아버지의 응답의 신경 생물학을 맡은 이후로 비교 종의 접근법을 사용

Neuroscience
 

Summary

비교 수종 접근 행동 neuroscientists가 특정 동물 모델의 특성으로 볼 구체적인 행동과 관련된 다양한 신경 생물학 요소를 탐험하실 수 있습니다. 자연 밀접하게 관련 종 사이의 행동의 차이를 발생의 활용이 기술은 침입 기법은 행동의 표현을 조작할 필요가 없습니다.

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Franssen, C. L., Bardi, M., Lambert, K. G. Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses. J. Vis. Exp. (55), e3173, doi:10.3791/3173 (2011).

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Abstract

행동 신경 과학의 목표는 구체적인 행동을 규제 기본 신경 생물학 요소를 식별하는 것입니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 동물 모델을 사용하여 많은 방법 론적 전략 침입 기술이 관심의 동작의 강도를 (예, 병변 방법, 약리 조작, microdialysis 기법, 유전 공학 - 동물 모델) 조작이 필요합니다. 비교 종의 방식의 활용이 연구팀은 자연적으로 밀접하게 관련 수종의 기존 대응 전략의 차이를 발생 활용할 수 있습니다. 우리가 실험실에서, 우리는 아버지의 반응에 차이가 Peromyscus의 속 두 종의을 사용합니다. 남성 캘리포니아 사슴 마우스 (Peromyscus 포니)가 자사의 사촌 반면, 여성과 같은 부모의 반응을 전시하고, 일반적인 사슴 마우스 (Peromyscus maniculatus) 새끼의 면전에서 거의 아무런 육성 / 부모의 응답을 전시하지 않습니다. 이 문서에있는 특정 관심의 아버지의 캘리포니아 사슴 마우스로 전시 affiliative 사회적 반응과 관련된 신경 생물학 요인 탐험입니다. 행동 신경 과학 접근 다각이기 때문에 연구의 다음과 같은 주요 구성 요소가 간단히 해결됩니다 : 연구의 유형에 적합한 수종을 식별, 행동 분석을위한 데이터 수집, 준비 및 두뇌의 sectioning, 대한 immunocytochemistry에 관련된 기본 단계를 바소 프레신 - immunoreactivity의 부량, 뇌 조직을 계량하는 소프트웨어를 neuroimaging의 사용, 행동을 점수를하고, 마지막으로, 적절한 통계 분석은 연구 결과의 가장 정보 해석을 제공하기 위해 microsequencing 비디오 분석의 사용.

Protocol

1. 동물 모델의 식별

  1. 캘리포니아 사슴 마우스 (Peromyscus 포니)는 아버지의 반응을 탐험하는 이상적인 모델입니다. 당신이보다시피,이 마우스는 어머니와 마찬가지로 새끼를 grooms - 그들은 그럼에도 불구하고 새끼가 간호하는 것 같은데 그런 그들 위에 몸을 구부 리다. 캘리포니아 생쥐의 행동은 같은 속, 자주 탈출하거나 그들을 공격하려고, 새끼에 약간의 흥미를 전시하고 일반적인 사슴 마우스 (Peromyscus maniculatus)의 종 비교합니다. (새끼와 상호 작용이 수종의 사진을 그림 1을 참조하십시오.)
  2. 종의 모델이 확인되면 다음의 여러 그룹이 설립해야합니다. 본 연구에서는 생물 학적 아버지, 아니 육아 경험 처녀, 그리고 두 종류의 제한 강아지 노출 (강아지 - 노출 또는 수양 아버지)와 처녀는 predisposed과 인수 모두 아버지의 특성 평가 수 있도록하는 데 사용됩니다. 이 특정 연구에서 우리는 또한 사회적 상호 작용은 새장에 배치하는 거 강아지가 아닌 대표적인 반응에 맞는다고 확신하는 강아지 장난감 마우스에 대한 모든 그룹을 노출 (그림 2 참조).
  3. 신경 생물학 요인을 조사하기 전에, 그것은 선택된 종의 관심의 행동에 명확한 차이를 전시 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 본 연구에서는, 남성은 접촉 보낸 시간의 강아지와 금액을 접근하기 위해 지연과 같은 점수 행동하는 데 사용되는 5 분 아버지의 행동 ethogram (ethogram의 예를 들어, 표 1 참조) 강아지와 케이지에 넣습니다 강아지. 공격적인 반응을 관찰하는 경우 강아지는 즉시 제거됩니다. 주의 행동 분석 후 실시 수 있도록 이러한 세션은 주로 촬영하고 있습니다.

2. 뇌 조직을 준비

  1. 각 마우스의 표준 재관류 (프로토콜 첨부) 다음, 두뇌들은 관심의 특정 영역 (표시 뇌)에서 sectioned 수 있도록 제거됩니다.
  2. 바소 프레신 (AVP) - 표준 마우스 뇌 아틀라스 (아틀라스 쇼)는 시상 하부에있는 paraventricular 핵, 본 연구에 대한 관심의 neuropeptide를 생산 세포에 풍부한 것으로 알려진 지역을 찾습니다하는 데 사용됩니다.
  3. 조직이 마이크로톰와 sectioned되기 전에 동결 수 있도록 두뇌는 다음 차단 및 냉동 척에 장착됩니다. 구체적인 랜드마크가 다음 특정 뇌 두께,이 경우 30 마이크론은 분석에 사용되는 뇌 부분에 대한 설정, 확인되기 전까지는 두뇌 트림 모드에서 sectioned 있습니다.
  4. 뇌 부분은 신중하게 인산 버퍼 식염수 (PBS)으로 가득 잘 접시에 배치됩니다, (첨부 PBS에 대한 프로토콜,이 표준 immunocytochemistry 프로토콜의 한 예입니다 것에주의하십시오.)

3. Immunocytochemistry

  1. 이 프로세스의 여러 단계에 걸쳐 (첨부 프로토콜을 참조), 그것은이 기법 (쇼 학생 pipetting)에 대한 화학 물질과 중요한 다른 재료의 정확한 측정을 보장하기 위해 정확한 pipetting 능력을 가지고하는 것이 중요합니다.
  2. 이 과정의 첫 번째 단계는 잘 접시 3-5 번의 PBS를 교체 포함 두뇌를 세척되며 각 세척 사이에 잘​​ 플레이트는 10 분 로커에 표시됩니다 (학생 PBS를 교체하고 배기 락커에 잘 번호판을 배치 표시) .
  3. 뇌 조각은 다음 주 항체 솔루션에 노출 4 로커 (쇼 프로세스)에서 ° C 하룻밤에 저장됩니다.
  4. 다른 세척 다음, 뇌 조각은 다시 씻어, 상온에서 로커 한 시간 동안 차 항체에 노출됩니다.
  5. 다음 두뇌는 neurochemical 양성 세포의 시각화를위한 준비 Avitin - 비오틴 복합 솔루션에 노출되어 있습니다.
  6. 최종 시각화 단계에 대한, 두뇌는 DAB에 노출되어 있습니다. 이것은 위험한 제품으로 항상주의해서 취급해야합니다. 여기서 볼 수 있듯이, 뇌 조각이 (프로세스를 표시) 눈 앞에 어두운 얻을 시작합니다.
  7. DAB 노출 다음, 두뇌는 세척의 마지막 시리즈 통과 후 조심스럽게 subbed 현미경 슬라이드에 배치하고 (슬라이드 뇌 슬라이스의 위치를​​ 보여, subbed 슬라이드 프로토콜에 대한 첨부 파일을 참조) 하룻밤 건조 사용할 수 있습니다.
  8. 슬라이드는 다음 증류수와 알코올 세척 일련의 플랫폼에 착륙 마지막으로 안전하게 (이 과정의 다양한 측면을 보여, 삭제 과정에 대한 첨부 파일을 참조) slidebox에 coverslipped 및 저장되기 전에 Citrosolv에 빠져들되고.

4. Neuroquantification

  1. 슬라이드 말린 후에, 그들은 전문 neuroquantification 소프트웨어 평가하실 수 있습니다. 여기 Bioquant 소프트웨어 (화면에 소프트웨어 ... 그리고 현미경을 표시)을 마우스 두뇌의 paraventricular 핵에있는 바소 프레신 양성 세포와 섬유를 계량하는 데 사용됩니다.
  2. 관심의 특정 영역은 측정 옵션을 사용하여 식별됩니다소프트웨어의 neuroquantification에 대한 시각적인 필드를 설정합니다. 일관된 시각 필드 크기 (쇼 학생이 이런 일을) 각 동물 계량는 것이 중요합니다.
  3. 여기 어둡게 스테인드 바소 프레신 - immunoreactive 세포 기관 및 섬유 분명 있습니다. 그것이 조직을 계산하거나 추적하기 어려운이기 때문에,이 소프트웨어의 특징은 관심의 지정된 영역 내에 적극적으로 스테인드 조직의 총 금액을 결정하는 조명 thresholding을 사용합니다. 이 thresholding는 바소 프레신 - 긍정적인 조직을 (컴퓨터 화면에 데이터 값을 표시) 포함된 얼마나 지정된 지역의 우리에게 알려줍니다.

5. 행동 분석

  1. 하나 이상의 관찰자가 비디오 테이프를 채점되는 경우 그것은 관찰자가 일관성있는 방식으로 동작을 채점하는 보장에 간 제일 급의 신뢰성을 확립하는 것이 중요합니다. 실제 점수 세션에 대한, 행동 점수 시트 (스프레드 시트를 채점의 예를 들어, 표 2 참조) 관찰 세션 동안 행동을 쉽게 점수 있도록 준비되어야합니다.
  2. 빠른 에피소드 응답되지 않은 동작을 위해, microsequencing 분석은 특정 반응의 진행에 대해 미묘을 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 문제를 정리하는 것은 매우 빠른 반응의 사슬로 구성되어 있습니다. 한 개의 옵션을 간단하게 정리의 존재와 시간을 기록하지만, 또 다른이 응답과 함께 사건의 사슬을 문서화하는 것입니다. 이 microsequencing 소프트웨어를 사용하여 관측은 소프트웨어 (쇼 소프트웨어와 비디오)하라는 메시지가 특정 행동을 매 순간의 존재를 점수.
  3. 데이터 수집에 따라 관심의 매개 변수가 결정되고 적절한 행동 점수는 분석입니다. 예 정리 순서 중단 (각 동물에 대한 입력 데이터를 스프레드 시트와 컴퓨터를 표시)의 강아지, 또는 번호와 접촉 보낸 시간의 총 기간 수 있습니다.
  4. 문제가 채점되면 그것은 두 종의 연구에 대한 관심의 행동에 대해 서로 다른 응답 전략을 전시를 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우에는 캘리포니아 사슴 마우스는 일반적인 사슴 마우스보다 아버지의 행동을 전시한다. 또한, 다양한 행동 조치와 관련된 영향에 더 정보를 볼 수를 얻을 두뇌 조치와 상관하실 수 있습니다.

6. 대표 결과 :

  1. 모델을 확인하려면 데이터가 명확하게 두 종류가 관심의 행동에 관해서는 다르게 수행되었음을 나타냅니다한다. 여기 표시되는 P. 포니의 수컷은 새끼, 아버지의 반응 두 가지 특징 (그림 4 참조)를 통해 정리하고 웅크리고 더 많은 시간을 보냈다.
  2. 볼 수 있듯이, 아버지의 P.; 관심 neurobiologial 변수는, 아버지의 반응에 중요 바소 프레신의 양은 (AVP) - 긍정적인 조직이 여러 관련 뇌 영역에 대한 계량되었습니다 있는지 확인하기 위해 포니 동물이 뇌 영역의 여러 더 많은 면역 - 긍정적인 조직을했다. (그림 5 참조).
  3. microsequencing 분석을 사용하여 관련 연구에서, 그것은 아버지의 캘리포니아 마우스가 처녀의 대응보다 적은 불안감을 전시 것이 가상했다, 따라서, 육식 동물의 냄새에 노출 때, 아버지는 (그림 참조 처녀 동물보다 정리 순서에 따라 적게 방해 전시 6).

그림 1
그림 1 : (A) conspecific 외국인 강아지 향한 아버지의 답변을 전시 남 캘리포니아 마우스. (B) 남자 사슴 마우스는 신중한 접근 (스트레치 참석)와 강아지 conspecific 외계인의 존재에 회피 응답을 전시. 참고 : 남자가 강아지 향해 적극적인 답변을 전시하는 경우 이러한 사회적 상호 작용 평가에서, 경험이 바로 남성주의를 분산하기 위해 케이지의 상단을 누르십시오. 이때 세션이 종료되고 강아지가 제거됩니다, 모든 상처에 대한 검사 및 어머니로 돌아왔습니다. 저희 연구실에서는, 이것은 거의 P. 함께 관찰되지 않습니다 포니의 남성이지만은 종종 P.과 관찰 maniculatus, 가까이 관찰과 즉각적인 개입을하지만, 동물 발생 피해를 방지.

그림 2
그림 2 : 장난감 마우스 상호 작용 캘리포니아 마우스, 대부분의 이러한 자극에 씹어 했어요.

그림 3
그림 3 : 연구의 실험 설계, 각 그룹에 약 6 동물은 각 종족에 대한있었습니다.

그림 4
그림 4 : immunocytochemistry 프로세스의 그래픽.

그림 5
무화과ure 5 캘리포니아과 사슴 마우스의 아버지의 반응;. 자세한 아버지의 반응은 (신랑, 몸을 구부 리다, 빠른 접근) 캘리포니아 마우스에서 관찰되었다. 더 신축성 참석 (스트레스 응답)은 사슴 마우스에서 관찰되었다.

그림 6
그림 6. 두 종류의 다양한 뇌 영역에서 바소 프레신의 immunoreactivity. 캘리포니아 마우스는 PVN 세포와 섬유에 더 많은 얼룩을했다.

그림 7
그림 7 : 아버지의 캘리포니아 마우스는 강아지 노출과 처녀 그룹보다 육식 동물 냄새의 존재에서 정리 시퀀스에서 적은 혼란을 전시.

Discussion

이 문서는 세 필수 요소 행동 신경 과학 조사의 성공적 실행을 위해 중요한 것으로 생각 설​​명 : (2) 정확하고 민감한 immunocytochemistry 프로토콜, (1) 대표적인 유효 동물 모델과 (3) 대부분의 분석 (관측 및 통계 ) 행동 및 두뇌 데이터를 모두. 하나의 카테고리에서 실수 가장 확실하게 전체 연구의 결과를 손상됩니다. 따라서 신중하게 적절한 동물 모델을 선택한 후, 상당한 노력을 조종사가 두뇌의 성공적인 처리하여 다음 동작이 안정적으로 연구 관찰된다는 보장하기 위해 행동 및 histological 절차, 테스트 방향으로 이동해야합니다.

앞서 언급했듯이이 기법은 유전 공학이나 고통 외과 조작을 필요로하지 않기 때문에, 특정 응답의 신경 생물학 메커니즘을 식별하는 비교 종의 사용은 귀중한 방법론 접근이다. 따라서,이 방법 론적 접근은 덜 위협, 손상 동물을 활용합니다. 동물 실험실에 보관되어 경우에도 동물의 자연적인 변형의 사용은, 그러나, 자연과 같은 환경의 결합에 의해 강화됩니다. 실험실 연구가 더욱 관심의 동작 종의 차이의 진위를 확인하기 위해 필드로 확장될 수있다면 더 나아가,이 다음 단계를 권장합니다. 비교 방식은 많은 장점을 제공하지만, 제한은 데이터의 상호 성격이며 따라서 이러한 약리 조작과 같은 추가적인 기술은 더욱 관심의 동작에서 신경 생물학 타겟 시스템의 역할을 확인하는 데 사용해야합니다.

경험은, 행동 histological 및 통계 절차에 대한 확신하면, 치료가 동물의 생활 조건은 실험 조작에 대한, 물론 제외한 모든 그룹에 대해 지속적으로 유지되도록 주의해야한다. 이러한 빛의 일정, 소음 수준, 관리 인, 습도 수준 및 실험실에서 냄새로 변수의 변화는 동물들의 신경 생물학 반응에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

이 문서에 나와있는 기본 항체는 바소 프레신 있지만 다른 차 항체가 관심의 다양한 neurochemicals의 과다 사용할 수의 검출을 위해 사용되었습니다. 실험자은 새로운 항체와 함께 일하고있다면, 그것은 새로운 항체의 최적의 희석을 결정하는 적정 연구를 수행하는 것이 중요합니다. 또한, 항체의 과다 사용은 매우 고가이며 대부분의 경우 너무 많은 항체는 신호를 차별화하는 데 너무 어두울 조직의 결과 (로 공급 업체에서 제안)이 사용됩니다.

한 통계 분석 이상이 대체 전망과 데이터의 해석을 제공하는 데 사용할 수있다면 마지막으로, 그들은 활용해야합니다. 이 특정 연구에서는 일반 선형 모델, correlational, 그리고 다차원 스케일링 분석은 데이터의 가장 유익한 전망을 제공하기 위해 사용되었습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 부여 노에 의해 투자되었다. 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 0,723,341 (KGL로). 우리는 또한 Schapiro 학부 연구 장학생 프로그램과 랜돌프 - 메이컨 대학에서 심리학과에서 제공하는 기부에 대해 감사하고 있습니다. 마지막으로, 우리는이 비디오 기사에 대한 R - MC 연구소를 준비하는이 연구와 아만다 Rzucidlo의 도움에 크랙 Kinsley의 공동 참여에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Compound Microscope Motic BA400
BIOQUANT Life Science Software BioQuant Image Analysis Corporation Version 8.40.20
Cryostat Microm International HM525
Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) Cole-Parmer 7518-00
24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) Corning 3526
25x75x1mm Microscope Slides Globe Scientific, Inc. 1324W
22x50mm No.1 Cover Slip Globe Scientific, Inc. 1414-10
Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes Electron Microscopy Sciences 70962-9 &nbps;
Alconox Detergent Powder Alconox, Inc. 1104
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1kg CAS 7647-14-5
Monobasic Sodium Phosphate Spectrum SO130 CAS 10049-21-5
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30412 CAS 10028-24-7
Triton X Spectrum TR135 CAS 9002-93-1
Permount Fisher Scientific SP15-500 CAS 108-88-3
Chromium potassium Sulfate Sigma-Aldrich C-5926 CAS 7788-99-0
CitriSolv Fisher Scientific 22-143975
Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint Pharmco-AAPER 111000200CSPP
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent Immunostar, Inc. 20069
Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified Vector Laboratories BA-1000
Elite Standard Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB Peroxidase Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100
Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box Knox Purchase at local grocery store
3% Hydrogen Peroxide CareOne Purchase at local pharmacy
Bleach Clorox Purchase at local grocery store

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References

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