एलेक्सा Fluor लेबल के माध्यम से डेंगू वायरस Visualizing

Published 7/09/2011
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Immunology and Infection

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Summary

Fluorophore विकास और इमेजिंग तकनीक, Alexa Fluor लेबलिंग डेंगू के वायरस वायरस और सेल के बीच बातचीत जल्दी कल्पना करने के लिए तैयार किया गया था की एक सरल विधि के क्षेत्र में प्रगति का लाभ उठाते हुए.

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Zhang, S., Tan, H. C., Ooi, E. E. Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling. J. Vis. Exp. (53), e3168, doi:10.3791/3168 (2011).

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Abstract

वायरस और सेल के बीच बातचीत में जल्दी घटनाओं संक्रमण के परिणाम पर गहरा प्रभाव हो सकता है. निर्धारण कारक है कि इस बातचीत को प्रभावित रोग रोगजनन की बेहतर समझ के लिए नेतृत्व और इस तरह से टीका या चिकित्सीय डिजाइन को प्रभावित कर सकता है. इसलिए, विधियों के विकास के लिए इस बातचीत की जांच उपयोगी होगा. Fluorophores विकास 1-3 और इमेजिंग प्रौद्योगिकी 4 में हाल ही में प्रगति डेंगू रोगजनन पर हमारे वर्तमान ज्ञान में सुधार और इस प्रकार सालाना घटनेवाला डेंगू संक्रमण के लाखों को कम करने के लिए मार्ग प्रशस्त करने के लिए शोषण किया जा सकता है.

छा डेंगू वायरस के लिए एक बाहरी पाड़ 90 लिफाफा glycoprotein (ई) nucleocapsid खोल, जो एक सकारात्मक भूग्रस्त आरएनए जीनोम 5 शामिल रक्षा dimers से मिलकर की है. वायरस की सतह पर समान प्रोटीन सब यूनिटों को इस तरह से एक amine प्रतिक्रियाशील डाई के साथ लेबल किया जा सकता है और immunofluorescent माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना. यहाँ, हम Alexa Fluor succinimidyl एस्टर डाई सोडियम बिकारबोनिट बफर है कि लेबलिंग के बाद अत्यधिक व्यवहार्य वायरस झुकेंगे में सीधे भंग के साथ डेंगू वायरस की लेबलिंग का एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं. जीवित वायरस और मौजूदा निर्माता प्रोटोकॉल के लिए प्रोटीन लेबलिंग आमतौर पर डाइमिथाइल sulfoxide में डाई के पुनर्गठन की आवश्यकता है की लेबलिंग के लिए कोई मानकीकृत प्रक्रिया है. डाइमिथाइल sulfoxide की उपस्थिति भी मिनट मात्रा में, इस वायरस के उत्पादक संक्रमण ब्लॉक और भी सेल cytotoxicity 6 प्रेरित कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में डाइमिथाइल sulfoxide के उपयोग के अपवर्जन इस प्रकार इस संभावना को कम. एलेक्सा Fluor रंजक बेहतर photostability है और fluorescein और rhodamine 2 के रूप में आम रंजक, की तुलना में कम पीएच के प्रति संवेदनशील हैं, उन्हें सेलुलर तेज और वायरस के endosomal परिवहन पर अध्ययन के लिए आदर्श बना. Alexa Fluor डाई के संयुग्मन लेबल डेंगू वायरस के वायरस विशेष एंटीबॉडी और मेजबान 7 कोशिकाओं में अपने ख्यात रिसेप्टर्स द्वारा मान्यता को प्रभावित नहीं किया. इस विधि virological अध्ययन में उपयोगी अनुप्रयोगों सकता है.

Protocol

1. डेंगू वायरस के Alexa Fluor लेबलिंग

  1. लेबलिंग प्रतिक्रिया से पहले, sucrose के तकिया के साथ डेंगू वायरस शुद्ध और आवश्यक अभिकर्मकों और उपकरणों के रूप में प्रोटोकॉल में संकेत दिया तैयार.
  2. ताजा 0.2M सोडियम बिकारबोनिट बफर, 8.5 पीएच (लेबलिंग बफर), और 1.5M hydroxylamine बफर, 8.3 पीएच (अभिकर्मक बंद) तैयार, बस से पहले लेबलिंग और फिल्टर 0.2μm सिरिंज फिल्टर के साथ बाँझ.
  3. लगभग एक 2ml ट्यूब में बफर लेबलिंग के 1ml में डेंगू वायरस शुद्ध 3x10 8 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) पतला. यह वायरस के बैच लेबलिंग के लिए आनुपातिक बढ़ाया जा सकता है.
  4. Lyophilized Alexa 594 Fluor (AF594) लेबलिंग प्रतिक्रिया से पहले तुरंत बफर लेबलिंग में 1mm succinimidyl एस्टर reconstitute. एलेक्सा Fluor डाई श्रृंखला से अन्य fluorochromes एक आवश्यकताओं के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है. इस कदम के बाद से प्रकाश जोखिम न्यूनतम.
  5. पतला वायरस 1mm AF594 डाई के 100μl जोड़ें जबकि विंदुक टिप के साथ धीरे क्रियाशीलता.
  6. अंधेरे में 1hr के लिए लेबलिंग कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं. कोमल व्युत्क्रम हर 15mins द्वारा मिक्स.
  7. एक tabletop अपकेंद्रित्र में ट्यूब संक्षिप्त स्पिन और प्रतिक्रिया मिश्रण को रोक अभिकर्मक के 100μl जोड़ने जबकि विंदुक टिप के साथ धीरे क्रियाशीलता.
  8. अंधेरे में एक अतिरिक्त घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. कोमल व्युत्क्रम हर 15mins द्वारा मिक्स.

2. शुद्ध Alexa Fluor डेंगू वायरस लेबल

  1. इस बीच में, पसंद के बफर के साथ शुद्धि स्तंभ संतुलित. इस प्रयोग में एक स्तंभ पीडी 10-HNE बफर के 25ml (5mm Hepes, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA), पीएच 7.4 उपयोग करने से पहले के साथ equilibrated है.
  2. स्तंभ के शीर्ष करने के लिए वायरस लेबल लागू करें और एक बार लेबल वायरस मैट्रिक्स में प्रवेश करती है के माध्यम से प्रवाह संग्रह शुरू. HNE बफर के साथ स्तंभ भरें एक बार सभी लेबल वायरस मैट्रिक्स में प्रवेश किया है. प्रवाह के माध्यम से पहली 2.5ml त्यागें और लेबल वायरस अंश के अगले 2ml इकट्ठा.
  3. विभाज्य और दुकान -80 में AF594 लेबल डेंगू वायरस शुद्ध ° सी, प्रकाश स्रोत से दूर.
  1. एक विभाज्य पहले गला लें और पट्टिका परख द्वारा लेबल वायरस के टिटर निर्धारित लेबल वायरस के बैच का उपयोग करने से पहले.
  2. 5x10 वेरो कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 4 बीज, 4 अच्छी तरह से अच्छी तरह से संक्रमण से पहले एक दिन के तल पर एक coverslip के साथ एक थाली में एम 199 मध्यम विकास में हो.
  3. अच्छी तरह से संस्कृति की सतह पर तैरनेवाला निकालें और 37 पर 1 के संक्रमण के 100μl मात्रा में लेबल वायरस (M-199 रखरखाव माध्यम के रूप में आवश्यक में पतला) की बहुलता के साथ 10min के लिए कोशिकाओं को संक्रमित डिग्री सेल्सियस
  4. Inoculums निकालें और coverslips 1xPBS में दो बार धोने.
  5. 30mins के लिए 3% paraformalydehyde में कोशिकाओं को ठीक करें.
  6. 1xPBS में coverslips 3 बार धोएं.
  7. Permeabilization समाधान के साथ कोशिकाओं को 0.1% और 30mins के लिए 1xPBS में 5% BSA सैपोनिन युक्त Permeabilize.
  8. साथ कोशिकाओं सेते undiluted centrifugation स्पष्ट लिए एक उमस भरे कक्ष में 1hr 3H5 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी हाइब्रिडोमा संस्कृति की सतह पर तैरनेवाला, प्रकाश से सुरक्षित है.
  9. धोने बफर में coverslips 3 बार धो (1xPBS 1mm कैल्शियम क्लोराइड, 1mm मैग्नीशियम क्लोराइड और 0.1% सैपोनिन युक्त).
  10. AF488 विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, 1:100 permeabilization समाधान में उमस भरे कक्ष में 45mins, प्रकाश से रक्षा के लिए पतला.
  11. धो धो बफर में coverslips 3 बार और विआयनीकृत जल में एक बार कुल्ला.
  12. थपका के लिए अतिरिक्त पानी के निकास और 8μl Mowiol 4-88 युक्त 2.5% Dabco के साथ गिलास स्लाइड पर माउंट एक कागज तौलिया के खिलाफ coverslip के किनारे.
  13. एक Zeiss confocal खुर्दबीन का उपयोग कर देखने से पहले बढ़ते 4 बजे समाधान रातोंरात सेट ° C की अनुमति दें. अनुक्रमिक अधिग्रहण और concomitantly डिटेक्टरों के बीच स्विचन समय पर रोमांचक एक fluorophore प्रदर्शन करना चाहिए.
  14. छवियाँ तो लेबल वायरस के साथ ई प्रोटीन एंटीबॉडी धुंधला Zeiss LSM ज़ेन सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए लेबलिंग डिग्री का अनुमान सह स्थानीयकरण के लिए विश्लेषण कर रहे हैं.

3. प्रतिनिधि परिणाम

डेंगू वायरस AF594 डाई के साथ लेबल की उपज का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. आम तौर पर, प्रारंभिक टिटर से ड्रॉप 10 गुना से भी कम सफल लेबलिंग के बाद मनाया जाना चाहिए. हालांकि, यह नोट किया जाना चाहिए कि सभी बफ़र्स सफल होने और एलेक्सा Fluor succinimidyl एस्टर पुनर्गठन पर तुरंत किया जाना चाहिए के रूप में वे जलीय 8 समाधान में nonreactive मुक्त एसिड में hydrolyze लेबलिंग के लिए नए सिरे से तैयार किया जा.

अगले, लेबल वायरस के प्रयोगों में उपयोग करने से पहले पर्याप्त प्रतिदीप्ति के लिए जाँच की जानी है. एक सरल immunofluorescence परख वेरो कोशिकाओं पर किया गया था और लेबलिंग की डिग्री विरोधी ई प्रोटीन एंटीबॉडी धुंधला के साथ लेबल वायरस के सह स्थानीयकरण से अनुमान लगाया जा सकता है. तोड़ देनाअल कोशिकाओं की जांच की और एक ठेठ confocal छवि 3 चित्र में दिखाया गया है. LSM ज़ेन 0.65 से 0.8 करने के लिए लेकर गुणांक ओवरलैप प्रदर्शन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, सुझाव है कि virions की लगभग 65 से 80% डाई के साथ लेबल रहे थे छवियों के विश्लेषण के सह - स्थानीयकरण.

चित्रा 1
चित्रा 1.Overall योजना Alexa Fluor डाई लेबलिंग डेंगू वायरस प्रक्रिया का चित्रण सबसे पहले, प्रासंगिक buffers और शुद्ध डेंगू वायरस को तैयार हैं . एलेक्सा Fluor डाई पुनर्गठन और लेबलिंग बफर में पतला डेंगू वायरस के लिए जोड़ा है. प्रतिक्रिया तो रोक अभिकर्मक के अलावा के साथ 1 घंटे बाद बंद कर दिया. बाद में, लेबल वायरस एक आकार अपवर्जन स्तंभ के माध्यम से शुद्ध होता है करने के लिए स्वतंत्र डाई हटाने. अंत में, लेबल वायरस पट्टिका परख द्वारा पुनः titrated और प्रतिदीप्ति के लिए परीक्षण किया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2. मीन व्यवहार्य virions (pfu / एमएल) के रूप में पहले और बाद AF594 लेबलिंग एक पट्टिका परख पर निर्धारित की संख्या AF594 लेबल डेंगू वायरस का एक विभाज्य और thawed पट्टिका परख द्वारा पुनः - titrated और यह आम तौर पर कम से कम 10 गुना बूंद से दिखाता है. शुरू टिटर. त्रुटि सलाखों के डुप्लिकेट के मानक विचलन का संकेत मिलता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. वेरो कोशिकाओं में डेंगू वायरस ई प्रोटीन के साथ AF594 लेबल के सह - स्थानीयकरण. Coverslips पर दिन हो पहले कोशिकाओं AF594 MOI में 10 मिनट के लिए 1 के लेबल डेंगू के साथ 37 संक्रमित थे डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं बाद में तय की और विरोधी ई एंटीबॉडी के साथ लेबल, और ई प्रोटीन की colocalization (हरा) और लेबलिंग AF594 (लाल) के लिए जांच. प्रतिदीप्त संकेतों 63X आवर्धन के तहत Zeiss LSM 710 confocal खुर्दबीन का उपयोग कल्पना थे. स्केल बार 10μm है. पीला colocalization के क्षेत्रों से संकेत मिलता है, के रूप में इनसेट में दिखाया गया है.

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Discussion

हालांकि इस रिपोर्ट में AF594 डाई इस्तेमाल किया गया था, इसी तरह की लेबलिंग रसायन शास्त्र के साथ Alexa Fluor succinimidyl एस्टर श्रृंखला में fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध है. यह इमेजिंग परे लेबलिंग आवेदन का विस्तार कर सकता है. प्रवाह cytometry fluorophores है कि और उत्साहित किया जा सकता है FACS मशीन द्वारा पता लगाया के लिए लेबलिंग की डिग्री का आकलन करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी के लिए एक विकल्प के रूप में में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Alexa Fluor रंजक छोटे अणुओं है कि मुक्त एमिनो समूहों, मुख्य रूप से arginine और lysine 9, प्रोटीन के सामान्य जावक अवशेषों का सामना करना पड़ के साथ प्रतिक्रिया कर रहे हैं. Alexa Fluor 594 डाई 100μM के साथ डेंगू वायरस के बारे में हमारी प्रयोगशाला संयुग्मन, में इमेजिंग के लिए वायरल टिटर में कम से कम नुकसान के साथ पर्याप्त चमक प्रदान की. अलग चमक डाई की एकाग्रता इस्तेमाल अलग से हासिल किया जा सकता है. हालांकि, डाई एकाग्रता बढ़ाने वायरस 7,10 व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं. एक संभव सीमा रिसेप्टर fluorophores द्वारा उपयोग की नाकाबंदी के कारण बंधन में हस्तक्षेप है. इसलिए, आवेदन पर निर्भर करता है, लेबलिंग के एक इष्टतम स्तर लेबलिंग और कार्यात्मक abrogation10 की डिग्री के बीच एक संतुलन सुनिश्चित करने के लिए निर्धारित होना चाहिए. कृपया ध्यान दें कि एकाग्रता Alexa Fluor succinimidyl 8 एस्टर की पैकेजिंग के बाद जेट ने भी प्रभावित किया जा सकता मत करो.

एलेक्सा Fluor यहाँ प्रस्तुत डाई के साथ डेंगू वायरस के प्रत्यक्ष लेबलिंग के किसी भी अतिरिक्त लेबलिंग कदम वायरस कल्पना करने के लिए, इस प्रकार अप्रत्यक्ष antiviral एंटीबॉडी से गैर विशिष्ट धुंधला की संभावना को हटाने की आवश्यकता नहीं है. यह भी सेल रहते इमेजिंग में पोस्ट internalization घटनाओं के वास्तविक समय पर नज़र रखने के लिए अनुमति देता है. इस विधि को अपेक्षाकृत सरल है, और क्योंकि संयुग्मन स्थिर है, यह उत्पादन और कई प्रयोगों के लिए बैच लेबल वायरस की दुकान lipophillic लंबी श्रृंखला carbocyanine1, 1 dioctadecyl-3, 3 जैसे फ्लोरोसेंट रंजक, विरोध के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, 3,3 tetramethylindodicarbocyanine (क्या) या styryl रंजक, जो ठंड में अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए संग्रहीत नहीं किया जा सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

यह काम राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद, सिंगापुर द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Hydroxylamine Sigma-Aldrich 159417
Sodium hydroxide Merck & Co., Inc. 106498
AF594 succinimidyl esters Molecular Probes, Life Technologies A20004
PD-10 column GE Healthcare 17-0851-01
Hepes Sigma-Aldrich H6147
NaCl Sigma-Aldrich S3014
EDTA Sigma-Aldrich E9884
M-199 Invitrogen 11150
FBS Hyclone SH30070.03
4-well plate Nalge Nunc international 176740
Coverslips Einst 0111520
Microscope slide Sail Brand 7105
3H5 hybridoma ATCC HB46
10x PBS BUF-2040-10X1L 1st Base
Saponin Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A7906
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2670
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Paraformaldehye Sigma-Aldrich 15,812-7
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Dabco Sigma-Aldrich D27802
Tabletop centrifuge Eppendorf 5424
Confocal microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710
To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.
To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter.

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References

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