मानव परिधीय रक्त का विस्तार γδ टी Zoledronate का उपयोग कक्ष

Published 9/09/2011
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Immunology and Infection

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Summary

एक विधि के परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) से γδ टी कोशिकाओं का विस्तार वर्णित है. PBMC व्युत्पन्न γδ टी कोशिकाओं को उत्तेजित और zoledronate और interleukin-2 (आईएल-2) का उपयोग का विस्तार कर रहे हैं. Γδ टी कोशिकाओं की बड़े पैमाने पर विस्तार कैंसर के ऑटोलॉगस सेलुलर immunotherapy के लिए लागू किया जा सकता है.

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Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., et al. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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Abstract

Protocol

1. PBMC के अलगाव

  1. सोडियम हेपरिन के साथ एक बी.डी. Vacutainer CPT सेल तैयार ट्यूब में रक्त (7.5-8.0 मिलीलीटर) ड्रा. ट्यूब एक सोडियम हेपरिन anticoagulant और घनत्व Ficoll द्रव Hypaque, प्लस एक पॉलिएस्टर जेल बाधा है, जो दो तरल पदार्थ अलग होता है. कमरे के तापमान (18 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस) पर 1800 x पर 20 मिनट के लिए एक क्षैतिज रोटर (सिर स्विंग बाहर) में अपकेंद्रित्र ट्यूब / खून का नमूना . ब्रेक अपकेंद्रित्र बंद स्विच.
  2. Centrifugation के बाद, परतों के अनुक्रम के प्रकार (ऊपर से नीचे तक देखा) के रूप में होता है: एक) प्लाज्मा - ख) परिधीय रक्त mononuclear (PBMC) कोशिकाओं और प्लेटलेट्स - ग) - घनत्व समाधान घ) पॉलिएस्टर जेल - ई) granulocytes - च) लाल रक्त कोशिकाओं (छवि 1).
  3. प्लाज्मा की परत का एक अंश ले लीजिए, सेल परत परेशान बिना interphase ऊपर प्लाज्मा के 5 से 10 मिमी छोड़ने. प्लाज्मा संस्कृति (2.5 अनुभाग) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. विंदुक और हस्तांतरण के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब interphase पर समृद्ध अंश (PBMC) हार्वेस्ट.
  5. 10 मिलीलीटर के साथ PBMC धो फॉस्फेट-buffered (पीबीएस) inverting ट्यूब द्वारा, खारा 5 बार, और फिर 5 मिनट के लिए 400 x छ अपकेंद्रित्र .
  6. धोने कदम दो बार दोहराएँ, और तब पीबीएस के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend. सेल नंबर का निर्धारण करते हैं. आमतौर पर 1.3 x10 6 कोशिकाओं पूरे रक्त का एक मिलीलीटर से बरामद कर रहे हैं.
  7. PBMC में प्रवाह cytometry (3 खंड) (छवि 2) द्वारा γδ टी कोशिकाओं की आवृत्ति और phenotype का निर्धारण करते हैं.

2. Γδ टी कोशिकाओं का विस्तार

  1. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में सेल निलंबन कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x जी, अपकेंद्रित्र और supernatants त्यागें.
  2. 1000 आइयू / एमएल और 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम सांद्रता के लिए मानव आईएल 2 (आईएल -2) और zoledronate (Zometa) जोड़ने, क्रमशः द्वारा मध्यम संस्कृति (मुख्यमंत्री) तैयार करें. (सेल विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी संस्थान) ALyS203 या OpTmizer Invitrogen) मीडिया (γδ टी कोशिकाओं (संदर्भ 6 और 9 के बारे में अधिक जानकारी) की भलाई के विस्तार का समर्थन करते हैं. Zometa तरल रूप (4 mg/5-ml शीशी) में प्रदान की जाती है. एक 5 सुक्ष्ममापी समाधान तैयार करने के लिए, संस्कृति के माध्यम से 30 मिलीलीटर Zometa के 50 μl जोड़ें.
  3. Resuspend सेल संस्कृति माध्यम में गोली और 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल को समायोजित.
  4. Pipet 24 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 1x10 6 कोशिकाओं से युक्त मुख्यमंत्री से 1 मिलीलीटर . बड़े पैमाने पर संस्कृतियों के लिए, कोशिकाओं को 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / सेमी में वरीयता प्राप्त हो सकता है थाली कुओं, पकवान, या कुप्पी की सतह क्षेत्रों के अनुसार 2.
  5. ऑटोलॉगस प्लाज्मा (1.3 अनुभाग), जमा मानव अटल बिहारी सीरा, या FCS जोड़ें कि यह संस्कृति (24 अच्छी तरह से एक थाली में से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 100 μl) की मात्रा का लगभग 10% है. एक humidified 37 में प्लेटें प्लेस डिग्री सेल्सियस, 5% के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर 24-48 घंटा .
  6. 0.5-2 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के एक सेल घनत्व में संस्कृति को बनाए रखें . ताजा मध्यम हर 2-3 दिनों मानव आईएल 2 (1000 आइयू / एमएल) केवल (Zometa बिना) युक्त जोड़ें, और नए कुओं या आवश्यक के रूप में बोतल में में संवर्धित कोशिकाओं सेल प्रसार की डिग्री (3 छवि) के अनुसार, स्थानांतरण . आपूर्ति प्लाज्मा या सीरम माध्यम ताकि सीरम एकाग्रता कम से कम 1% बनाए रखा जा सकता.
  7. 12-14 दिन और आवृत्ति, phenotype, और प्रवाह cytometry द्वारा γδ टी कोशिकाओं (नीचे देखें) के कार्यों का निर्धारण पर हार्वेस्ट कोशिकाओं.

3. प्रवाह cytometry द्वारा प्ररूपी विश्लेषण

  1. 200 μl 2 एक्स 10 प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ट्यूबों के लिए 5 कोशिकाओं से युक्त नमूने स्थानांतरण .
  2. ठंड पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 400 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र . फिर, 50 μl FACS बफर (पीबीएस + 1% FCS 0.1 +% सोडियम azide) में छर्रों resuspend. नमूने (मोनोक्लोनल एंटीबॉडी तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं) के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के 5 μl जोड़ें .
  3. 20 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं.
  4. प्रत्येक नमूने के लिए 2 मिलीलीटर FACS बफर जोड़ें, और तब भंवर. 4 में 400 x जी डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के नमूने ध्यान से सतह पर तैरनेवाला छानना.
  5. 300 μl FACS बफर और भंवर में कोशिकाओं Resuspend. एक प्रवाह cytometer (छवि 2) नमूने का विश्लेषण.

4. IFN-γ उत्पादन 10 परख

  1. परख के पहले दिन, संवर्धन 3-5 x10 5 Daudi कोशिकाओं / एमएल द्वारा RPMI 1640 मध्यम से अधिक 10% (RPMI 10) FCS Zometa (5 सुक्ष्ममापी) (इसके बाद नामित Z - Daudi) के साथ रात भर में उत्तेजक औधधि कोशिकाओं को तैयार है.
  2. RPMI-10 में 2x10 6 कोशिकाओं / एमएल Z - Daudi और resuspend लीजिए. एक दौर नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से जेड Daudi (2x10 5) के 100 μl जोड़ें.
  3. 2x10 6 कोशिकाओं / एमएल RPMI 10 20 μg / मिलीलीटर में एक Brefeldin युक्त में γδ टी कोशिकाओं को तैयार है. प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त Z - Daudi कोशिकाओं γδ टी सेल निलंबन (5 2x10) के 100 μl स्थानांतरण या कुओं (केवल RPMI-10 के 100 μl, या 20 एनजी / मिली phorbol 12-myristate 13-एसीटेट के साथ RPMI-10 नियंत्रणPMA [] 2 μg / ionomycin मिली प्लस).
  4. ऊपर और नीचे pipetting कई बार मिक्स. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4 घंटा के लिए सेते हैं.
  5. 4 ° C में 400 x जी पर 5 मिनट के लिए थाली और अपकेंद्रित्र ठंड पीबीएस के 200 μl में छर्रों resuspend .
  6. FACS ट्यूबों के लिए नमूने स्थानांतरण. ठंड पीबीएस के 4 मिलीलीटर जोड़ें और 4 पर 400 x जी पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  7. FITC संयुग्मित (5 μl) विरोधी TCRVγ9 और PE/Cy5-conjugated विरोधी CD3 MAB (2.5 μl) के साथ FACS बफर के 50 μl में छर्रों Resuspend. सेते कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रकाश से रक्षा की.
  8. IntraPrep एक अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. प्रत्येक और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x जी ट्यूब अपकेंद्रित्र पीबीएस के 4 मिलीलीटर जोड़ें.
  9. आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें और IntraPrep अभिकर्मक 2 के 100 μl जोड़ें. मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  10. टेस्ट ट्यूब पीई संयुग्मित विरोधी IFN-γ MAB के 5 μl जोड़ें. सेते कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रकाश से रक्षा की.
  11. प्रत्येक और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x जी ट्यूब अपकेंद्रित्र पीबीएस के 4 मिलीलीटर जोड़ें. आकांक्षा से सतह पर तैरनेवाला निकालें और FACS बफर के 0.5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  12. प्रवाह cytometer द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण. CD3 TCRVγ9 + + कोशिकाओं पर गेट और IFN-γ (4 छवि) की अभिव्यक्ति की जांच .

5. प्रतिनिधि परिणाम:

यह संस्कृति की दीक्षा पर PBMC में γδ टी कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 2 ए, CD3 + TCRVγ9 का प्रतिशत + γδ PBMC में टी कोशिकाओं 0 दिन 1.6% थी. केंद्रीय स्मृति phenotypes प्रमुख आबादी CD27 + CD45RA + अनुभवहीन या CD27 + CD45RA थे. जब γδ टी कोशिकाओं कुशलतापूर्वक प्रेरित थे, वे 3-5 दिनों पर समूहों का गठन किया (3 एक छवि और बी ). जब क्लस्टर गठन में देरी किया गया था, जैसे अन्य प्रकार की कोशिकाओं के विकास को सीडी 4 + या सीडी 8 + αβ टी कोशिकाओं या एन.के. कोशिकाओं γδ टी कोशिकाओं (छवि 3 सी और डी) के विकास पर हावी सकता है. संस्कृति के 14 दिनों के के बाद, γδ टी कोशिकाओं की आवृत्ति सफल γδ टी सेल संस्कृतियों (छवि 2 ई) में सभ्य कोशिकाओं के 93.8% से अधिक वृद्धि हुई है . सुसंस्कृत γδ टी upregulated NKG2D और CD69 अभिव्यक्ति (छवि 2 जी और एच) कोशिकाओं. वे CD27 प्रदर्शित CD45RA - effector स्मृति phenotype (2 एफ छवि). γδ टी कोशिकाओं के कार्यों cytokine उत्पादन और cytotoxicity के संबंध में मूल्यांकन किया गया. intracellular IFN-γ धुंधला दिखा दिया है कि γδ टी कोशिकाओं / PMA ionomycin उपचार या z-Daudi कोशिकाओं के जवाब में IFN-γ उत्पादित कि zoledronate उपचार के बाद जमा आईपीपी (4 छवि). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि zoledronate कुशलता को प्रोत्साहित और कार्यात्मक γδ टी कोशिकाओं का विस्तार कर सकते हैं.

ट्यूब FITC पीई ECD PE/Cy5
1 CD3 CD19 CD45 CD14
2 CD3 TCRαβ सीडी 4 CD8
3 CD3 CD56
4 TCR Vγ9 TCRαβ CD45 CD3
5 TCR Vγ9 NKG2D
6 TCR Vγ9 CD69
7 TCR Vγ9 माउस IgG1
8 TCR Vγ9 CD45RA CD27
9 TCR Vγ9 माउस IgG1 माउस IgG1

तालिका 1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी γδ टी कोशिकाओं की बहुरंगा धुंधला में इस्तेमाल किया. हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन γδ टी कोशिकाओं के प्ररूपी विश्लेषण का एक उदाहरण छवि में दिखाया गया है. 2.

चित्रा 1
चित्रा 1 PBMC के पृथक्करण. रक्त (7.5-8.0 मिलीलीटर) सोडियम हेपरिन के साथ एक बी.डी. Vacutainer CPT सेल तैयार ट्यूब में तैयार की है और 1800 x छ पर 20 मिनट के लिए सीधे centrifuged Centrifugation के बाद, के रूप में जिसके परिणामस्वरूप परतों ऊपर से बो देखाttom:) प्लाज्मा - ख) PBMC और प्लेटलेट्स - घनत्व समाधान ग) - घ) पॉलिएस्टर जेल - ई) granulocytes - च) लाल रक्त कोशिकाओं.

चित्रा 2
चित्रा 2 γδ टी कोशिकाओं की विशिष्ट सतह phenotype. PBMC zoledronate और आईएल-2 के साथ 14 दिनों के लिए प्रेरित किया गया. प्रकोष्ठों के साथ दाग थे FITC लेबल Vγ9 विरोधी TCR और विरोधी CD3 γδ टी कोशिकाओं (एक और ई और) के विस्तार पर नजर रखने के PE/Cy5-labeled. γδ टी कोशिकाओं TCRVγ9 की उनकी अभिव्यक्ति के द्वारा की पहचान की गई, और CD27 और CD45RA (बी और एफ), (सी और जी) NKG2D, या CD69 (डी और एच) के उनकी अभिव्यक्ति की जांच की गई थी.

चित्रा 3
चित्रा 3 प्रतिनिधि γδ टी सेल संस्कृतियों. PBMC आईएल-2 (1000 आइयू / एमएल) और zoledronate (5 सुक्ष्ममापी) के साथ प्रेरित थे. प्रतिनिधि क्षेत्रों (IX71 उल्टे खुर्दबीन] x 200 [ओलिंप) दिखाए जाते हैं. क्लस्टर और γδ टी कोशिकाओं की समुच्चय दिन 3 (ए) और 5 दिन (बी), जब γδ टी कोशिकाओं सफलतापूर्वक विस्तार किया गया है पर देखा जा सकता है. इसके विपरीत, कोई समूहों या समुच्चय जब γδ टी सेल के विकास पर्याप्त (सी और डी) नहीं था मनाया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4 उत्पादन IFN-γ. γδ टी कोशिकाओं केवल RPMI 10 (ए) / या PMA ionomycin (बी) या 4 घंटा के लिए Z Daudi (सी) के साथ incubated रहे थे. सबसे पहले, TCRVγ9 की सतह अभिव्यक्ति दाग किया गया था और तब IFN-γ उत्पादन intracellular IFN-γ धुंधला द्वारा जांच की गई थी.

चित्रा 5
चित्रा 5 γδ टी सेल संस्कृति के कैनेटीक्स. (ए) संवर्धित कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या, (बी) γδ टी कोशिकाओं, और (सी) संकेत समय बिंदुओं पर γδ टी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या का प्रतिशत.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि PBMC से γδ टी कोशिकाओं के कुशल विस्तार सक्षम बनाता है. γδ टी कोशिकाओं को सक्रिय और विस्तार zoledronate द्वारा और आईएल-2 पूरा effector कार्यों, cytokine उत्पादन और cytotoxicity द्वारा परिलक्षित विकसित. यह बताया गया है कि सिंथेटिक phosphoantigens bromohydrin (BrHPP) पाइरोफॉस्फेट और 2 - मिथाइल - 3 - butenyl-1-पाइरोफॉस्फेट (2M3B1PP) भी γδ टी कोशिकाओं का विस्तार, लेकिन वे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं. इसके विपरीत, पहले से ही zoledronate Zometa के रूप में चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए लाइसेंस प्राप्त है. इसलिए, एक विश्वसनीय अभिकर्मक आसानी से उपलब्ध है.

संस्कृति मीडिया और सीरम का चयन महत्वपूर्ण है. जैसे ALyS203 (सेल विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी संस्थान) या OpTmizer (Invitrogen) के सफल γδ टी सेल के विस्तार के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया का प्रयोग करें 11. सत्यापित करें कि ऑटोलॉगस प्लाज्मा जमा मानव अटल बिहारी सीरा या FCS γδ टी सेल संस्कृति का समर्थन कर सकते हैं. इसके अलावा कि PBMC याद से कुछ दाताओं अन्य संस्कृति अभिकर्मकों की परवाह किए बिना zoledronate उत्तेजना के जवाब में विफल. अगर ऐसा होता है, एकमात्र विकल्प के लिए दाता बदल रहा है.

Γδ टी कोशिकाओं का संवर्धन जैसा कि हम प्रदर्शन किया है, अपेक्षाकृत जल्दी हासिल की थी, संवर्धित कोशिकाओं का लगभग 80% 7 दिन से γδ टी कोशिकाओं थे. γδ टी कोशिकाओं के लिए 12-14 दिन (छवि 5) पैदा करना जारी रखा . लगभग 2.2 x 10 8 γδ टी कोशिकाओं 1 10 x 6 से प्राप्त किया जा सकता है
PBMC 1.6 x 10 4 γδ टी कोशिकाओं से युक्त . यह संस्कृति विधि चरण में इस्तेमाल किया गया है नैदानिक ​​सुरक्षा और एकाधिक myeloma या फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों में Zoledronate - विस्तारित γδ टी सेल हस्तांतरण चिकित्सा की व्यवहार्यता का मूल्यांकन परीक्षण मैं 12,13 .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZOMETA Novartis AG zoledronate
PROLEUKIN Novartis AG human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD Biosciences 362753
RPMI1640 Invitrogen 21870-076
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7
OpTmizer Invitrogen 0080022SA
brefeldin A Sigma-Aldrich B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585-1MG
ionomycin Sigma-Aldrich 13909-1ML
IntraPrep Beckman Coulter Inc. A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD Beckman Coulter Inc. 6604727
anti-human CD8-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607011
anti-human CD14-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07765
anti-human CD19-PE Beckman Coulter Inc. A07769
anti-human CD45-ECD Beckman Coulter Inc. A07784
anti-human CD56-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07789
anti-human TCRαβ-PE Beckman Coulter Inc. A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC Beckman Coulter Inc. IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607107
anti-human CD45RA-ECD Beckman Coulter Inc. IM2711
anti-human CD69-PE BD Biosciences 555531
anti-human NKG2D-PE Beckman Coulter Inc. A08934
Anti-humal IFNγ-PE Beckman Coulter Inc. IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE Beckman Coulter Inc. A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07797A07798

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References

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