使用方法比较物种调查父亲的反应神经生物学

Neuroscience
 

Summary

比较种方法,使行为神经科学家探索与被视为一个特定的动物模型的特点特定的行为有关的各种神经生物学因素。利用自然发生的行为密切相关的物种之间的差异,这种技术不需要侵入性技术来操纵行为的表达。

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Franssen, C. L., Bardi, M., Lambert, K. G. Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses. J. Vis. Exp. (55), e3173, doi:10.3791/3173 (2011).

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Abstract

行为神经科学的目标是,以确定潜在的神经生物学因素,具体的行为规范。利用动物模型来实现这一目标,许多方法论上的战略需要微创技术来操纵的利益的行为的力度(例如,病变的方法,药理操纵,微透析技术,基因工程动物模型)。利用比较物种的方法,使研究人员能够利用自然产生的响应现有的战略密切相关的物种差异的优势。在我们的实验室,我们使用两个Peromyscus属的物种,在父亲的反应有所不同。男加利福尼亚州鹿鼠(Peromyscus californicus)展品为女性,而其表弟同父母的反应,常见的鹿鼠(Peromyscus maniculatus)展品几乎没有培育/父母的反应,在幼崽的存在。在这篇文章中的具体利益是由父系加州鹿鼠标展出affiliative社会反应相关的神经生物学因素的探索。因为行为神经科学的方法是多方面的,以下关键组件的研究将简要讨论:这种类型的研究适当的物种鉴定;行为分析的数据收集,准备和大脑切片;免疫细胞化学法对涉及的基本步骤加压素免疫反应的量化,量化脑组织的神经影像软件的使用;使用一个microsequencing视频分析,行为得分,最后,适当的统计分析,提供研究结果的最明智的解释。

Protocol

1。动物模型的识别

  1. 加州的鹿鼠(Peromyscus californicus)是一个理想的模式,探索父亲的反应。正如您所看到的,这款鼠标新郎的幼崽,就像妈妈做的 - 他们甚至超过他们蹲下身,所以,它看起来像仔兔哺乳期。加州小鼠的行为相比,同属一个物种,它在幼崽表现出的兴趣不大,往往试图逃跑,甚至攻击他们共同的鹿鼠 (Peromyscus maniculatus)。 (参见图1这些相互作​​用的物种与幼仔的照片。)
  2. 一旦该物种的模式已被确定,则需要建立各团体。在这项研究中,亲生父亲,没有育儿经验的处女,并使用有限的小狗曝光的这两个物种(PUP暴露或寄养的父亲)的处女,所以,父亲的倾向和后天的特点,可以进行评估。在这项研究中,我们也暴露了所有群体,一个玩具鼠标小狗,以保证社会互动具体到一个小狗,而不是放置在笼子里的任何一个代表响应(参见图2。)
  3. 调查神经生物学因素之前,重要的是,以确认所选择的物种明显的差异表现在利益的行为。在这项研究中,男性为五分钟,一个父亲的行为ethogram(见ethogram例如表1)小狗放在,是用来得分的行为,如延迟接近小狗和接触的时间花在一个笼子里小狗。如果积极的反应,小狗立即删除。所以可以随后进行了仔细行为分析,这些会议往往录像。

2。准备脑组织

  1. 以下的每个鼠标的标准灌注(协议附后),被删除的大脑,使他们能够在感兴趣的特定区域(显示大脑)切片。
  2. 一个标准的老鼠大脑图谱(查看图集)用于定位于下丘脑室旁核,已知的细胞产生的神经肽在这项研究中的兴趣丰富的地区 - 加压素(AVP)。
  3. 大脑,然后封锁和冻结夹头安装,使组织的切片机切片前,将冻结。大脑是在修剪模式,切片,直到特定的地标被确定,那么在这种情况下,30微米,在特定的大脑厚度是用于分析的脑切片。
  4. 脑切片小心放置在充满磷酸盐缓冲液(PBS)的孔板;(PBS附加议定书“;请注意,这是唯一的一个标准的免疫细胞化学协议的一个例子)。

3。免疫细胞化学

  1. 纵观这一过程的各个步骤(见附件协议),重要的是有准确的移液技术,这种技术(显示学生吹打),化学品和其他重要成分,以保证精确的测量。
  2. 在这个过程中的第一步是洗脑筋,其中包括更换孔板的三至五倍的PBS之间的每次清洗孔板放置在一个10分钟的摇杆(显示学生更换PBS和名次上的摇滚乐队孔板) 。
  3. 大脑切片,然后接触到的主要抗体的解决方案,并保存在4 ° C的摇杆(展示过程)过夜。
  4. 另一个洗之后,大脑切片暴露到二级抗体在室温下摇臂一小时,然后清洗一遍。
  5. Avitin -生物素的复杂的神经化学物质的阳性细胞的可视化解决方案,准备下一步的大脑暴露。
  6. 对于最终的可视化步骤,大脑暴露民建联。这是一个危险品,应始终谨慎处理。正如在这里看到,大脑切片开始之前得到你的眼睛暗(展示过程)。
  7. 民建联曝光后,大脑经过清洗的最后一个系列,然后小心地放在subbed显微镜载玻片和干通宵(显示幻灯片上的脑片的位置; subbed幻灯片协议附件)。
  8. 幻灯片,然后通过一系列蒸馏水和酒精清洗清除,终于被淹没在Citrosolv前coverslipped和储存保管(显示这一过程的各个方面;清算过程中看到的附件)slidebox。

4。 Neuroquantification

  1. 幻灯片已经干涸后,他们可以使用专门neuroquantification软件进行评估。这里Bioquant软件是用来量化在老鼠大脑的下丘脑室旁核加压素阳性细胞和纤维(显示屏幕上的软件... ...和显微镜)。
  2. 感兴趣的特定区域使用的测量选项确定软件建立neuroquantification视野。重要的是一致的视野大小是每个动物的量化(显示学生这样做)。
  3. 在这里,深染加压素免疫反应阳性胞体和纤维是显而易见的。因为它是难以计数或跟踪这个组织,这个软件的特殊功能使用光阈值,以确定阳性染色的组织利益的指定区域内的总金额。这个阈值告诉我们有多少指定的区域中加压素阳性组织(显示在计算机屏幕上的数据值)。

5。行为分析

  1. 如果超过一名观察员将得分录影带,重要的是要建立跨评价者的可靠性,以确保观察员得分以一致的方式行为。对于实际得分会议,行为评分表应准备允许轻松得分的行为观察会议期间(例如得分试算表,请参阅表2)。
  2. 行为,偶发的反应并不快,一个microsequencing分析,可以揭示有关的具体回应进展的微妙之处。例如,修饰行为组成一个链的反应速度非常快。虽然一个选项是简单地记录修饰的存在和持续时间,另一个是文件伴随这一反应的事件链。使用这种microsequencing软件,观察员得分的特定的行为每秒钟软件(显示软件和视频)的提示,存在。
  3. 数据收集,感兴趣的参数确定和分析适当的行为分数。例如可能接触的时间花在与小狗,或在疏导序列中断(每个动物输入的数据表显示与传播计算机)的总时间。
  4. 一旦行为取得重要的是,以确认这两个品种表现为行为的研究兴趣不同的应对策略。加州鹿鼠在这种情况下,应表现出更多的父系比普通的鹿鼠的行为。此外,各种行为的措施,可与大脑的措施,以获得一个更明智的有关影响。

6。代表性的成果:

  1. 来验证模型,数据清楚地表明,这两个品种的表现不同方面利益的行为。这里你可以看到,P。 californicus男性花费更多的时间疏导和幼崽,两个父亲的反应的特点(见图4)下蹲。
  2. 为了确定利益neurobiologial变量是重要的,在父亲的反应,加压素(AVP)的积极组织几个相关的大脑区域进行了量化,可以看出 ,父亲的体育在这些脑区的几个 californicus动物免疫阳性组织。 (见图5)。
  3. 在相关的研究使用microsequencing分析,推测,父亲的加州小鼠会表现出比他们的处女的焦虑少,因此,当暴露在捕食者的气味,父亲展出更少的中断,比处女动物美容序列(见图6)。

图1
图1:(一)男加利福尼亚州的小鼠表现出对同种外来小狗父亲的反应。 (二)男鹿鼠标表现出谨慎的态度(拉伸出席)和避免存在一个同种外来小狗的反应。注意:在这些社会互动评估,如果一个男性的展品对小狗积极的反应,实验者立即打笼顶部分散男性。此时会话终止,小狗被删除,任何伤口进行检查,并回到母亲。在我们的实验室中,这种情况很少观察体育californicus男性,但偶尔观察与体育maniculatus;密切观察,并立即进行干预,但是,防止发生动物伤害。

图2
图2:一个玩具鼠标交互加州鼠标,大多数试图对这些刺激咀嚼。

图3
图3:研究的实验设计;有每个品种约6各组动物。

图4
图4:图形的免疫细胞化学过程。

图5
图5在加利福尼亚州和鹿鼠的父系反应;父亲的反应(新郎,蹲下身,更快的方法)在加利福尼亚州小鼠观察。更舒展出席(应激反应),观察鹿鼠。

图6
图6。加压素在这两个物种的不同脑区的免疫反应。加州的小鼠有更多的丘脑室旁核细胞和纤维的染色。

图7
图7:父亲加州的小鼠表现出在自己的仪容序列比小狗暴露和维珍集团的捕食者气味的存在较少的中断。

Discussion

本文讨论三个基本组件被认为是行为神经科学调查的成功执行的关键:(1)一个具有代表性和有效的动物模型;(2)准确,灵敏的免疫细胞化学的协议;(3)大多数分析(观测和统计)双方的行为和大脑的数据。一个类别中的错误,肯定会危及整个研究的结果。因此,仔细选择合适的动物模型后,相当大的努力应该是指向进行试验的行为和组织学的程序,以确保该行为将被可靠地在研究中观察到,成功的大脑处理。

如前所述,使用比较物种找出一个特定的反应神经生物学机制是一种宝贵的的的方法的方法,因为这种技术并不需要基因工程或痛苦的手术操作。因此,这种方法的方法利用不足的威胁,更完整的动物。不过,使用动物的自然变化,加强了类似自然的环境纳入即使是在实验室内的动物。此外,如果实验室的研究可以扩展到的领域,进一步验证了物种的差异,在利益的行为的真实性,这一步建议。虽然比较的方法具有许多优点,限制是相关数据的性质,因此,应采用其他技术,如药理操纵利益的行为,进一步验证了有针对性的神经生物学系统的作用。

一旦实验者有关的行为,组织学和统计程序感到有信心,应采取使所有组动物的生活条件仍然不变,当然,实验操作除外。轻时间表,噪音水平,管理员,湿度水平和实验室中的气味,如变量的变化可能对动物的神经生物学反应有显著的影响。

在这篇文章中的主要抗体用于加压素的检测,但其他主要的抗体,可用于大量不同的神经化学物质的利益使用。如果实验者是一个新的抗体的工作,重要的是要进行滴定研究,以确定新抗体的最佳稀释。很多时候,太多的抗体(由供应商的建议),在组织太暗分化的信号;进一步,过度使用的抗体是非常昂贵的。

最后,如​​果不是一个单一的统计分析,可用于提供备用的意见和对数据的解释,他们应该利用。在这项研究中,用于提供一般线性模型,相关性,以及多维尺度分析的数据最翔实的意见。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项研究是由赠款没有。 0723341(KGL)从国家科学基金会。我们也感谢夏皮罗本科生研究奖学金计划和伦道夫 - 梅肯学院心理学系提供的捐款。最后,我们对此表示赞赏克雷格金斯利的协作贡献,在这项研究和Rzucidlo阿曼达的帮助,在此视频文章准备的R - MC实验室。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Compound Microscope Motic BA400
BIOQUANT Life Science Software BioQuant Image Analysis Corporation Version 8.40.20
Cryostat Microm International HM525
Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) Cole-Parmer 7518-00
24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) Corning 3526
25x75x1mm Microscope Slides Globe Scientific, Inc. 1324W
22x50mm No.1 Cover Slip Globe Scientific, Inc. 1414-10
Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes Electron Microscopy Sciences 70962-9 &nbps;
Alconox Detergent Powder Alconox, Inc. 1104
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1kg CAS 7647-14-5
Monobasic Sodium Phosphate Spectrum SO130 CAS 10049-21-5
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30412 CAS 10028-24-7
Triton X Spectrum TR135 CAS 9002-93-1
Permount Fisher Scientific SP15-500 CAS 108-88-3
Chromium potassium Sulfate Sigma-Aldrich C-5926 CAS 7788-99-0
CitriSolv Fisher Scientific 22-143975
Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint Pharmco-AAPER 111000200CSPP
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent Immunostar, Inc. 20069
Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified Vector Laboratories BA-1000
Elite Standard Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB Peroxidase Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100
Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box Knox Purchase at local grocery store
3% Hydrogen Peroxide CareOne Purchase at local pharmacy
Bleach Clorox Purchase at local grocery store

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References

  1. Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
  2. Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
  3. Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
  4. Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
  5. Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
  6. Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
  7. Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
  8. Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
  9. Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
  10. Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
  11. Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).

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