باستخدام المنهج المقارن الأنواع المعنية بالتحقيق في البيولوجيا العصبية للردود الأبوية

Neuroscience
 

Summary

نهج المقارنة الأنواع يسمح علماء الأعصاب السلوكي لاستكشاف العوامل العصبية الحيوية المختلفة المرتبطة سلوكيات محددة تعتبر من سمات نموذج حيواني محدد. الاستفادة من الخلافات التي تحدث بشكل طبيعي في السلوك يرتبط ارتباطا وثيقا بين الأنواع ، هذه التقنية لا تتطلب تقنيات الغازية لمعالجة التعبير عن السلوك.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Franssen, C. L., Bardi, M., Lambert, K. G. Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses. J. Vis. Exp. (55), e3173, doi:10.3791/3173 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

والهدف من علم الأعصاب السلوكي هو تحديد العوامل الكامنة وراء العصبية الحيوية التي تنظم سلوكيات معينة. باستخدام نماذج حيوانية لتحقيق هذا الهدف ، والاستراتيجيات المنهجية تتطلب الكثير من التقنيات الغازية لمعالجة شدة السلوك من الفائدة (على سبيل المثال ، وأساليب الآفة ، التلاعب الدوائي ، والتقنيات microdialysis ، النماذج الحيوانية المهندسة وراثيا). استخدام منهج المقارنة الأنواع يسمح للباحثين للاستفادة من الخلافات التي تحدث بشكل طبيعي في استراتيجيات الاستجابة الموجودة في الأنواع ذات صلة وثيقة. في المختبر ، ونحن استخدام نوعين من جنس Peromyscus التي تختلف في ردود الأب. يسلك الماوس الغزلان المشتركة (Peromyscus maniculatus) الأيل كاليفورنيا الذكور الماوس (Peromyscus californicus) يسلك نفس الاستجابات الوالدية والأنثى في حين ابن عم لها ، يكاد لا توجد ردود تغذية / الأبوية في وجود الجراء. من مصلحة محددة في هذه المقالة هو استكشاف العوامل العصبية الحيوية المرتبطة ردود affiliative الاجتماعية التي أظهرتها الماوس الأب الغزلان ولاية كاليفورنيا. لأن منهج علم الأعصاب السلوكي متعدد الأوجه ، وسوف تكون المكونات الرئيسية التالية من الدراسة تناولها بإيجاز هي : تحديد الأنواع المناسبة لهذا النوع من البحوث ؛ جمع البيانات لأغراض التحليل السلوكي ، وإعداد وsectioning للأدمغة ؛ الخطوات الأساسية لتشارك في كيمياء سيتولوجية مناعية القياس الكمي للتفاعلية مناعية ، فاسوبريسين ، واستخدام البرمجيات لتصوير الأعصاب قياس أنسجة المخ ، واستخدام تحليل الفيديو microsequencing ليسجل السلوك ، وأخيرا ، فإن التحليلات الإحصائية المناسبة لتوفير أكثر التفسيرات المستنيرة للنتائج البحوث.

Protocol

1. تحديد نموذج حيواني

  1. الماوس دير كاليفورنيا (Peromyscus californicus) هو النموذج المثالي لاستكشاف ردود الأب. كما ترون ، هذا الفأر العرسان الجراء تماما كما تفعل الأمهات -- هم يجثم فوقها حتى بحيث يبدو مثل الجراء والتمريض. مقارنة بين سلوك الفئران كاليفورنيا إلى أنواع من جنس نفسه ، الماوس الغزلان المشتركة (Peromyscus maniculatus) الذي يسلك القليل من الاهتمام في الجراء ، في محاولة للهروب كثير من الأحيان ، أو حتى الاعتداء عليهم. (انظر الشكل 1 للحصول على صور من هذه الأنواع التفاعل مع الجراء).
  2. مرة واحدة وقد تم التعرف على الأنواع ثم نموذج مختلف المجموعات التي ستنشأ الحاجة. في هذه الدراسة ، تستخدم الآباء البيولوجية ، وعذارى بلا خبرة الأبوة والأمومة ، والعذارى مع التعرض الجرو محدودة (الجرو المعرضة للآباء أو تعزيز) من كلا النوعين بحيث يمكن تقييم خصائص كل من الأب وميالا المكتسبة. في هذه الدراسة ولا سيما أننا يتعرض أيضا لجميع الفئات ماوس لعبة الجرو أن أؤكد أن التفاعلات الاجتماعية ومحددة لاستجابة الجرو وليس ممثلا لشيء وضعها في قفص (انظر الشكل 2).
  3. قبل التحقيق العوامل العصبية الحيوية ، فمن المهم للتأكد من أن الأنواع المختارة يحمل اختلافات واضحة في سلوك الفائدة. في هذه الدراسة ، يتم وضعها في قفص الذكور مع الجرو لمدة خمس دقائق وethogram السلوك الأبوي (انظر الجدول رقم 1 على سبيل المثال من ethogram) يستخدم لدرجة السلوكيات مثل الكمون من الاقتراب من الجرو ومقدار الوقت الذي يقضيه في الاتصال مع الجرو. إذا لاحظ الاستجابات العدوانية ، ويتم إزالة الجرو فورا. غالبا ما يتم تصويرها بالفيديو هذه الدورات حتى يمكن إجراء تحليل دقيق السلوكية التي أجريت في وقت لاحق.

2. إعداد أنسجة المخ

  1. بعد نضح القياسية لكل الماوس (البروتوكول المرفق) ، تتم إزالة العقول بحيث يمكن مقطوع في منطقة محددة من الفائدة (الدماغ تظهر).
  2. ويستخدم معيار دماغ الفأر الأطلس (اعرض أطلس) لتحديد موقع مجاور للبطين في النواة تحت المهاد ، وهي منطقة معروفة لتكون غنية في الخلايا المنتجة للneuropeptide من الاهتمام في هذه الدراسة -- فاسوبريسين (AVP).
  3. ثم يتم حظر المخ وتركيبه على تجميد تشوك بحيث الأنسجة ستجمد قبل مقطوع مع مشراح. الدماغ هو مقطوع في وضع تقليم حتى يتم تحديد معالم محددة ، ثم يتم تعيين سمك الدماغ محددة ، و 30 ميكرون في هذه الحالة ، لأقسام المخ تستخدم للتحليل.
  4. توضع بعناية أقسام المخ جيدا في لوحات مليئة المالحة العازلة الفوسفات (PBS) ، (بروتوكول لبرنامج تلفزيوني المرفق ؛ يرجى ملاحظة أن هذا ليس سوى مثال واحد على بروتوكول كيمياء سيتولوجية مناعية قياسي).

3. كيمياء سيتولوجية مناعية

  1. طوال مختلف مراحل هذه العملية (انظر البروتوكول المرفق) ، فمن المهم أن تكون دقيقة pipetting المهارات لضمان قياسات دقيقة للمواد الكيميائية وغيرها من المكونات الهامة لهذه التقنية (اعرض pipetting طالب).
  2. الخطوة الأولى في هذه العملية هو غسل أدمغة الذي ينطوي على الاستعاضة عن برنامج تلفزيوني في لوحات بكثير عن ثلاثة إلى خمسة أضعاف ، وبين كل تغسل وتوضع على لوحات جيدا على الكرسي الهزاز لمدة 10 دقيقة (PBS تظهر الطالب استبدال لوحات ووضع جيد على الروك) .
  3. ثم يتعرض شرائح الدماغ إلى حل الضد الأولية وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل على الكرسي الهزاز (عملية عرض).
  4. بعد غسل آخر ، يتعرض للشرائح الدماغ إلى الضد الثانوية لمدة ساعة على مغني الروك في درجة حرارة الغرفة ، ثم غسلها مرة أخرى.
  5. القادم يتعرض لها العقل لإيجاد حل Avitin - البيوتين مجمع للتحضير للتصور من الخلايا الكيميائية العصبية إيجابية.
  6. للخطوة التصور النهائي ، يتعرض لها العقل لDAB. هذا هو منتج الخطرة ويجب دائما أن يكون التعامل معها بحذر. كما يتضح هنا ، شرائح الدماغ تبدأ في الحصول على أكثر قتامة أمام عينيك (اعرض العملية).
  7. بعد التعرض DAB ، والعقول تذهب من خلال سلسلة من الماضي ويغسل ثم وضعت بعناية على شرائح المجهر SUBBED وسمح لتجف بين عشية وضحاها (اعرض موضع شريحة الدماغ على شريحة ، انظر المرفقات للبروتوكول الشرائح SUBBED).
  8. ثم يتم مسح الشرائح من خلال سلسلة من يغسل الماء المقطر والكحول ، وأخيرا يجري المغمورة في Citrosolv قبل coverslipped وتخزينها في slidebox لحفظها في مكان آمن (إظهار الجوانب المختلفة لهذه العملية ، انظر المرفق لعملية تبادل المعلومات).

4. Neuroquantification

  1. بعد الشرائح قد جفت ، ويمكن تقييمهم مع برنامج neuroquantification المتخصصة. وتستخدم البرمجيات Bioquant هنا لتحديد الخلايا فاسوبريسين ايجابية والألياف في نواة مجاور للبطين من أدمغة فئران (عرض البرنامج على الشاشة... والمجهر).
  2. تم تحديد منطقة معينة من الاهتمام باستخدام خيارات القياسمن البرنامج لإنشاء المجال البصري للneuroquantification. من المهم أن يتم كميا متناسقة حجم الحقل البصري لكل حيوان (طالب تظهر القيام بذلك).
  3. هنا ملطخة بحزن أجسام الخلايا فاسوبريسين مناعيا ، والألياف واضحة. لأنه من الصعب الاعتماد أو تتبع هذا النسيج ، وهي ميزة خاصة من هذا البرنامج يستخدم لتحديد thresholding ضوء المبلغ الإجمالي للنسيج ملون إيجابيا داخل منطقة محددة من الفائدة. هذا thresholding يخبرنا كم من المنطقة المحددة الواردة فاسوبريسين إيجابية الأنسجة (تظهر قيمة البيانات على شاشة الكمبيوتر).

5. التحليل السلوكي

  1. إذا كان أكثر من مراقب واحد وسيتم تسجيله أشرطة الفيديو ، فمن المهم وضع التصنيفات بين الموثوقية للتأكد من أن المراقبين أن يحرز السلوك بطريقة متناسقة. سجل للدورة الفعلية ، ينبغي إعداد ورقة تسجيل السلوك للسماح لتسجيل سهل للسلوك أثناء جلسات المراقبة (انظر الجدول رقم 2 على سبيل المثال من التهديف ورقة انتشار).
  2. عن السلوكيات التي لا توجد ردود العرضية السريعة ، يمكن تحليل microsequencing تكشف الخفايا حول تطور ردود محددة. على سبيل المثال ، والاستمالة السلوك يتكون من سلسلة من ردود سريعة جدا. على الرغم من خيار واحد هو لمجرد تسجيل حضور ومدتها من الاستمالة ، وآخر هو وثيقة في سلسلة من الفعاليات المصاحبة لهذا الرد. باستخدام هذا البرنامج microsequencing والمراقبين نتيجة وجود سلوك معين في كل ثانية ، كما دفعت بواسطة برنامج (برامج العرض والفيديو).
  3. بعد جمع البيانات ، وتتحدد معالم الفائدة ويتم تحليل الدرجات المناسبة السلوكية. قد تكون المدة الإجمالية أمثلة من الوقت الذي يقضيه في الاتصال مع الجرو ، أو اضطرابات في عدد من تسلسل الاستمالة (اعرض كمبيوتر مع انتشار ورقة مع البيانات المدخلة عن كل حيوان).
  4. مرة واحدة وسجل سلوك من المهم أن أؤكد أن هذين النوعين معارضها استراتيجيات استجابة مختلفة للسلوك الفائدة في الدراسة. في هذه الحالة يجب أن الفئران الغزلان كاليفورنيا يحمل سلوك الأب أكثر من الفئران الغزلان المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ترتبط تدابير سلوكية مختلفة مع التدابير المخ للحصول على عرض أكثر استنارة من التأثيرات ذات الصلة.

6. ممثل النتائج :

  1. للتحقق من صحة النموذج ، وينبغي أن البيانات تشير بوضوح إلى أن تنفيذ هذين النوعين بشكل مختلف في ما يتعلق بسلوك الفائدة. هنا ترى أن P. قضى وقتا أطول من الذكور californicus الاستمالة والرابض على الجراء ، واثنين من السمات المميزة لردود الأب (انظر الشكل 4).
  2. من أجل تحديد ما إذا كان المتغير neurobiologial الاهتمام المهم في ردود الأب ، وكان كميا مبلغ فاسوبريسين (AVP) إيجابية الأنسجة لعدة مناطق الدماغ ذات الصلة ؛ كما يمكن أن يرى ، والأب P. وكان أكثر الحيوانات californicus الأنسجة المناعية إيجابية في العديد من هذه المناطق في الدماغ. (انظر الشكل 5).
  3. في دراسة تتعلق باستخدام تحليل microsequencing ، كان الافتراض بأن الأب الفئران كاليفورنيا سوف يحمل القلق أقل من نظرائهم من عذراء ، وبالتالي ، فإن الآباء عندما تتعرض لرائحة الحيوانات المفترسة ، وعرض عدد أقل من انقطاع في تسلسل الاستمالة من الحيوانات البكر (انظر الشكل 6).

الشكل 1
الشكل 1 : (أ) ذكر الفئران كاليفورنيا اظهار ردود الأب تجاه الجرو مناوع الغريبة. (ب) ذكر الفأر الغزلان العارضة نهجا حذرا (التمدد الحضور) والاستجابة في تجنب وجود الغريبة مناوع الجرو. ملاحظة : في هذه التقييمات التفاعل الاجتماعي ، وإذا كان الذكور المعارض الاستجابات العدوانية تجاه الجرو ، والمجربون على الفور ضرب الجزء العلوي من القفص لإلهاء الذكور. في هذا الوقت يتم إنهاء الدورة ويتم إزالة الجرو ، وكشف عن أي إصابات ، وعاد إلى أمه. في المختبر لدينا ، وهذا نادرا ما يلاحظ مع P. ويلاحظ في بعض الأحيان ولكن مع الذكور californicus P. maniculatus ؛ مراقبة وثيقة والتدخل الفوري ، ولكن ، ومنع الأذى عن تطرأ على الحيوانات.

الشكل 2
الشكل 2 : فأر كاليفورنيا التفاعل مع ماوس لعبة ، ومعظم حاولت مضغه على هذه المحفزات.

الشكل 3
الشكل 3 : التصميم التجريبي للدراسة ، وهناك ما يقرب من 6 حيوانات في كل مجموعة عن كل الأنواع.

الشكل 4
الشكل 4 : رسم عملية كيمياء سيتولوجية مناعية.

الشكل 5
تينوقد لوحظت استجابات أكثر الأب (العريس ، كراوتش ، وأسرع النهج) في فئران كاليفورنيا ؛ لدى عودتهم 5 ردود الأبوية في ولاية كاليفورنيا والغزلان الفئران. وقد لوحظت أكثر تمتد يحضر (الاستجابة للضغط النفسي) في الفئران الغزلان.

الشكل 6
الشكل 6. تفاعلية مناعية فاسوبريسين في مناطق الدماغ المختلفة لكلا النوعين. كانت الفئران كاليفورنيا أكثر تلطيخ في الخلايا PVN والألياف.

الشكل 7
الشكل 7 : الأبوية الفئران أظهرت كاليفورنيا أقل انقطاع في تسلسل هذه الاستمالة في وجود رائحة حيوان مفترس من المجموعات المعرضة للالجرو وعذراء.

Discussion

تناقش هذه المقالة ثلاثة مكونات أساسية يعتقد أن يكون حاسما للتنفيذ الناجح للتحقيقات علم الأعصاب السلوكي : (1) نموذج حيواني ممثل وصحيحة ؛ (2) بروتوكول كيمياء سيتولوجية مناعية دقيقة وحساسة ، و (3) معظم التحليل (الرصد والإحصائية ) من البيانات على حد سواء السلوكية والدماغ. وسوف أخطاء في فئة واحدة بالتأكيد تسوية نتائج الدراسة بأكملها. وبالتالي ، وبعد اختيار دقيق للنموذج حيواني المناسبة ، ينبغي توجيه الجهد الكبير تجاه الاختبار التجريبي الإجراءات السلوكية والنسيجية أن أؤكد أن لاحظ سلوك بشكل صحيح في هذه الدراسة ، تليها المعالجة الناجحة للأدمغة.

كما ذكر سابقا ، فإن استخدام أنواع المقارنة لتحديد الآليات العصبية للاستجابة خاص هو نهج قيمة المنهجية لأن هذا الأسلوب لا يتطلب الهندسة الوراثية أو التلاعب جراحية مؤلمة. وبالتالي ، فإن هذا الأسلوب المنهجي يستخدم أقل تهديد ، حيوانات سليمة. استخدام التغيرات الطبيعية للحيوانات ، ولكن ، من خلال تعزيز إدماج مثل البيئات الطبيعية حتى لو كان يتم إيواء الحيوانات في المختبر. كذلك ، إذا كان من الممكن توسيع نطاق الدراسات المعملية إلى الميدان للتحقق من صحة مزيد من الاختلافات بين الأنواع في سلوك الفائدة ، وهذا هو الموصى به الخطوة التالية. على الرغم من أن نهج توفر العديد من المزايا النسبية ، وتحديد طبيعة المترابطة للبيانات ، وبالتالي يجب استخدام تقنيات إضافية مثل التلاعب الدوائية للتحقق من زيادة دور نظم العصبية المستهدفة في سلوك الفائدة.

بمجرد أن تشعر بالثقة المجربون حول الإجراءات السلوكية ، والنسيجية والإحصائية ، ينبغي توخي الحذر بحيث ظروف معيشة الحيوانات تظل ثابتة لجميع الفئات ما عدا ، بالطبع ، للتلاعب التجريبية. يمكن أن التغيرات في المتغيرات مثل جداول الضوء ، ومستويات الضوضاء ، ومقدمي الرعاية ، ومستويات الرطوبة والروائح في المختبر يكون لها تأثيرات هامة على استجابات الحيوانات العصبية الحيوية.

في هذه المقالة تم استخدام الأجسام المضادة الأولية للكشف عن فاسوبريسين لكن يمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية الأخرى لمجموعة كبيرة من neurochemicals مختلفة من الاهتمام. إذا كان مجرب يعمل مع الأجسام المضادة الجديدة ، من المهم إجراء دراسات لتحديد المعايرة تخفيف الأمثل للجسم جديدة. ويستخدم كثير من الأوقات الكثير من الأجسام المضادة (كما اقترح من قبل البائع) ، مما أدى إلى الأنسجة التي هي مظلمة جدا لتمييز الإشارات ؛ مزيد من الاستخدام المفرط للأجسام المضادة أمر مكلف جدا.

أخيرا ، إذا كان يمكن استخدام أكثر من التحليل الإحصائي واحد لتقديم آراء وتفسيرات بديلة للبيانات ، ينبغي الاستفادة منها. في هذه الدراسة بصفة خاصة ، وقد استخدمت النماذج الخطية العامة ، علائقية ، وتوسيع نطاق التحليلات متعددة الأبعاد لتوفير أكبر قدر من المعلومات وجهات النظر للبيانات.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذه البحوث من خلال منحة لا. 0723341 (لKGL) من مؤسسة العلوم الوطنية. ونحن ممتنون أيضا للمساهمات التي قدمتها البحوث الجامعية شابيرو برنامج زمالة وقسم علم النفس في كلية راندولف ماكون -. أخيرا ، ونحن نقدر المساهمات كريغ كينسلي والتعاونية في هذا البحث ومساعدة اماندا Rzucidlo في إعداد المختبر R - MC على هذا المقال الفيديو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Compound Microscope Motic BA400
BIOQUANT Life Science Software BioQuant Image Analysis Corporation Version 8.40.20
Cryostat Microm International HM525
Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) Cole-Parmer 7518-00
24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) Corning 3526
25x75x1mm Microscope Slides Globe Scientific, Inc. 1324W
22x50mm No.1 Cover Slip Globe Scientific, Inc. 1414-10
Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes Electron Microscopy Sciences 70962-9 &nbps;
Alconox Detergent Powder Alconox, Inc. 1104
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1kg CAS 7647-14-5
Monobasic Sodium Phosphate Spectrum SO130 CAS 10049-21-5
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30412 CAS 10028-24-7
Triton X Spectrum TR135 CAS 9002-93-1
Permount Fisher Scientific SP15-500 CAS 108-88-3
Chromium potassium Sulfate Sigma-Aldrich C-5926 CAS 7788-99-0
CitriSolv Fisher Scientific 22-143975
Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint Pharmco-AAPER 111000200CSPP
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent Immunostar, Inc. 20069
Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified Vector Laboratories BA-1000
Elite Standard Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB Peroxidase Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100
Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box Knox Purchase at local grocery store
3% Hydrogen Peroxide CareOne Purchase at local pharmacy
Bleach Clorox Purchase at local grocery store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
  2. Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
  3. Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
  4. Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
  5. Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
  6. Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
  7. Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
  8. Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
  9. Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
  10. Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
  11. Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics