Teratom Generation i testis Capsule

Published 11/07/2011
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Medicine
 

Summary

Humane pluripotent stamceller (hPSCs) har potensial til å behandle en myriade av ulike sykdommer. Nytten av disse cellene ligger i det faktum at de kan differensiere i hvilken som helst celletype i kroppen. Her beskriver vi teratom analysen, som brukes til å demonstrere pluripotence av hPSCs.

Cite this Article

Copy Citation

Peterson, S. E., Tran, H. T., Garitaonandia, I., Han, S., Nickey, K. S., Leonardo, T., et al. Teratoma Generation in the Testis Capsule. J. Vis. Exp. (57), e3177, doi:10.3791/3177 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pluripotent stamceller (PSCs) har den unike egenskap at de kan differensiere i celler fra alle tre bakterie lag. Dette gjør dem en potensielt verdifullt verktøy for behandling av mange forskjellige sykdommer. Med bruk av induserte pluripotent stamceller (iPSCs) og videre forskning med humane embryonale stamceller (hESCs) er det behov for analyser som kan påvise at en bestemt cellelinje er pluripotent. Germline overføring har vært gullstandarden for å demonstrere pluripotence av musen embryonale stamceller (mESC) linjer 1,2,3. Ved hjelp av denne analysen, kan forskerne viser at en mESC linje kan gjøre alle celletyper i embryoet inkludert kjønnsceller 4. Med generasjon av menneskelig ESC linjer 5,6, var den aktuelle analysen å bevise pluripotence av disse cellene uklar ettersom menneskelige ESCs ikke kan testes for germline overføring. Som en surrogat, blir teratom analysen dag brukes til å demonstrere pluripotsering av humane pluripotent stamceller (hPSCs) 7,8,9. Selv om denne analysen har nylig kommet i søkelyset, og nye teknologier blir aktivt utforsket, er det teratom analysen dagens gullstandard 7. I denne analysen, blir cellene aktuelle sprøytet inn en immun kompromittert mus. Hvis cellene er pluripotent, vil en teratom etter hvert utvikle og deler av svulsten vil vise vev fra alle 3 spiren lag 10. I teratom analysen, kan hPSCs injiseres i ulike områder av musen. De vanligste injeksjonssteder inkluderer testis kapselen, nyrene kapsel, leveren, eller i benet enten subkutant eller intramuskulært 11. Her beskriver vi en robust protokoll for generering av teratomer fra hPSCs bruker testis kapsel som sted for tumorvekst.

Protocol

Merk: Alle dyr prosedyrer må godkjennes av IACUC eller tilsvarende.

Alt kirurgisk utstyr må steriliseres før operasjonen. Sterile hansker, forheng og gasbind må brukes.

1. Forberedelse før operasjonen

  1. Skaff 6 ukers gamle Mus musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J hannmus eller annen immunkompromitterte stamme av mus.
  2. Steriliser alle kirurgiske instrumenter, hansker og gasbind.
  3. Distansere hPSCs å bli injisert med accutase.
  4. Telle celler og resuspender 1.000.000 celler per 20-30 mL i matrigel fortynnet 1:1 i DMEM/F-12. Hold celler på is inntil ferdig.
  5. Merk at ofte er det nyttig å gjøre en gjennomgang av forsøket der Trypan Blå injiseres. Dette vil bidra til å identifisere eventuelle problemer før noen celler blir bortkastet.
  6. I vivarium, anesthetize musen i henhold til aksepterte prosedyrer ved institusjonen din. I våre forsøk har vi brukt en anesthESIA maskin med isofluran. Musene ble først satt i en induksjon kammer med 1L/min oksygen og 3-4% isofluran. Når bedøvd, ble en nese kjegle med 1L/min oksygen og 2-3% isofluran brukt.
  7. Barbere magen med clippers, og rengjør fremre vegg av mus magen, fra midten av magen og jobbe klokken utover. Første gangs bruk povidonjodid løsning vask deretter med 70% etanol. Gjenta 3 ganger, endrer vattpinner hver gang. Overfør dyret til en varmepute for å holde dyret varmt inne en vevskultur eller dissekere hette.
  8. Lag en 1 cm langsgående snitt gjennom huden og peritoneum med sterile kirurgiske saks like under nivået i hofteleddet.
  9. Mens du holder peritoneum med tang, nå ned mot høyre hofte med en annen steril forcept og trekke ut det hvite fettvevet sammen med vedlagt testiklene.
  10. Plasser testiklene på steril kompress.
  11. Fyll en tuberkulinprøve eller Hamilton (1cc) sprøyte with hPSCs skal injiseres. Merk at det er en god idé å inkludere en kontroll hPSC linje som du vet er pluripotent som WA09 (også kjent som H9). På denne måten har du en positiv kontroll som du kan bruke til å finne ut om injeksjon eller operasjon var feil.
  12. Sakte injiserer de hPSCs (20-30 mL) i midten av testikkel kapselen bort fra noen store blodårer, stoppe hvis testiklene kapselen begynner å svelle.
  13. Fjern nålen sakte for å unngå refluks av cellene.
  14. Ved hjelp av pinsett, overføre testiklene og fettvev tilbake til sin opprinnelige posisjon i magen.
  15. Lukk opp peritoneum med 2 eller 3 reabsorbable suturer og lukke huden med autoclips.
  16. Musen bør holdes varm før den gjenoppretter og gitt noen form for smertestillende (se hva som er akseptert i vivarium din) etter operasjonen to ganger daglig i 1-2 dager.
    Vær oppmerksom på at verken bedøvelse eller smertestillende med forstyrre tumor utvikling.
  17. Overvåk the dyr for tumorvekst i 6-12 uker. Svært sjelden, kan svulstene vokser til 5 mm i størrelse før 6 uker etter injeksjon, derfor er det viktig å overvåke dyrene. Hvis dette skjer, bør dyrene avlives og svulster behandlet og analysert som vanlig.
  18. Når svulsten er håndgripelig og når ca 5mm i størrelse, anesthetize musen og ofre det i henhold til aksepterte dyr protokoll prosedyrer.
  19. Fjern tumor og dokument følgelig - fotografi, mål størrelse, veie.
  20. Skjær svulst i små biter og fikse i 4% paraformaldehyde løsning. Oppbevares i 4% paraformaldehyde inntil prøvene blir sendt til en patolog for seksjonering, farging og analyse.

2. Representative Resultater:

Når denne protokollen er gjort som beskrevet og den injiserte cellelinje er pluripotent, bør en håndgripelig, visuelt åpenbar, tumor danne innen 12 uker på det meste. For etablerte hPSC linjer som WA09, vi vanligvis sersvulster innen 6 uker. For iPSC linjer er det ikke uvanlig å se svulster innen 8-10 uker. Det er svært viktig å injisere mus med en linje som er kjent for å være pluripotent, som en positiv kontroll, for å være sikker på at inngrepet ble utført riktig. Svulster vanligvis ser veldig heterogen og har mange festet cyster (figur 1). Analyse av tumorprøver av en patolog bør vise differensierte vev fra alle tre bakterie lag (Figur 2).

Figur 1
Figur 1. Typisk hPSC utledet teratom i testis kapselen.

Etter beskrevet protokollen, ble én million WA09 celler sprøytes inn i testis kapsel av en immun kompromittert mus. Seks uker senere en teratom ble observert. A) teratom trukket fra musen. B) Lukk opp bilde av teratom. Legg merke til heterogenitet og cyste strukturer.

Figur 2 Figur 2. Hematoxylin og eosin fargete snitt fra teratom viser vev fra hver bakterie lag.
Etter fiksering var teratom seksjoneres og beiset med Hematoxylin og eosin. Analyse av en patolog avslørte tilstedeværelsen av celler fra hver av de 3 bakterie lag.

Discussion

Metoden som presenteres her gir en svært pålitelig og ukomplisert måte å generere teratomer fra hPSCs i testikkelen kapselen. Det er flere kritiske parametere i denne teknikken. Spesielt er det viktig å injisere hPSC cellelinjer som er kjent for å være pluripotent som en kontroll. Andre viktige parametre er tidsintervallet mellom injeksjon og tumor observasjon. For cellelinjer som WA09, bør teratomer observeres i 6-8 uker. For nye iPSC linjer finner vi at ofte 10 uker er nødvendig. En annen bekymring er antall celler injisert. Vi injiserer en million celler, men analysen kan enkelt gjøres med færre celler. I tillegg er injeksjon middels viktig. Vi finner at vi får de beste resultatene når cellene blir injisert i en 1:1 blanding av matrigel og DMEM/F-12, i motsetning til PBS eller DMEM/F-12.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av CIRM tilskudd # TR-1250, RT1-01108, og CL1-00502.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Invitrogen A1110501
DMEM/F-12 Invitrogen 113300-032
Matrigel BD Biosciences 354277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-255 (1984).
  2. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154 (1981).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).
  4. Downing, G. J., Battey, J. F. Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).
  5. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1145 (1998).
  6. Reubinoff, B. E. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (2000).
  7. Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).
  8. Brivanlou, A. H. Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells. Science. 300, 913-913 (2003).
  9. Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera. Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).
  10. Gertow, K. Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice. Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).
  11. Gertow, K. Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Here come with a brand new bioinformatic web site focusing on stem sell,
    breast cancer, Alzheimer's disease,ADHD, SARS,multiple sclerosis
    go take a look.


    I have not touch ,NEUROD1, NKX².², and PAX4, ACE, TNF,EAACI,ncRNAs,siRNA,mRNA,,IGF-1R, SET8,LIPL-4,P38,,TLR9,GABAA,Ag85B,!,

    I work with Dr. Bernard Roizman on HSV-1,Vaccine at U of Chicago , ²7 years ago! http://www.gene²gene.com Cxcr4,AR in here http://www.gene²gene.com/P53.htm stem cell,breast
    cancer,Dr.Verma,you did it on ²00² http://www.gene²gene.com/Oct4.htm stem cell

    ²00²,I left Biocarta to work at ITRI Research Institute at Taiwan,
    Early Oct My mother pass away at San Diego, End of Oct,
    I participated running exercise at ITRI, I fall down, I saw my
    mother, She told me " It is not the time for you to come here,
    go back!" I also saw my brother in law, two uncles, and
    grandma! Few days later, I was moved to major hospital at Taipei!
    One night, I waked up, and knell down against the window,
    my wife ask me "What you doing?" I told her , I saw Jesse

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 11:11 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats