC легких играть роль в легочной ткани гомеостаза, травм и ремонта в течение таких заболеваний, как легочный фиброз (ПФ) и артериальная гипертензия (ЛАГ). Здесь мы опишем технологию для определения населения резидентов MSC легких. Определение этой категории населения в естественных условиях легочной ткани с помощью определить набор маркеров облегчает повторное изоляции хорошо известных населению стволовых клеток путем проточной цитометрии и изучение определенного типа клеток и функции.

Protocol

1. Легкого Изоляция

  1. Жертвы взрослых мышей (8-10 недель в возрасте, 18-20 г; C57Bl6J) мышей с передозировкой изофлуран следует обескровливание с использованием стерильной техники. Профили будут незначительно отличаться между штаммами.
  2. Хирургическим путем удалить диафрагмы, открывают грудную полость, сокращая грудную клетку с боков на каждой стороне мыши. Флеш кровь из легких, перфузии правого желудочка сердца аккуратно с использованием 3-5mls фосфатного буферного раствора (PBS).
  3. Рассеките легких долях удаления трахеи и крупных бронхов и поместить в чашку Петри, заполненные Хэнкс буферном растворе (HBSS). После сбора всех долях легких щипцы используются для размещения ткани на крышке блюдо. Ткань затем фарш на мелкие части, используя одноразовые скальпели с достаточно жидким, чтобы держать их влажной, но не так много, что они плавают и двигаться.
  4. Рассеките задних конечностей одной из мышей и изолировать костного мозга для использования в качестве окрашивания управления для установки флош цитометрии ворота. Пятно костного мозга (КМ), как описано выше 1.

2. Подготовка суспензии отдельных клеток, из легких тканей

  1. Каждое легкое переваривается с помощью оптимизированной веса ткани к объему в 0,2 г: 5mls предварительно нагревается 0,2% Уортингтон 2 типа коллагеназы (Уортингтон Biochemicals, Лейквуд, штат Нью-Джерси; кошка # LS004202), растворенной в стерильной HBSS. Смесь погружают в 37 ° С на водяной бане 30 мин 2,3.
  2. Измельченного в порошок образца хорошо, пока переварить легочной ткани легко течет через пипетку 10 мл (примерно 10 повторений). Инкубировать еще 15 мин при 37 ° С для завершения ткани дайджесты и обеспечивает более равномерное суспензии отдельных клеток.
  3. Развести подвеску легкого с HBSS и растирают с 5 мл пипетки, чтобы рассеять остаточное фрагментов ткани.
  4. Фильтры подвески использованием 70μM сито ячейка для удаления непереваренных фрагментов ткани. Пример можно разделить на multiplэлектронной конических труб в этом месте, чтобы предотвратить перегрузку одной ячейки фильтра и уменьшить время.
  5. Гранул суспензии клеток в течение 10 мин при 1500 оборотах в минуту и ​​переливать супернатант.
  6. Ресуспендируют осадок клеток осторожно использованием комнатной температуре лизиса буфер (eBiosciences, Сан-Диего, Калифорния; кошка # 00-4333-57) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить равный объем HBSS для инактивации лизис буфером и фильтром клеточной суспензии использованием 40 мкм сито ячейка для удаления мусора и клеточных агрегатов.
  7. Внесите 10 мкл каждого образца, чтобы быть окрашены и подсчета количества клеток для обоих легких и BM образцов с использованием гемоцитометра. Примечание: запись общего объема клеток.
  8. Гранул суспензии отдельных клеток легких клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин.
  9. Ресуспендируют обоих легких и Б. клеток 1х10 6 кл / мл в предварительно нагретого (37 ° С) DMEM + (среда Дульбекко изменение Орла, высокий уровень глюкозы (Gibco, Карлсбад, Калифорния; кошка # 11965-092), содержащей 2% фетальной Бовипе сыворотки (FBS) и 10 мМ HEPES.
  10. Подготовка 1mg/ml решение запас Hoechst 33342 красителя (Sigma Chemical Company, Сент-Луис, штат Миссури; кошка # B2261) в воде и фильтр стерилизовать 1,4. Красителем Hoechst могут быть сохранены как аликвоты при -80 ° C.
  11. Добавить Hoescht 33342 красителя конечной концентрации 5μg/ml (200x разбавления акции 1mg/ml) для суспензии отдельных клеток.
  12. Смешайте клетки, аккуратно инверсии и инкубировать в 37 ° С на водяной бане ровно 90 минут.

3. Окрашивание и приготовления суспензии клеток легких для анализа потока цитометрии

  1. Через 90 минут все шаги с Hoechst окрашенных клеток легких должны быть выполнены при температуре 4 ° С или на лед, чтобы предотвратить отток красителя. Гранул клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируйте клеток в ледяного буфера окрашивания (PBS +2% FBS).
  2. Ресуспендируют клетки в концентрации не более 1х10 7 клеток / трубка с использованием 300-600μl ФСБ, содержащий 2%FBS и 10 мМ HEPES.
  3. Добавить адекватно хихикал CD45 антитела (обычно 1:200 разбавление CD45-APC (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния; кошка # 559864) для легкого и Б. М. Инкубируйте образцы на льду в течение 10-15 мин в том числе неокрашенные контроль во время.. Экспериментальная процедура полезна для установки анализа ворота.
  4. Гранул клеток при 4 ° С в течение 5 мин при 1500 оборотах в минуту. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 500 мкл охлажденного буфера окрашивания (PBS +2% FBS). Трансфер в prechilled трубы колпачок оснастки полипропилена (Fisherbrand, Шаумбург, Иллинойс, кошкой № 14-956-1D).
  5. Добавить пропидий йодида (PI, 200μg/ml акций PBS) для образцов для конечной концентрации 2μg/ml для исключения мертвых клеток. П. должен быть использован в сочетании с красителем Hoechst 33342, чтобы достигнуть правильного флуоресценции профиля на проточной цитометрии.
  6. Магазин труб на льду, защищенном от света месте, пока анализ потока цитометрии.

4. Анализ проточной цитометрии для определения и изолятСтволовые легких мезенхимальные клетки (легких MSC) Доля населения, использующего Hoechst красителя для обнаружения истечения стороны населения (SP)

  1. Этот анализ имеет следующие требования инструмента:
    • 488 нм и УФ (350-355 нм) лазеры
    • 2 детектора на пути УФ лазер с синим (450/65) и красной (675/50) фильтры.
    • УФ-красный детектор должен иметь высокую чувствительность для красного сигнала. Это может быть проблема со взрослыми сортировщики клеток.
    • Чиллер блок для поддержания образца при 5-10 ° С.
  2. Совместите лазеров и создан для сортировки клеток следующий протокол производителя.
  3. Сбор красный (ось абсцисс) и синий (ось у) Hoechst сигналы с помощью линейного масштаба.
  4. Настройте напряжение ФЭУ разместить G0/G1 пика в верхней правой части центра на участке, чтобы обеспечить адекватное отображение задней стороны населения. Часть S-фазе и весь G2 клеточного цикла может зашкаливать от правой верхней части участка. Синий сигналNAL сравнительно яркой в ​​то время как красный сигнал тусклым. Типичные MoFlo XDP (Beckman Coulter, Майами, Флорида) напряжения 425 для синего и 650 для красного.
  5. Мертвые клетки с использованием закрытого PI. Стандартный путь PI (возбуждение 488nm, эмиссия 630 нм) могут быть использованы. Кроме того, П. И. также возбуждались УФ-лазера и мертвые клетки лежит населения зашкаливать от правой стороны населения (SP) сюжет. Это избавляет от необходимости компенсировать PI сигнал от любого другого флуорохромами таких как FITC и PE. Оригинальный метод Goodell следуют последней процедуры 5-7.
  6. Поддерживайте относительно низкий перепад давления во время анализа и сортировки для обеспечения плотного разрешением стороны населения.
  7. СП выступает как сторона руки в стороне от основной популяции клетки легких. Это население называется Hoechst низким.
  8. Hoechst низкой / SP анализируется для отдельных CD45 положительных и отрицательных групп населения, используя гистограммы 2,3 (Figure 1).
  9. После выбора и литниковой из Hoechst низкой CD45 нег населения легких MSC клетки могут быть собраны путем сортировки или как смешанное население в трубку или отдельные клетки, чтобы изолировать клонов в 96-луночного планшета 3.
  10. Для сортировки пластины отклонения рода поток регулируется до 25%, чтобы создать более вертикальной рода поток, чем обычно используется для трубки сортировки.
  11. Цель рода поток, посылая импульс тест потока на верхней левой, а затем нижний правый лунку 96-луночного планшета.
  12. Установите пластину сортировщик программного обеспечения карте внести необходимое количество клеток в каждую лунку.
  13. Чтобы выделить одну ячейку клоны одного MSC легких сортируется в колодец 96-луночного планшета в 150 мкл культуральной среды (α-MEM дополнена с 20% FBS). После рода дополнительные 100 мкл среды добавлены.

5. Изоляция, культуры и характеристика легких MSC и клонами

  1. Culturэлектронной и расширение смешанным населением MSC легких и одного клона ячейки следующих сортировки идентичны с использованием стандартных условиях культивирования (37 ° C, 5% СО 2 и> 95% влажности). Клетки имеют право придерживаться следующих изоляции в течение 16 часов. Медиа менять каждые 48 часов (α-MEM дополнена с 20% FBS). Когда клетки начинают размножаться быстрее и достигают 75-80% от слияния они пассировать (рис. 2).
  2. Клетки промывали нагретого HBSS и инкубировали с 0,5% трипсина / ЭДТА (Cellgro, Манассас, Вирджиния, кошка № 25-053-Cl) при 37 ° С менее чем за 2 мин. Клетки контролировать с помощью перевернутого рамки для подтверждения появлением клеточной суспензии.
  3. Легкого MSC затем делится на отношение 1:2 или 1:3 в зависимости от текущей скорости распространения культуры.
  4. Способность легких MSC дифференцироваться в традиционных мезенхимальных линий остеобластов, адипоцитов и хондроцитов и их клеточной поверхности, выражение принято мезенхимальных маркеры яы оценивается для каждой ячейки подготовки. Цитогенетические полосы анализа осуществляется также, чтобы подтвердить отсутствие грубых хромосомных аномалий 2,3,8-11.

6. Перечень легких MSC использованием формирующих колонию анализ (КОЕ-Ф)

  1. Развести клетки в полной среде MesenCult (Технологии стволовых клеток, Ванкувер, Британская Колумбия) до конечной концентрации 1х10 6 кл / мл.
  2. Выполните серийных разведений для достижения окончательной концентрации в 100 мм блюдо 6x10 4 клеток, 3x10 4 ячейки, 1,5 х10 4 клеток и 0,75 х10 4 клеток в 10 мл средства массовой информации. Анализы проводятся в двух экземплярах или трех экземплярах для каждой концентрации клеток и может масштабироваться для небольших участков поверхности.
  3. Культура клетки в течение 10 дней в стандартных условиях. На 10-й день клетки промывали PBS и фиксируется с помощью 100% метанола в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Определение КОЕ-Ф колоний путем окрашивания с 0,4% м / о решении окрашивания Гимзе(Sigma Chemical Co, Сент-Луис, Миссури), разбавленного 1:20 деионизированной водой. Разрешить образцы воздушно-сухой и количественно число колоний, содержащего более 25 клеток в колонии (рис. 3).

7. Анализ иммуномодулирующими свойствами легкого MSC на Т-клеточной пролиферации и апоптоза

  1. 6.25x10 4 легких MSC клеток на лунку высевают в 96-луночных планшетах и оставляют на ночь 2.
  2. CD4 + клетки селезенки Т-клеточный рецептор (TCR) трансгенных мышей, ОТ-II с Т-клетками, которые признают овальбумина 323-339 пептид, очищаются за счет истощения CD8 +, CD19 +, MHC-II + и CD25 + клеток с клетка Miltenyi AutoMACS сортировщик (Miltenyi, Оберн, Калифорния). Антиген представляющих клеток (АПК) изолированы положительно сортировки MHC-II + клеток 12.
  3. APC зафиксированы в 4% параформальдегида, промывают 3 раза в PBS / 5% BSA/2mM ЭДТА, с грузом 0.5μg/ml или 5 мкг / мл OVA323 пептида.
  4. Имитация, рост арестован APC добавляются в легких MSC в 96-луночных планшетах.
  5. Более 95% чистой CD4 + 1х10 5 клеток помечены 5 мкм карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE; Sigma, Сент-Луис MO) в PBS и инкубировали в течение 5 мин в темноте, промывали PBS-5% БСА, а затем добавил к APC и клетки легких MSC в DMEM 5% FBS СМИ. Затем клетки инкубировали в течение 96 часов.
  6. Т-клеток, которые затем окрашивали анти анти-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) и анализировали использованием Miltenyi MacsQuant 7 канале цитометра (Miltenyi, Aurburn, Калифорния) и FloJo анализ программного обеспечения (Treestar, Ashland, OR). Распространение определяется как снижение средней интенсивности флуоресцентного CFSE по сравнению с фоном, Т-клетки помечены CFSE и не подвергается APC (рис. 4). Т-клетки считаются в это время и жизнеспособность оценивали с исключением трипанового синий.

8. Представитель Результаты:


Рисунок 1. Проточной цитометрии анализа и определение легких MSC. Одноместный клеточные суспензии ткани легкого дайджеста окрашивали Hoechst 33342 и анализировали с помощью проточной цитометрии для определения различий в. рассеяния вперед (FSC) и бокового рассеяния (SSC) и B. Hoechst синий и красный флуоресценции. Наличие стороны населения (SP) видна в ворота. Hoechst низким SP затем анализируется для разделения Си. CD45 отрицательные населения легких MSC. CD45 положительного до отрицательного отношения легких СП, как правило, 70:30 / 60:40.

Рисунок 2
Рисунок 2. Выделение и культуры легких MSC. После сбора легких MSC путем сортировки клеток, клетки помещают в 30мм блюда с использованием α-MEM supplemных ориентированных с 20% FBS.. Недавно отсортированы клетки появляются маленькие, круглые и яркие. B. Примерно через 2-3 недели колонии с мезенхимальных фенотип становятся очевидными и распространение является более очевидной.

Рисунок 3
Рисунок 3. Перечисление MSC по формирующих колонию-фибробластов Пробирной. Расширенное легких MSC высевают в описанный протокол для КОЕ-Ф анализа. А. После 10 дней, а Гимза колонии очевидны. Б. Колонии большой и состоит из нескольких сотен клеток. C. клетки дисплей мезенхимальных фенотипа. & B, масштаб бар = 0,5 см; C Шкала бар = 0,14 см.

Рисунок 4
Рисунок 4. CFSE основе Т-клеток распространения Пробирной. При отсутствии MSC легких и наличием antigeн представляющих клеток (АПК) + / - овальбумина (OVA) CD40 положительных эффекторных Т-клеток демонстрируют снижение интенсивности CFSE что указывает пролиферации (красный круг). CFSE интенсивности флуоресценции Т-клеточной мембраны уменьшается с каждым стехиометрически т.е. деление клеток. с каждым делением. При наличии легкого MSC, APC + / - OVA, CD40 положительных эффекторных Т-клеток демонстрирует никаких существенных изменений в CFSE интенсивности, что указывает на отсутствие пролиферации (красный круг).

Discussion

Мы адаптировали метод первоначально использовался для выявления Б. М. гемопоэтических клеток, чтобы изолировать специфической популяции резидентов MSC легких. Из-за воспроизводимость изоляции этих клеток были тогда хорошо охарактеризованы как MSC. Их происхождение было определено в качестве резидента в легких взрослой мыши (в отличие от Б. М. производные) и фенотипические и молекулярного профиля документально 2. Способность неоднократно изолировать эту характеризуется населения позволяет дальнейшее изучение биологических значение и роль легких MSC в гомеостаз ткани и болезней. Последнее определение этой категории населения в естественных условиях и в мышиной и человеческой легочной ткани способствует развитию терапевтической стратегии, направленной на спасение эндогенные клетки для облегчения легкого ремонта в течение травмы и болезни.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась за счет грантов для SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Дополнительную поддержку оказали: DW: NIH RO1DK075013, DDK и Kleberg Фонда; UCCC Основные проточной цитометрии (NIH 5 P30 CA 46934-15), UCCC Microarray основных (NCI P30 CA 46934-14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
Hanks buffered salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30588.01
0.2% Worthington type 2 collagenase Worthington Biochemical LS004202
Red blood cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
DMEM Invitrogen 11965-092
H–chst 33342 dye Sigma-Aldrich B2261
CD45-APC BD Biosciences 559864
Propidium iodide Sigma-Aldrich 81845
a-MEM Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30265.01
FBS Invitrogen 16000-069
0.5% trypsin/EDTA Cellgro 25-053-Cl
Complete MesenCult Medium Stem Cell Technologies 05511
0.4% w/v Giemsa staining solution Sigma-Aldrich GS1L
4% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Sigma-Aldrich 21888

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. (2011).
  3. Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
  4. Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
  5. Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
  6. Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
  7. Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
  8. Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
  9. Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
  10. Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
  11. Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
  12. Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics