Mit einem vergleichenden Arten Ansatz zur Neurobiologie der väterlichen Responses Untersuchen

Neuroscience
 

Summary

Die vergleichende Arten Ansatz ermöglicht Verhaltensänderungen Neurowissenschaftler verschiedene neurobiologische Faktoren, die mit bestimmten Verhaltensweisen, die als charakteristisch für ein bestimmtes Tier-Modell angesehen assoziiert zu erkunden. Unter Ausnutzung der natürlichen Unterschiede im Verhalten zwischen nahe verwandten Arten, diese Technik nicht erforderlich invasive Techniken, um den Ausdruck des Verhaltens zu manipulieren.

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Franssen, C. L., Bardi, M., Lambert, K. G. Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses. J. Vis. Exp. (55), e3173, doi:10.3791/3173 (2011).

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Abstract

Ein Ziel der Behavioral Neuroscience ist die zugrunde liegenden neurobiologischen Faktoren, die bestimmte Verhaltensweisen regeln zu identifizieren. Anhand von Tiermodellen, um dieses Ziel zu erreichen, benötigen viele methodische Strategien invasive Techniken, um die Intensität des Verhaltens von Interesse (zB Läsion Methoden, pharmakologischen Manipulationen, Mikrodialyse Techniken, gentechnisch veränderten Tiermodellen) zu manipulieren. Die Nutzung einer vergleichenden Arten Ansatz ermöglicht es den Forschern, um die Vorteile von natürlich vorkommenden Unterschiede im Ansprechen Strategien bestehenden in eng verwandten Arten zu nehmen. In unserem Labor verwenden wir zwei Arten der Gattung, die in Peromyscus väterliche Reaktionen unterscheiden. Die männlichen Hirsche California Maus (Peromyscus californicus) zeigt die gleiche elterliche Antworten als die weiblichen, während sein Vetter, zeigt die gemeinsame Rehe Maus (Peromyscus maniculatus) so gut wie keine Pflege / elterlichen Reaktionen in Gegenwart von Welpen. Von besonderem Interesse in diesem Artikel ist eine Erforschung der neurobiologischen Faktoren im Zusammenhang mit der affiliative sozialen Reaktionen des väterlichen California Rehe Maus ausgestellt verbunden. Da die Behavioral Neuroscience Ansatz ist vielfältig, werden die folgenden wesentlichen Bestandteile der Studie kurz angesprochen werden: die Identifizierung von geeigneten Arten für diese Art von Forschung, Datenerfassung für Verhaltensanalyse; Vorbereitung und Schneiden der Gehirne; grundlegende Schritte in Immunzytochemie für beteiligt die Quantifizierung der Vasopressin-Immunreaktivität, der Einsatz von Neuroimaging-Software, um das Gehirngewebe zu quantifizieren, die Verwendung eines Mikrosequenzierung Videoanalyse, um das Verhalten der Gäste und schließlich ist die geeignete statistische Analysen, um die am besten informierte Interpretation der Forschungsergebnisse liefern.

Protocol

1. Identification of Animal Modell

  1. Die California Deer Mouse (Peromyscus californicus) ist ein ideales Modell, um väterliche Reaktionen zu erforschen. Wie Sie sehen, Pfleger diese Maus die Welpen ebenso wie die Mütter tun - sie haben sogar kriechen über sie, so dass es wie die Welpen stillen sucht. Das Verhalten der California Mäusen ist es, eine Art derselben Gattung, die gemeinsame Rehe Maus (Peromyscus maniculatus), die wenig Interesse an den Welpen Ausstellungen, oft auf der Flucht oder gar angreifen verglichen. (Siehe Abbildung 1 für die Bilder von diesen Arten der Interaktion mit Welpen.)
  2. Sobald die Spezies-Modell identifiziert wurde dann die verschiedenen Gruppen müssen noch festgelegt werden. In dieser Studie werden biologische Väter, Jungfrauen ohne Eltern erleben, und Jungfrauen mit beschränkter pup Exposition (Welpe ausgesetzt oder Pflegeeltern Väter) der beiden Arten, so dass beide veranlagt und erwarb väterliche Merkmale beurteilt werden kann, verwendet. In diesem speziellen Studie, die wir auch alle Gruppen, um ein Spielzeug Maus pup, um sicherzustellen, dass die sozialen Interaktionen spezifisch für ein Welpe und nicht um eine repräsentative Antwort auf alles in den Käfig gesetzt wurden ausgesetzt (siehe Abbildung 2).
  3. Vor der Untersuchung neurobiologische Faktoren ist es wichtig, zu bestätigen, dass die ausgewählten Arten deutliche Unterschiede im Verhalten von Interesse zu zeigen. In dieser Studie sind Männer in einem Käfig mit einem Welpen für fünf Minuten und eine väterliche Verhalten Ethogramm (siehe Tabelle 1 zum Beispiel der Ethogramm) gelegt wird ein Tor Verhaltensweisen wie Latenz verwendet werden, um den Welpen und viel Zeit in Kontakt mit abgebrannten Ansatz den Welpen. Wenn aggressive Reaktionen beobachtet werden, ist der Welpe sofort entfernt. Diese Sitzungen sind oft auf Video aufgezeichnet, so eine sorgfältige Verhaltensanalyse später durchgeführt werden können.

2. Vorbereitung Gehirngewebe

  1. Nach einer Standard-Perfusion jeder Maus (Protokoll im Anhang), sind die Köpfe, so dass sie zu zerschneiden in den speziellen Bereich von Interesse (zeige Gehirn) entfernt.
  2. Eine Standard-Maus Hirnatlas (zeige atlas) dient dazu, die Nucleus paraventricularis im Hypothalamus, einem Gebiet reich an Zellen, die das Neuropeptid von Interesse in dieser Studie zu finden - Vasopressin (AVP).
  3. Das Gehirn ist dann gesperrt und auf einem Einfrieren Futter, so dass das Gewebe vor dem Schnitt mit dem Mikrotom einfrieren wird. Das Hirn ist im Schnitt in ein Trimm-Modus, bis bestimmte Landmarken identifiziert werden, dann ist die spezifische Gehirn Dicke 30 Mikron in diesem Fall ist für das Gehirn Abschnitte für die Analyse verwendet wird.
  4. Das Gehirn Abschnitte sind sorgfältig in Well-Platten mit Phosphatpuffer (PBS) gefüllt; (Protokoll für PBS beigefügt; Bitte beachten Sie, dass dies nur ein Beispiel für eine Standard-Immunzytochemie Protokoll).

3. Immunzytochemie

  1. Während die verschiedenen Schritte dieses Prozesses (siehe beigefügte Protokoll), ist es wichtig, genaue Pipettieren Fähigkeiten, um genaue Messungen von Chemikalien und anderen Zutaten wichtig sicherzustellen, für diese Technik (zeige Schüler Pipettieren) haben.
  2. Der erste Schritt in diesem Prozess ist das Waschen der Gehirne, die anstelle der PBS in der Well-Platten drei vor fünf Mal beinhaltet, zwischen jedem Waschgang die Well-Platten sind auf einer Wippe für 10 Minuten gelegt (show Schüler ersetzen PBS und Platzierung Well-Platten auf Rocker) .
  3. Die Hirnschnitten werden dann an den primären Antikörper-Lösung ausgesetzt und bei 4 ° C über Nacht auf der Wippe (show-Prozess).
  4. Nach einem weiteren Waschschritt werden die Hirnschnitten zu einem sekundären Antikörper für eine Stunde auf der Wippe bei Raumtemperatur ausgesetzt, dann erneut gewaschen.
  5. Als nächstes werden die Gehirne sind zu einem Avitin-Biotin-Komplex-Lösung für die Visualisierung der neurochemischen-positive Zellen herzustellen ausgesetzt.
  6. Für die endgültige Visualisierung Schritt werden die Gehirne DAB ausgesetzt. Dies ist ein gefährliches Produkt und sollte immer mit Vorsicht behandelt werden. Wie hier zu sehen, beginnen die Hirnschnitten zu dunkler vor Ihren Augen (show-Prozess).
  7. Nach dem DAB Exposition, die Gehirne durch die letzte Reihe von Waschungen zu gehen und sich dann vorsichtig auf subbed Objektträger gebracht und über Nacht trocknen gelassen (zeige die Platzierung einer Hirnschnitt auf einer Folie, siehe Anlage subbed Folien-Protokoll).
  8. Die Objektträger werden dann durch eine Reihe von destilliertem Wasser und Alkohol wäscht gelöscht, endlich in Citrosolv bevor sie eingedeckt und in einer SlideBox zur sicheren Aufbewahrung (zeigen verschiedene Aspekte dieses Prozesses, siehe Anhang für das Clearing-Verfahren) gespeichert unter Wasser.

4. Neuroquantification

  1. Nach dem Objektträger getrocknet sind, können sie mit spezialisierten neuroquantification Software beurteilt werden. Hier Bioquant Software wird verwendet, um den Vasopressin-positive Zellen und Fasern in den Nucleus paraventricularis der Mäusehirne quantifizieren (show-Software auf dem Bildschirm ... und Mikroskop).
  2. Die spezifischen Bereich von Interesse ist, die anhand des Messmöglichkeitender Software, um das Gesichtsfeld für neuroquantification etablieren. Es ist wichtig, dass eine konsistente visuelle Feldgröße für jedes Tier wird quantifiziert (zeige Schüler tun).
  3. Hier werden die dunkel gefärbten Vasopressin-immunreaktive Zellkörpern und Fasern sind erkennbar. Weil es schwierig ist, zu zählen oder zu verfolgen dieses Gewebe, verwendet ein spezielles Merkmal dieser Software Licht Schwellenwert für die Gesamtmenge der positiv gefärbten Gewebe innerhalb des angegebenen Bereichs von Interesse zu bestimmen. Dieser Schwellenwert erzählt uns, wie viel von den angegebenen Bereich enthalten Vasopressin-positive Gewebe (zeigen die Daten, Wert auf dem Bildschirm).

5. Behavioral Analysis

  1. Wenn mehr als ein Beobachter Scoring wird die Videobänder, ist es wichtig, Interrater-Reliabilität zu etablieren, um sicherzustellen, dass die Beobachter sind Scoring das Verhalten in einer konsistenten Art und Weise. Für die eigentliche Scoring-Sitzung sollte ein Verhaltens-Scoring Blatt bereit, für eine einfache Scoring-Verhalten während der Beobachtung Sitzungen zu ermöglichen (siehe Tabelle 2 zum Beispiel von Scoring-Tabellenkalkulation) werden.
  2. Für Verhaltensweisen, die nicht schnell episodischen Reaktionen kann ein Mikrosequenzierung Analyse zeigen Feinheiten über den Verlauf der spezifischen Reaktionen. Zum Beispiel, Fellpflege Verhalten besteht aus einer Kette von sehr schnellen Antworten. Obwohl eine Option ist, einfach erfassen das Vorhandensein und die Dauer der Pflege, ist eine andere, die Kette der Ereignisse zu dieser Reaktion zu dokumentieren. Mit dieser Mikrosequenzierung Software Score Beobachter die Anwesenheit eines bestimmten Verhaltens jeder zweite, wie von der Software (show-Software und Video) dazu aufgefordert werden.
  3. Nach der Datenerhebung werden die Parameter von Interesse bestimmt und die entsprechenden Verhaltensweisen Noten werden analysiert. Beispiele können Gesamtdauer der Zeit in Kontakt mit den Welpen, oder die Anzahl der Störungen in der Pflege-Sequenz (zeige Computer mit Tabellenkalkulation mit Daten für jedes Tier eingegeben) ausgegeben werden.
  4. Sobald das Verhalten erzielt wird, ist es wichtig zu bestätigen, dass die beiden Arten unterschiedliche Bewältigungsstrategien ausgestellt für das Verhalten von Interesse in der Studie. In diesem Fall ist der California Hirsche Mäusen sollte mehr väterliche Verhalten als die gemeinsame Hirsche Mäusen. Darüber hinaus können verschiedene Verhaltensmaßnahmen mit Gehirn Maßnahmen korreliert werden, um eine fundierte Analyse relevanten Einflüsse zu bekommen.

6. Repräsentative Ergebnisse:

  1. Zur Validierung des Modells sollten die Daten zeigen deutlich, dass die beiden Arten unterschiedlich ausgeführt im Hinblick auf das Verhalten von Interesse. Hier sehen Sie, dass die P. californicus Männer verbrachten mehr Zeit Pflege und geduckt über die Welpen, zwei Markenzeichen des väterlichen Antworten (siehe Abbildung 4).
  2. Um festzustellen, ob die neurobiologial Variable von Interesse ist in väterliche Reaktionen wichtig, die Menge an Vasopressin (AVP)-positive Gewebe wurde für mehrere relevante Hirnregionen quantifiziert; wie man sieht, das väterliche P. californicus Tiere hatten mehr immun-positive Gewebe in mehreren dieser Hirnregionen. (Siehe Abbildung 5).
  3. In einer ähnlichen Studie mit dem Mikrosequenzierung Analyse wurde die Hypothese aufgestellt, dass väterliche California Mäuse würden weniger Angst als ihre Pendants Jungfrau zeigen, dementsprechend, wenn ein Raubtier Geruch ausgesetzt sind, zeigten die Väter weniger Unterbrechungen in der Pflege-Sequenz als die jungfräuliche Tiere (siehe Abbildung 6).

Abbildung 1
Abbildung 1: (A) männlich California Mäusen ausstellenden väterliche Reaktionen gegenüber Artgenossen fremd pup. (B) Männliche Hirsche Maus präsentiert einen vorsichtigen Ansatz (Stretch teilnehmen) und die Vermeidung Reaktion in Anwesenheit eines Artgenossen fremd pup. Hinweis: In dieser sozialen Interaktion Einschätzungen, wenn ein Männchen Exponate aggressive Reaktionen auf die Welpen, die Experimentatoren sofort auf den Spitzenplätzen der Käfig mit dem männlichen abzulenken. Zu diesem Zeitpunkt die Sitzung beendet wird und der Welpe wird entfernt, inspiziert für alle Wunden und kehrte nach der Mutter. In unserem Labor, das selten mit P. beobachtet californicus Männchen, sondern ist gelegentlich mit P. beobachtet maniculatus; genaue Beobachtung und sofortiges Eingreifen, aber Schlimmes verhindern das Auftreten von den Tieren.

Abbildung 2
Abbildung 2: A California Maus Interaktion mit einem Spielzeug-Maus, die meisten versuchten, auf diese Reize zu kauen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Experimentelles Design der Studie, es gab ca. 6 Tiere in jeder Gruppe für die einzelnen Arten.

Abbildung 4
Abbildung 4: Grafik der Immunzytochemie Prozess.

Abbildung 5
FeigeAbbildung 5 Paternal Reaktionen in der kalifornischen und Rehe Mäusen;. mehr väterliche Antworten (Bräutigam, ducken, schneller Ansatz) wurden in der kalifornischen Mäusen beobachtet. Mehr Stretch besucht (Stress-Reaktion) wurden in der Hirsch-Mäusen beobachtet.

Abbildung 6
Abbildung 6. Vasopressin-Immunreaktivität in verschiedenen Gehirnarealen von beiden Arten. Die California-Mäusen hatten mehr Färbung in den PVN Zellen und Fasern.

Abbildung 7
Abbildung 7: Väterliche California Mäuse zeigten weniger Störungen in ihrer Pflege-Sequenzen in der Gegenwart von einem Raubtier Geruch als der Welpe ausgesetzt und Jungfrau Gruppen.

Discussion

Dieser Artikel beschreibt drei wesentliche Komponenten als kritisch für die erfolgreiche Ausführung von Behavioral Neuroscience Untersuchungen: (1) eine repräsentative und valide Tiermodell, (2) eine genaue und sensible Immunzytochemie-Protokoll, und (3) die meisten Analyse (Beobachtungs-und statistische ) sowohl der Verhaltens-und Gehirn-Daten. Fehler in einer einzelnen Kategorie wird sicherlich Kompromisse die Ergebnisse der gesamten Studie. Daher nach sorgfältiger Auswahl der geeigneten Tiermodell sollten erhebliche Anstrengungen zur Pilotierung der Verhaltens-und histologische Verfahren, um sicherzustellen, dass das Verhalten zuverlässig wird in der Studie beobachtet werden, durch die erfolgreiche Bearbeitung der Gehirne gefolgt gerichtet werden.

Wie bereits erwähnt, ist die Verwendung von vergleichenden Arten neurobiologischen Mechanismen einer bestimmten Reaktion zu identifizieren ein wertvolles methodisches Vorgehen, da diese Technik nicht erforderlich ist Gentechnik oder schmerzhafte chirurgische Eingriffe. So nutzt dieses methodischen Ansatzes weniger bedroht, intakten Tieren. Die Verwendung von natürlichen Schwankungen der Tiere ist jedoch durch den Einbau von Natur-ähnliche Umgebungen gestärkt, auch wenn die Tiere im Labor untergebracht sind. Ferner, wenn Laboruntersuchungen, um das Feld weiter zu validieren die Authentizität der Arten Unterschiede im Verhalten von Interesse erweitert werden kann, wird diesen nächsten Schritt zu empfehlen. Obwohl der vergleichenden Ansatz bietet viele Vorteile, ist eine Einschränkung der korrelativen Natur der Daten, folglich zusätzliche Techniken wie pharmakologische Manipulationen sollten zur weiteren Validierung der Rolle der gezielte neurobiologische Systeme in das Verhalten von Interesse sein.

Sobald die Experimentatoren zuversichtlich über die Verhaltens-, histologische und statistische Verfahren zu fühlen, sollte darauf geachtet werden, dass so die Lebensbedingungen der Tiere konstant bleiben für alle Gruppen außer, natürlich, für die experimentelle Manipulation. Änderungen in Variablen wie Licht Zeitpläne, Geräuschpegel, Hausmeister, Luftfeuchtigkeit und Gerüche im Labor hätte erhebliche Auswirkungen auf die Tiere neurobiologische Reaktionen.

In diesem Artikel wird das primäre Antikörper wurde für den Nachweis von Vasopressin, sondern auch andere primäre Antikörper kann für eine Vielzahl von verschiedenen neurochemischen von Interesse verwendet werden kann. Wenn der Experimentator mit einem neuen Antikörper arbeitet, ist es wichtig, Titration Studien durchzuführen, um die optimale Verdünnung des neuen Antikörpers zu ermitteln. Viele Male zu viel Antikörper verwendet wird (wie vom Hersteller empfohlen), was im Gewebe, die zu dunkel, um das Signal zu unterscheiden ist, ferner ist die exzessive Benutzung des Antikörpers sehr teuer.

Schließlich, wenn mehr als eine statistische Analyse kann verwendet werden, um alternative Ansichten und Interpretationen der Daten aufgefordert werden, sollten sie genutzt werden. In diesem speziellen Studie wurden allgemeine lineare Modelle, Korrelationsstudien und multidimensionale Skalierung Analysen verwendet werden, um die informativste Sichten auf die Daten bieten.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Grant No finanziert. 0723341 (für KGL) von der National Science Foundation. Wir sind auch dankbar für die Beiträge von den Schapiro Undergraduate Research Fellowship-Programm und die Abteilung für Psychologie an Randolph-Macon Hochschule zur Verfügung gestellt. Schließlich schätzen wir Craig Kinsley kollaborativer Beiträge in diesem Forschungs-und Amanda Rzucidlo Hilfe bei der Vorbereitung der R-MC-Labor für dieses Video Artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Compound Microscope Motic BA400
BIOQUANT Life Science Software BioQuant Image Analysis Corporation Version 8.40.20
Cryostat Microm International HM525
Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) Cole-Parmer 7518-00
24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) Corning 3526
25x75x1mm Microscope Slides Globe Scientific, Inc. 1324W
22x50mm No.1 Cover Slip Globe Scientific, Inc. 1414-10
Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes Electron Microscopy Sciences 70962-9 &nbps;
Alconox Detergent Powder Alconox, Inc. 1104
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1kg CAS 7647-14-5
Monobasic Sodium Phosphate Spectrum SO130 CAS 10049-21-5
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate Sigma-Aldrich 30412 CAS 10028-24-7
Triton X Spectrum TR135 CAS 9002-93-1
Permount Fisher Scientific SP15-500 CAS 108-88-3
Chromium potassium Sulfate Sigma-Aldrich C-5926 CAS 7788-99-0
CitriSolv Fisher Scientific 22-143975
Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint Pharmco-AAPER 111000200CSPP
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent Immunostar, Inc. 20069
Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified Vector Laboratories BA-1000
Elite Standard Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB Peroxidase Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100
Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box Knox Purchase at local grocery store
3% Hydrogen Peroxide CareOne Purchase at local pharmacy
Bleach Clorox Purchase at local grocery store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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