Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Biology
 

Summary

Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chow, K. S., Jun, D., Helm, K. M., Wagner, D. H., Majka, S. M. Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (56), e3159, doi:10.3791/3159 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Doku ikamet mezenkimal kök hücreler (MSC), doku tamiri veya rejenerasyonu, fibrozis, inflamasyon, anjiyogenez ve tümör oluşumuna önemli düzenleyiciler. Bu çalışmaların yerleşik akciğer MSC, pulmoner fibrozis (PF) ve arteryel hipertansiyon (PAH) gibi hastalıklar sırasında akciğer doku homeostazı, yaralanma ve onarım sırasında bir rol oynadığını düşündürmektedir birlikte ele alındığında. Burada yerleşik akciğer MSC bir nüfus tanımlamak için bir teknoloji. Bir belirteç tanımlamanız kullanarak in vivo akciğer dokusunda bu nüfus tanımı, akım sitometri ve belirli bir hücre tipi ve fonksiyon çalışma iyi karakterize bir kök hücre popülasyonunun tekrarlanan izolasyon kolaylaştırır .

Protocol

1. Akciğer İzolasyon

  1. Kurban steril tekniği kullanarak exsanguination tarafından takip izofluran aşırı dozda farelerin yetişkin farelerde (C57Bl6J; 18-20 g yaş 8-10 hafta). Profilleri suşları arasında biraz farklılık gösterecektir.
  2. Cerrahi, diyafram kaldırmak, farenin her iki tarafında yanal göğüs kafesi kesim tarafından göğüs boşluğuna açılır. 3-fosfat 5mls kullanarak, hafifçe sağ kalp ventrikül perfüze akciğerlerden kan yıkayın tamponlu salin (PBS).
  3. Tamponlu tuz (HBSS) Hanks ile dolu bir petri trakea ve büyük bronşların ve yer kaldırarak akciğer lobları parçalara ayır. Tüm akciğer lobları forseps aşağıdaki toplama çanağı kapağı üzerine doku yerleştirmek için kullanılır. Doku daha sonra float ve taşımak o kadar nemli değil tutmak için yeterli sıvı ile tek neşter kullanılarak küçük parçalar halinde doğranmış.
  4. Farelerin biri bir hindlimb inceleyin ve flo ayarlamak için bir boyama kontrolü olarak kullanmak üzere kemik iliğinden izolew sitometri kapıları. Kemik iliği (BM) daha önce 1 açıklanan Leke.

2. Akciğer Doku bir Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması

  1. 5mls steril HBSS çözünmüş önceden ısıtılmış% 0.2 Worthington tip 2 kollajenaz (kedi # LS004202 Biyokimyasallar Worthington, Lakewood, NJ): Her akciğer 0.2g hacmi oranı optimize edilmiş bir doku ağırlığı kullanılarak sindirilir. Karışım 30 dakika 2,3 37 ° C su banyosuna batırılır.
  2. Akciğer dokusunda sindirimi 10ml pipet (yaklaşık 10 tekrarlar) aracılığıyla kolayca akar kadar iyi örnek Karışım. 37 ek 15 dakika boyunca inkübe ° C daha düzgün bir tek hücre süspansiyonu doku sindirir ve sağlar tamamlamak için.
  3. HBSS ile akciğer hücre süspansiyonu seyreltilir ve kalıntı doku parçaları dağıtmak için 5ml pipet ile çiğnemek.
  4. Filtre sindirilememiş doku parçaları kaldırmak için 70μM bir hücre süzgeç kullanarak süspansiyonu. Örnek multipl ayrılabilirBu noktada e konik tüpler tek bir hücre süzgecinden aşırı yüklenmesini önlemek ve süresini azaltmak için.
  5. Pelet, 1500 rpm ve süzün süpernatantı 10 dakika için hücre süspansiyonu.
  6. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin; yeniden süspanse hücre pelletini yavaşça oda sıcaklığına eritrosit lizis tamponu (kedi # 00-4333-57 eBiosciences, San Diego, CA) kullanılarak. Lizis tamponu inaktive ve enkaz ve hücre agrega kaldırmak için 40μM bir hücre süzgeç kullanarak hücre süspansiyonu filtre HBSS bir eşit miktarda ekleyin.
  7. Her numunenin Pipet 10μl lekeli ve hem de akciğer ve hemasitometre kullanarak BM numuneleri hücre sayıları saymak. Not: hücrelerinin toplam hacmi kaydedin.
  8. Pelet için 1500 rpm'de 10 dakika santrifüj akciğer hücreleri tek hücre süspansiyonu.
  9. Içeren kedi # 11.965-092)% 2 fetal bovi; prewarmed 1x10 6 hücre / ml (37 ° C) DMEM + (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta, yüksek glukoz (Gibco, Carlsbad, CA, hem akciğer ve hem de BM hücrelerinin yeniden süspansene serum (FBS) ve 10mM Hepes.
  10. Hoechst 33.342 boya (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO; kedi # B2261) bir 1mg/ml stok solüsyonu hazırlayın, su ve 1,4 sterilize filtre . Hoechst boyası, -80 ° C alikotları olarak saklanabilir
  11. Tek hücre süspansiyonu 5μg/ml nihai konsantrasyonu (1mg/ml stokunun 200x seyreltme) Hoescht 33.342 boya ekleyin.
  12. 37 ° C su banyosunda tam 90 dakika boyunca hafifçe inversiyon ve inkübe hücreleri tarafından karıştırın.

3. Boyama ve Sitometrisi Analizi Akciğer Hücre Süspansiyon hazırlanması

  1. 90 dakika sonra Hoechst lekeli akciğer hücreleri ile tüm adımları, 4 ° C veya boya efflux önlemek için buz üzerinde yürütülmelidir. 4 az 10 dakika süreyle 1500 rpm'de santrifüj yoluyla Pelet hücreleri ° C ve buz boyama tamponu (PBS +% 2 FBS) hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
  2. Içeren PBS 2% 300 600μl kullanarak artık daha 1x10 7 hücre / tüp bir konsantrasyon yeniden süspanse hücrelerFBS ve 10mM Hepes.
  3. Akciğer ve BM örnekleri kedi # 559.864) 10-15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe sırasında bir lekesiz kontrolü dahil olmak üzere;. Yeterli CD45 antikoru (genellikle 1:200 seyreltme CD45 APC (BD Pharmingen, San Diego, CA tittered ekle deneysel işlemin analiz kapılarını ayarlamak için yararlıdır.
  4. 4 Pelet hücreleri ° C 1500 rpm'de 5 dakika. Soğutulmuş boyama tamponu (PBS +% 2 FBS) 500 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri Durusu. (; Kedinin # 14-956-1D Fisherbrand, Schaumburg, IL) prechilled ek bileşenini kap polipropilen tüplere aktarın.
  5. 2μg/ml ölü hücreleri hariç son bir konsantrasyon için örnekler (PI, PBS içinde 200μg/ml stok) propidium iyodür ekleyin. PI, akım sitometri analizi üzerine doğru floresan bilgilerini elde etmek için Hoechst 33.342 boya ile birlikte kullanılması gerekir.
  6. Mağaza tüpleri, buz üzerinde flow sitometri analizi kadar ışık korunmaktadır.

4. Sitometrisi Analizi tanımlayın ve yalıtınYan Nüfus (SP) Algılama Hoechst boyası efflux kullanarak Akciğer Mezenkimal Kök Hücre (akciğer MSC) Nüfus

  1. Bu testte aşağıdaki araç gereksinimleri vardır:
    • 488 nm ve UV (350-355 nm) lazerler
    • UV lazer yolu üzerinde mavi (450/65) ve kırmızı (675/50) filtreleri ile 2 dedektörleri.
    • UV kırmızı dedektörü kırmızı sinyal için yüksek hassasiyete sahip olmalıdır. Bu, eski hücre sorters ile ilgili bir sorun olabilir.
    • 5-10 örnek korumak için Chiller birimi ° C
  2. Lazerler hizalayın ve hücre sıralama aşağıdaki üretici protokolü için ayarlanmış.
  3. Kırmızı (x-ekseni) ve mavi (y-ekseni) doğrusal bir ölçek kullanılarak Hoechst sinyalleri toplayın.
  4. Sondaki yan nüfusun yeterli görüntü için izin merkezinde arsa üzerinde sağ üst G0/G1 tepe photomultiplier tüp gerilimler ayarlayın. , Hücre döngüsü, S-faz ve tüm G2 bir kısmı arsa sağ üst ölçekli olabilir. Mavi signal kırmızı sinyal zayıfsa, nispeten parlak. Tipik MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) gerilimler için 425 mavi ve kırmızı için 650.
  5. PI kullanılarak ölü hücreleri kapılı. Standart PI yolu (uyarma 488nm, emisyon 630nm) kullanılabilir. Alternatif olarak, PI de UV lazer tarafından heyecan ve ölü hücre popülasyonu, sağ tarafında yan nüfusun (SP) arsa üzerinde ölçekli yatıyor. Bu gibi FITC ve PE gibi diğer fluorochromes PI sinyal telafi etmek için ihtiyaç hafifletir. Orijinal Goodell yöntemi 5-7 ikinci prosedürleri takip etti.
  6. Analizi sırasında nispeten düşük bir basınç farkı korumak ve yan nüfusun sıkı bir çözünürlük sağlamak için sıralama.
  7. SP akciğer hücrelerinin ana nüfusu dışında bir yan kolu olarak görünür. Bu nüfus Hoechst düşük denir.
  8. Hoechst düşük / SP histogram 2,3 (F kullanarak CD45 pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için analizigure 1).
  9. Hoechst düşük CD45 negatif akciğer MSC nüfus seçimi ve yolluk ardından hücrelerin içine klonlar 96 plaka 3 izole etmek için, bir tüp ya da tek hücre içine da karışık bir nüfus olarak sıralayarak toplanmış olabilir .
  10. Sıralama akışı saptırma sıralama plaka genellikle tüp sıralama için kullanılan daha fazla dikey bir sıralama akışı oluşturmak için% 25 ayarlanır için.
  11. Sol üst üzerine bir test akışı darbe gönderip, daha sonra 96-iyi plaka iyi sağ alt sıralama akışı hedefliyoruz.
  12. Sıralayıcı yazılım plaka harita, her bir kuyunun içine istenilen sayıda hücre yatırmak için ayarlayın.
  13. Tek hücre klonları izole için tek bir akciğer MSC 96-iyi bir kültür ortamı 150μl (α-MEM% 20 FBS ile takviye) içine plaka kuyunun içine sıralanır. Sıralama ardından orta bir ek 100μl eklenir.

5. Akciğer MSC ve Klonlar izolasyonu, Kültür ve Karakterizasyonu

  1. Kültürsıralama aşağıdaki e karışık akciğer MSC nüfus ve tek bir hücre klonlar genişletilmesi ve standart kültür koşulları ile aynıdır (37 ° C,% 5 CO 2 ve% 95 nem). Hücreler 16 saat boyunca aşağıdaki izolasyon uymak için izin verilir. Medya (α-MEM% 20 FBS ile takviye) her 48 saatte bir değiştirilmelidir. Hücreler daha hızlı bir şekilde hızla artmaya başlar ve% 75-80 onlar geçişli kavşak (Şekil 2) arasında ulaşmak.
  2. Hücreler prewarmed HBSS ile durulanır ve% 0,5 tripsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, kedi # 25-053-Cl) ile inkübe 37 ° C 2 dakika daha az. Hücreler hücre süspansiyonu görünümünü teyit eden bir ters kapsamı kullanarak izlenir.
  3. Akciğer MSC kültürünün mevcut proliferasyon hızı bağlı olarak 1:2 veya 1:3 oranlarında ayrılır.
  4. Geleneksel mezenkimal adiposit ve kondrosit osteoblast soy ve kabul edilen mezenkimal belirteçlerin hücre yüzeyinde ifade ayırt etmek için akciğer MSC yeteneği iHer bir hücre hazırlama açısından değerlendirilmelidir. Sitogenetik bantlama analiz brüt kromozomal anormallikler 2,3,8-11 yokluğunda onaylamak için de yapılır .

6. Koloni Oluşturan Testi kullanılarak akciğer MSC sayımı (CFU-F)

  1. Komple MesenCult orta hücreler (Kök Hücre Teknolojileri, Vancouver, BC) 1x10 6 hücre / ml final konsantrasyonda seyreltilir.
  2. 6x10 4 hücreler, 3x10 4 hücreler, medya 10ml 1,5 x10, 4 hücreli ve 0,75 x10 4 hücreli bir 100mm çanak final konsantrasyonları elde etmek için seri dilüsyonları gerçekleştirin . Analizler her hücre konsantrasyonu için yinelenen ya da üç nüsha halinde yapılır ve daha küçük yüzey alanları için ölçekli olabilir.
  3. Standart şartlar altında 10 gün boyunca kültür hücreleri. Gününde 10 hücreler PBS ile yıkanır ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 100 metanol ile sabitlenir.
  4. % 0.4 w / v Giemsa boyama çözümü ile boyanarak CFU-F koloniler Algılama(Sigma Chemical Co, St Louis, MO), deiyonize su ile 1:20 seyreltilir. Kurumaya örnekleri İzin ve koloni başına 25 veya daha fazla hücre (Şekil 3) içeren kolonilerin sayısını ölçmek.

7. T-hücre Silahların Yayılmasının Önlenmesi ve Apoptoz akciğer MSC Bağışıklık Özellikleri Analizi

  1. 6.25x10 4 akciğer MSC hücreleri de ortalama 96-kuyucuğu kaplama ve bir gecede 2 durmak için izin verilir.
  2. CD4 + CD8 +, CD19 +, MHC-II + ve CD25 + hücreler ile tüketen ovalbumin 323-339 peptid tanıyan T hücreleri ile T-hücre reseptör (TCR) transgenik farelerin, OT-II, dalak hücreleri ile saflaştırılır Miltenyi AutoMACS hücre sıralayıcı (Miltenyi, Auburn, CA). Antijen sunan hücreler (APC), olumlu MHC-II + hücreler 12 sıralama izole edilmiştir.
  3. APC, 4% paraformaldehid sabit PBS /% 5 BSA/2mM EDTA 3 kez yıkanmış ve 0.5μg/ml veya 5μg / m yüklül OVA323 peptid.
  4. APC tutuklandı Simüle, büyüme, 96-kuyucuğu akciğer MSC eklenir.
  5. Büyüktür% 95 saf CD4 + 1x10 5 hücre 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE Sigma, St.Louis MO) ile etiketli PBS içinde ve 5 dakika süreyle karanlıkta inkübe, PBS-5% BSA ile yıkanır ve sonra da eklendi DMEM% 5 FBS medya APC ve akciğer MSC hücreleri. Hücreler daha sonra 96 ​​saat inkübe edilir.
  6. CD4 (APC Cy7), CD8 (ViolBlue); T-hücrelerinin sonra anti anti-CD40 (Cy5) ile boyanarak Vbeta 5 (PE) ve Miltenyi MacsQuant 7 kanal akış sitometresi (Miltenyi, Aurburn, CA) kullanılarak test FloJo analiz yazılımı (Treestar, Ashland, OR). Silahların Yayılmasını Önleme KAKE ortalama floresan yoğunluğunda azalma gibi arka plana göre ölçülür, T hücreleri KAKE ile etiketli ve (Şekil 4), APC için maruz kalmaz. T-hücreleri trypan mavisiyle boyama ile değerlendirildi ve canlılık bu sefer sayılır.

8. Temsilcisi Sonuçlar:


Şekil 1: Akış sitometrik analizi ve Akciğer MSC tanımı. Akciğer dokusunda sindirmek Tek hücre süspansiyonları Hoechst 33.342 ile boyanmış ve A farklılıkları saptayabilmek için flow sitometri ile analiz edilir. forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ve B. Hoechst mavi ve kırmızı floresan. (SP) bir yan nüfusun varlığı kapı görünür. Hoechst düşük SP sonra C ayırmak için analiz edilir. CD45 negatif nüfus akciğer MSC. Akciğer SP negatif oranları CD45 pozitif tipik 70:30 / 60:40.

Şekil 2
Şekil 2. Akciğer MSC İzolasyon ve Kültür. Hücre sıralayarak akciğer MSC toplanması ardından, hücreleri α-MEM supplem kullanarak 30mm yemekler kaplama% 20 FBS ented. Taze sıralanmış hücreleri, küçük, yuvarlak ve parlak görünüyor. B . Mezenkimal fenotip ile yaklaşık 2-3 hafta koloniler belirginleştiği ve çoğalması daha açıktır.

Şekil 3
Şekil 3: Koloni Oluşturan Fibroblast Testi MSC sayımı Genişletilmiş akciğer MSC A., 10 gün sonra. CFU-F testi için açıklanan protokol başına kaplama ve Giemsa leke koloniler açıktır. B. Kolonileri büyük ve oluşan birkaç yüz hücrenin C. hücreler, mezenkimal fenotip gösterir . A & B, Ölçek bar = 0,5 cm, C Ölçek çubuğu = 0.14 cm.

Şekil 4
Şekil 4 KAKE Tabanlı T hücre Silahların Yayılmasının Önlenmesi Testi. Akciğer MSC antige varlığı ve yokluğun sunan hücreler (APC), + / - ovalbumin (OVA) CD40 pozitif efektör T hücre çoğalması (kırmızı daire) gösterir KAKE yoğunluğu azalma göstermektedir. T-hücre zarının KAKE floresan, her hücre bölünmesi yani ile stoichiometrically azalır. Her bölünme, ayrılma. + / - OVA akciğer MSC, APC, varlığı, CD40 pozitif efektör T hücre çoğalmasının (kırmızı daire) eksikliği gösterir KAKE yoğunluğu önemli bir değişiklik göstermektedir.

Discussion

Biz başlangıçta belirli bir nüfusun ikamet akciğer MSC izole etmek için BM hematopoetik hücreleri tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir adapte var. Izolasyon tekrarlanması nedeniyle bu hücreler daha sonra MSC olarak karakterize edilmiştir. Kökenlerine, yetişkin fare akciğer ikamet (elde edilen BM karşı) ve 2 belgelenmiş bir fenotipik ve moleküler profil olarak tanımlanmıştır . Bu karakterize nüfusun sürekli olarak izole etmek için doku homeostazı ve hastalık sırasında biyolojik önemi ve akciğer MSC rolü daha fazla çalışma yeteneği sağlar. In vivo fare ve insan akciğer dokusunda bu nüfus son tanımı, yaralanma ve hastalık sırasında akciğer onarım kolaylaştırmak için endojen hücreleri kurtarma yönelik bir tedavi stratejisi gelişimini kolaylaştırır .

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01: Bu çalışma SMM hibe tarafından finanse edildi. Ek destek: DW: NIH RO1DK075013, DDK ve Kléberg Vakfı; UCCC Flow Sitometri Çekirdek (NIH 5 P30 CA 46.934-15), UCCC Mikroarray çekirdekli (NCI P30 CA 46.934-14) tarafından sağlanan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P-5368
Hanks buffered salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30588.01
0.2% Worthington type 2 collagenase Worthington Biochemical LS004202
Red blood cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
DMEM Invitrogen 11965-092
H–chst 33342 dye Sigma-Aldrich B2261
CD45-APC BD Biosciences 559864
Propidium iodide Sigma-Aldrich 81845
a-MEM Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30265.01
FBS Invitrogen 16000-069
0.5% trypsin/EDTA Cellgro 25-053-Cl
Complete MesenCult Medium Stem Cell Technologies 05511
0.4% w/v Giemsa staining solution Sigma-Aldrich GS1L
4% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Sigma-Aldrich 21888

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. (2011).
  3. Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
  4. Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
  5. Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
  6. Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
  7. Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
  8. Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
  9. Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
  10. Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
  11. Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
  12. Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics