Con un enfoque comparativo de especies para la Investigación de Neurobiología de las respuestas Paternal

Neuroscience
 

Summary

El enfoque comparativo permite neurocientíficos especie de comportamiento para explorar diversos factores neurobiológicos asociados con comportamientos específicos vistos como característica de un modelo animal específico. Aprovechando naturales diferencias de comportamiento entre especies estrechamente relacionadas, esta técnica no requiere técnicas invasivas para manipular la expresión de la conducta.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Franssen, C. L., Bardi, M., Lambert, K. G. Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses. J. Vis. Exp. (55), e3173, doi:10.3791/3173 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uno de los objetivos de la neurociencia del comportamiento es identificar los factores neurobiológicos subyacentes que regulan los comportamientos específicos. El uso de modelos animales para lograr este objetivo, muchas de las estrategias metodológicas requieren técnicas invasivas para manipular la intensidad de la conducta de interés (por ejemplo, los métodos de la lesión, las manipulaciones farmacológicas, técnicas de microdiálisis, por ingeniería genética, modelos animales). La utilización de un enfoque comparativo de las especies permite a los investigadores para aprovechar de forma natural las diferencias en las estrategias de respuesta que existen en especies estrechamente relacionadas. En nuestro laboratorio, se utilizan dos especies del género Peromyscus que difieren en las respuestas paternas. El macho del ratón California ciervos (Peromyscus californicus) presenta las mismas respuestas los padres como de la hembra, mientras que su primo, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) presenta prácticamente ninguna respuesta crianza / padres en la presencia de las crías. De especial interés en este artículo es una exploración de los factores neurobiológicos asociados a las respuestas de afiliación social, exhibidas por el ratón venado paterna California. Debido a que el comportamiento enfoque de la neurociencia es multifacético, los siguientes componentes clave del estudio va a tratar brevemente: la identificación de especies apropiadas para este tipo de investigación, recopilación de datos para el análisis del comportamiento, la preparación y la sección del cerebro, los pasos básicos que intervienen en inmunocitoquímica para la cuantificación de la vasopresina-inmunoreactividad, el uso de la neuroimagen software para cuantificar el tejido cerebral, el uso de un análisis de vídeo microsecuenciación de puntuación de la conducta y, por último, los análisis estadísticos adecuados para proporcionar las interpretaciones más informado de los resultados de la investigación.

Protocol

1. Identificación del modelo animal

  1. El ratón ciervo California (Peromyscus californicus) es un modelo ideal para explorar las respuestas paternas. Como puede ver, este ratón novios a los cachorros al igual que las mamás hacer - incluso agacharse sobre ellos para que se vea como los cachorros son de enfermería. El comportamiento de los ratones en comparación con California es una especie del mismo género, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) que muestra poco interés en los cachorros, a menudo tratando de escapar o incluso atacarlas. (Ver Figura 1 para las fotos de estas especies que interactúan con los cachorros.)
  2. Una vez que el modelo de las especies ha sido identificado entonces los distintos grupos deben ser establecidos. En este estudio, los padres biológicos, vírgenes sin experiencia en crianza de los hijos, y las vírgenes con una exposición limitada cachorro (cachorros expuestos o padres de crianza) de ambas especies se utilizan de modo que las características paternas tanto predispuesto y adquiridas pueden ser evaluados. En este estudio en particular que también están expuestos todos los grupos a un ratón de juguete cachorro para asegurar que las interacciones sociales son específicas de un cachorro y no una respuesta a la representante de cualquier cosa puesta en la jaula (ver Figura 2).
  3. Antes de investigar los factores neurobiológicos, es importante para confirmar que las especies seleccionadas presentan claras diferencias en la conducta de interés. En este estudio, los hombres se colocan en una jaula con un cachorro de cinco minutos y un etograma conducta paterna (véase el cuadro 1, por ejemplo, de etograma) se utiliza para las conductas puntuación como la latencia de acercarse a la cría y la cantidad de tiempo pasado en contacto con el cachorro. Si se observan las respuestas agresivas, el cachorro se elimina inmediatamente. Estas sesiones suelen ser grabadas en vídeo por lo que un cuidadoso análisis de comportamiento puede ser llevado a cabo posteriormente.

2. Preparación de tejido cerebral

  1. Después de una perfusión normal de los ratones (protocolo adjunto), el cerebro se eliminan de manera que se puede seccionar en el área específica de interés (del cerebro muestran).
  2. Un estándar de cerebro de ratón atlas (atlas muestra) se utiliza para localizar el núcleo paraventricular en el hipotálamo, un área conocida por ser rica en células que producen el neuropéptido de interés en este estudio - la vasopresina (AVP).
  3. El cerebro es entonces bloqueada y se monta en un mandril de congelación para que el tejido se congela antes de ser seccionada con el microtomo. El cerebro está seccionado en un modo de recortar hasta puntos de referencia específicos se identifican, entonces el espesor específicas del cerebro y de 30 micrones, en este caso, se establece para las secciones de cerebro que se utilizan para el análisis.
  4. Las secciones del cerebro son cuidadosamente colocadas en placas llenas de tampón fosfato salino (PBS); (protocolo de PBS adjunta, por favor, tenga en cuenta que esto es sólo un ejemplo de un protocolo de inmunocitoquímica estándar).

3. Inmunocitoquímica

  1. A lo largo de las distintas etapas de este proceso (véase el protocolo adjunto), es importante tener conocimientos precisos de pipeteo para asegurar mediciones precisas de los productos químicos y otros ingredientes importantes de esta técnica (pipeteado muestran los alumnos).
  2. El primer paso en este proceso es el lavado de los cerebros que implica la sustitución de la PBS en los pocillos tres a cinco veces, entre cada lavado los platos y se colocan en un agitador durante 10 minutos (mostrar estudiante reemplazar PBS y la colocación de placas de rockeros) .
  3. Los cortes de cerebro se exponen a la solución de anticuerpo primario y se almacenan a 4 ° C durante la noche en la mecedora (proceso de show).
  4. Después de otro lavado, las rodajas de cerebro están expuestos a un anticuerpo secundario durante una hora en el agitador a temperatura ambiente, luego se lava de nuevo.
  5. A continuación, el cerebro está expuesto a una solución compleja Avitin-biotina para prepararse para la visualización de las células neuroquímicos-positivo.
  6. Para la etapa de visualización final, el cerebro está expuesto a DAB. Este es un producto peligroso y siempre debe ser manejado con precaución. Como se ve aquí, las rodajas de cerebro comienzan a llegar más oscuro ante sus ojos (mostrar el proceso).
  7. Tras la exposición de DAB, el cerebro de pasar por la última serie de lavados y luego se colocan cuidadosamente en el microscopio subbed y se deja secar durante la noche (muestran la colocación de una porción del cerebro en un portaobjetos, ver archivo adjunto para el protocolo de diapositivas subbed).
  8. Los portaobjetos se aclaró a través de una serie de lavados de agua destilada y alcohol, finalmente quedar sumergido en Citrosolv antes de ser cubreobjetos y se almacena en un Slidebox para su custodia (mostrar los distintos aspectos de este proceso, véase el documento adjunto para el proceso de compensación).

4. Neuroquantification

  1. Después de las diapositivas se han secado, pueden ser evaluados con un software especializado neuroquantification. Aquí Bioquant software se utiliza para cuantificar las células vasopresina-positivas y las fibras en el núcleo paraventricular del cerebro del ratón (mostrará el software en la pantalla ... y el microscopio).
  2. El área específica de interés se identifica con las opciones de medicióndel software para establecer el campo visual para neuroquantification. Es importante que un tamaño uniforme del campo visual se cuantifica para cada animal (los estudiantes muestran cómo hacer esto).
  3. Aquí la oscura manchada vasopresina-inmunorreactiva cuerpos de las células y las fibras son evidentes. Debido a que es difícil contar o rastrear este tejido, una característica especial de este software utiliza la luz de umbral para determinar la cantidad total de tejido con tinción positiva en el área específica de interés. Este umbral nos dice qué parte de la zona especificada contiene vasopresina tejido positivo (muestra el valor de los datos en la pantalla del ordenador).

5. Análisis del comportamiento

  1. Si más de un observador será anotar los videos, es importante para establecer confiabilidad entre los evaluadores para asegurar que los observadores están marcando el comportamiento de una manera consistente. Para la sesión de puntuación actual, una hoja de scoring de comportamiento debe estar preparado para permitir la fácil puntuación de la conducta durante las sesiones de observación (véase el cuadro 2, por ejemplo, la puntuación de hoja de cálculo).
  2. Por conductas que no son rápidos respuestas episódica, un análisis de microsecuenciación puede revelar las sutilezas de la progresión de las respuestas específicas. Por ejemplo, el aseo comportamiento consiste en una cadena de respuestas muy rápidas. Aunque es una opción para grabar sólo la presencia y duración de la preparación, otro es el de documentar la cadena de acontecimientos que acompaña a esta respuesta. El uso de este software microsecuenciación, los observadores de puntuación de la presencia de un comportamiento particular en cada segundo, como lo solicite el software (software de demostración y de vídeo).
  3. Tras la recogida de datos, los parámetros de interés se determinan y los resultados del comportamiento apropiado analizados. Ejemplos pueden ser la duración total del tiempo pasado en contacto con el cachorro, o el número de interrupciones en la secuencia de preparación (mostrar ordenador con hoja de cálculo con los datos introducidos por cada animal).
  4. Una vez que la conducta se califica, es importante para confirmar que las dos especies exhiben diferentes estrategias de respuesta para la conducta de interés en el estudio. En este caso los ratones ciervo de California deben mostrar un comportamiento más paternal que los ratones ciervo común. Además, varias medidas del comportamiento pueden ser correlacionadas con las medidas del cerebro para obtener una visión más informada de las influencias relevantes.

6. Los resultados representativos:

  1. Para validar el modelo, los datos deben indicar claramente que las dos especies realiza de forma diferente con respecto a la conducta de interés. Aquí se ve que el P. hombres californicus pasado más tiempo de aseo y en cuclillas sobre los cachorros, dos señas de identidad de las respuestas paternas (ver Figura 4).
  2. Con el fin de determinar si la variable de interés neurobiologial es importante en las respuestas paternas, la cantidad de vasopresina (AVP), tejido positivo se cuantificó por varias áreas cerebrales relevantes, como puede verse, el paternal P. animales californicus había tejido más inmunes positivos en varias de estas áreas del cerebro. (Ver Figura 5).
  3. En un estudio relacionado con el análisis de microsecuenciación, se planteó la hipótesis de que los ratones paterna California se muestran menos ansiedad que sus homólogos de la Virgen, en consecuencia, cuando se expone al olor de un depredador, los padres mostraron menos interrupciones en la secuencia de preparación de los animales vírgenes (véase la Figura 6).

Figura 1
Figura 1: (A) Hombre de California ratones con respuesta paterna hacia la misma especie alienígena cachorro. (B) ratón ciervo macho mostrando una actitud prudente (tramo de asistir) y la respuesta de evitación de la presencia de un extranjero cachorro misma especie. Nota: En estas evaluaciones la interacción social, si un varón presenta las respuestas agresivas hacia el cachorro, los experimentadores de inmediato golpeó la parte superior de la jaula para distraer a los hombres. En este momento se termina la sesión y el cachorro se retira, inspeccionada por cualquier herida y regresó a la madre. En nuestro laboratorio, esto rara vez se observa con P. californicus, pero los hombres se observa ocasionalmente con P. maniculatus, observación e intervención inmediata, sin embargo, evitar que se produzcan daños a los animales.

Figura 2
Figura 2: Un ratón California interactuar con un ratón de juguete, la mayoría trató de masticar estos estímulos.

Figura 3
Figura 3: El diseño experimental del estudio, había alrededor de 6 animales en cada grupo para cada especie.

Figura 4
Figura 4: Gráfico del proceso de inmunocitoquímica.

Figura 5
HigoUre 5 respuestas Paternal en el California y los ratones ciervo;. respuestas más paternal (el novio, agacharse, más rápido de aproximación) se observaron en los ratones California. Más tramo asiste (respuesta al estrés) se observaron en los ratones de los ciervos.

Figura 6
Figura 6. Inmunorreactividad vasopresina en distintas áreas cerebrales de ambas especies. Los ratones de California había más manchas en las células y las fibras de PVN.

Figura 7
Figura 7: Paternal ratones California mostraron menos interrupciones en sus secuencias de limpieza en la presencia de olor de un depredador que los grupos de títeres expuestos y virgen.

Discussion

Este artículo analiza tres componentes esenciales piensa que son críticos para la ejecución exitosa de las investigaciones del comportamiento neurociencia: (1) un modelo animal representativos y válidos, (2) un protocolo de inmunocitoquímica precisos y sensibles, y (3) la mayoría de los análisis (observación y estadística ) tanto de los datos sobre el comportamiento y el cerebro. Errores en una sola categoría con toda seguridad, comprometer los resultados de todo el estudio. Por lo tanto, después de una cuidadosa selección del modelo animal adecuado, un considerable esfuerzo debe dirigirse a la prueba piloto de los procedimientos conductuales e histológicos para asegurar que el comportamiento será fiable observados en el estudio, seguido por el tratamiento con éxito de los cerebros.

Como se mencionó anteriormente, el uso de especies comparativo para identificar los mecanismos neurobiológicos de una respuesta particular es un enfoque metodológico valioso porque esta técnica no requiere de la ingeniería genética o dolorosas manipulaciones quirúrgicas. Por lo tanto, este enfoque metodológico utiliza menos amenazados, los animales intactos. El uso de las variaciones naturales de los animales, sin embargo, se ve reforzado por la incorporación de los recursos naturales-como los entornos, incluso si los animales se encuentran en el laboratorio. Además, si los estudios de laboratorio se puede extender al campo para validar la autenticidad de las diferencias entre especies en la conducta de interés, el siguiente paso es recomendable. Aunque el enfoque comparativo ofrece muchas ventajas, una limitación es el carácter correlativo de los datos y, en consecuencia, las técnicas adicionales, tales como las manipulaciones farmacológicas deben ser utilizados para validar aún más la función de objetivo sistemas neurobiológicos de la conducta de interés.

Una vez que los experimentadores tener confianza en los procedimientos conductuales, histológicos y estadísticos, se debe tener cuidado para que las condiciones de vida de los animales se mantienen constantes para todos los grupos excepto, por supuesto, para la manipulación experimental. Cambios en variables tales como los horarios de luz, los niveles de ruido, los cuidadores, los niveles de humedad y los olores en el laboratorio podría tener efectos significativos en las respuestas de los animales neurobiológica.

En este artículo, el anticuerpo primario se utilizó para la detección de la vasopresina, pero otros anticuerpos primarios se pueden utilizar para una gran cantidad de neurotransmisores diferentes de interés. Si el experimentador está trabajando con un nuevo anticuerpo, es importante llevar a cabo estudios de valoración para determinar la dilución óptima del anticuerpo nuevo. Muchas veces los anticuerpos se utiliza demasiado (según lo sugerido por el fabricante), lo que resulta en el tejido que está demasiado oscuro para distinguir la señal, además, el uso excesivo de los anticuerpos es muy caro.

Por último, si hay más de un análisis estadístico solo se puede utilizar para proporcionar puntos de vista alternativos y las interpretaciones de los datos, que deben ser utilizados. En este estudio en particular, los modelos lineales generales, correlación y análisis de escalamiento multidimensional se utiliza para proporcionar los puntos de vista más informativo de los datos.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por la beca no. 0723341 (a KGL) de la Fundación Nacional de Ciencias. También estamos agradecidos por las contribuciones aportadas por el Programa de Becas de Pregrado Schapiro Investigación y el Departamento de Psicología de Randolph-Macon College. Finalmente, agradecemos las contribuciones de colaboración Craig Kinsley en esta investigación y ayudar a Amanda Rzucidlo en la preparación del laboratorio de I-MC para este artículo de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Compound Microscope Motic BA400
BIOQUANT Life Science Software BioQuant Image Analysis Corporation Version 8.40.20
Cryostat Microm International HM525
Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) Cole-Parmer 7518-00
24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) Corning 3526
25x75x1mm Microscope Slides Globe Scientific, Inc. 1324W
22x50mm No.1 Cover Slip Globe Scientific, Inc. 1414-10
Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes Electron Microscopy Sciences 70962-9 &nbps;
Alconox Detergent Powder Alconox, Inc. 1104
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1kg CAS 7647-14-5
Monobasic Sodium Phosphate Spectrum SO130 CAS 10049-21-5
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30412 CAS 10028-24-7
Triton X Spectrum TR135 CAS 9002-93-1
Permount Fisher Scientific SP15-500 CAS 108-88-3
Chromium potassium Sulfate Sigma-Aldrich C-5926 CAS 7788-99-0
CitriSolv Fisher Scientific 22-143975
Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint Pharmco-AAPER 111000200CSPP
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent Immunostar, Inc. 20069
Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified Vector Laboratories BA-1000
Elite Standard Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB Peroxidase Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100
Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box Knox Purchase at local grocery store
3% Hydrogen Peroxide CareOne Purchase at local pharmacy
Bleach Clorox Purchase at local grocery store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
  2. Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
  3. Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
  4. Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
  5. Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
  6. Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
  7. Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
  8. Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
  9. Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
  10. Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
  11. Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics