Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Immunology and Infection

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Summary

Un metodo per espandere γδ cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è descritta. PBMC cellule derivate γδ T vengono stimolati e ampliati con zoledronato e interleuchina-2 (IL-2). L'espansione su larga scala di γδ cellule T possono essere applicate a autologo immunoterapia cellulare del cancro.

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Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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Abstract

Γδ cellule T in grado di riconoscere e rispondere a una vasta gamma di antigeni indotta da stress, sviluppando in tal modo innato attività ampio anti-tumorale e anti-infettivi. 1 La maggior parte dei γδ cellule T nel sangue periferico hanno il recettore delle cellule T Vγ9Vδ2. Queste cellule riconoscono l'antigene in un complesso maggiore di istocompatibilità modalità indipendente e sviluppare una forte funzioni citolitica e Th1-come effettore. 1 Perciò, γδ cellule T sono cellule effettrici candidato attraente per l'immunoterapia del cancro. Vγ9Vδ2 cellule T rispondere a phosphoantigens come (E)-4-idrossi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), che è sintetizzata nei batteri attraverso isoprenoidi biosintesi, 2 e isopentenil pirofosfato (IPP), che viene prodotto nelle cellule eucariotiche attraverso la via mevalonato. 3 In condizioni fisiologiche, la generazione di IPP ​​nella cella nontransformed non è sufficiente per l'attivazione delle cellule T γδ. Disregolazione della via mevalonato nelle cellule tumorali porta all'accumulo di IPP ​​e l'attivazione delle cellule T γδ. 3 Poiché aminobifosfonati (come pamidronato o zoledronato) inibiscono la farnesil pirofosfato sintasi (FPP), l'enzima agisce a valle di IPP ​​nella via mevalonato, i livelli intracellulari di IPP e sensitibity γδ per il riconoscimento delle cellule T possono essere terapeuticamente aumentato di aminobifosfonati. IPP accumulo è meno efficiente in cellule nontransfomred rispetto alle cellule tumorali con una concentrazione farmacologicamente rilevanti aminobifosfonati, che ci permettono l'immunoterapia per il cancro attivando γδ cellule T con aminobifosfonati 4. Interessante, IPP si accumula nei monociti quando PBMC sono trattati con aminobifosfonati, a causa di efficienti assunzione di droghe da queste cellule 5. monociti che si accumulano IPP diventare cellule presentanti l'antigene e stimolare Vγ9Vδ2 cellule T nel sangue periferico. 6 Sulla base di questi meccanismi, abbiamo sviluppato una tecnica per la grande espansione del γδ colture di cellule T con zoledronato e interleuchina -2 (IL-2). 7 Altri metodi per l'espansione delle cellule T γδ utilizzare il sintetico pirofosfato bromohydrin phosphoantigens (BrHPP) 8 o 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) 9. Tutti questi metodi consentono ex vivo di espansione, con conseguente gran numero di γδ cellule T per l'uso in immunoterapia adottiva. Tuttavia, solo zoledronato è un reagente approvato dalla FDA disponibili in commercio. Zoledronato espanso γδ cellule T CD27 schermo - CD45RA - fenotipo effettore memoria e la loro funzione può essere valutata da IFN-γ test di produzione 7.

Protocol

1. Isolamento dei PBMC

  1. Prelievo di sangue (7,5-8,0 ml) in una provetta BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio. Il tubo contiene un anticoagulante eparina sodica e di un Ficoll-Hypaque densità del fluido, più una barriera di gel di poliestere, che separa i due liquidi. Centrifuga tubo / campione di sangue a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) in un rotore orizzontale (swing-out testa) per 20 minuti a 1800 x g. Interruttore centrifuga freni sbloccati.
  2. Dopo la centrifugazione, la sequenza di strati avviene nel seguente modo (visto dall'alto verso il basso): a) al plasma - b) le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) granulociti - f) globuli rossi (Fig. 1).
  3. Raccolgono una frazione dello strato di plasma, lasciando 5 a 10 mm di plasma al di sopra della interfase senza disturbare lo strato di cellule. Il plasma può essere utilizzato per la cultura (sezione 2.5).
  4. Raccolta della frazione arricchita (PBMC) presso l'interfase con una pipetta e trasferirli in un tubo da 15 ml.
  5. Lavare i PBMC con 10 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS), invertendo il tubo di 5 volte, quindi si centrifuga per 5 min a 400 x g.
  6. Ripetere le fasi di lavaggio due volte, quindi risospendere il pellet cellulare in 5 ml di PBS. Determinare il numero delle cellule. Di solito 1,3 x10 6 celle vengono recuperati da 1 ml di sangue intero.
  7. Determinare la frequenza e il fenotipo delle cellule T in γδ PBMC mediante citometria di flusso (sezione 3) (Fig. 2).

2. Espansione di cellule T γδ

  1. Centrifuga sospensioni cellulari in provette da 15 ml conica per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente, ed eliminare il surnatante.
  2. Preparare terreno di coltura (CM) con l'aggiunta di IL-2 (IL-2) e zoledronato (Zometa) a concentrazioni finali di 1000 UI / ml e 5 mM, rispettivamente. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) o OpTmizer (Invitrogen) supportare l'espansione dei media buona γδ cellule T (maggiori informazioni nei riferimenti 6 e 9). Zometa è fornito in forma liquida (4 fiala mg/5-ml). Per preparare una soluzione al 5 mM, aggiungere 50 ml di Zometa a 30 ml di terreno di coltura.
  3. Risospendere il pellet di cellule in terreno di coltura e regolare a 1x10 6 cellule / ml.
  4. Pipettare 1 ml di CM contenente 1x10 6 cellule in ciascun pozzetto di una 24-pozzetti. Per le grandi culture, le cellule possono essere seminati a 0,5 x 10 6 cellule / cm 2 secondo le superfici dei pozzi piatto, piatto, o borraccia.
  5. Aggiungi plasma autologo (sezione 1.3), pool umano AB sieri, o FCS in modo che sia circa il 10% del volume della cultura (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti). Posizionare le piastre in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 24-48 ore.
  6. Mantenere la coltura ad una densità cellulare di 0,5-2 x 10 6 cellule / ml. Aggiungi terreno fresco contenente umano IL-2 (1000 UI / ml) (senza Zometa) ogni 2-3 giorni, e trasferire cellule coltivate in nuovi pozzi o fiaschi, se necessario, a seconda del grado di proliferazione cellulare (Fig. 3). Fornitura plasma o siero al mezzo in modo che la concentrazione sierica può essere mantenuto almeno l'1%.
  7. Celle di raccolta il giorno 12-14 e determinare la, fenotipo frequenza, e le funzioni del γδ cellule T mediante citometria di flusso (vedi sotto).

3. L'analisi fenotipica mediante citometria di flusso

  1. Trasferire 200 campioni microlitri contenente 2 x 10 5 cellule a fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) tubi.
  2. Aggiungere 2 ml di PBS freddo e centrifugare per 5 min a 400 x gr. Poi, risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer FACS (PBS + 1% di sodio azide FCS + 0,1%). Aggiungere 5 ml di ciascuna anticorpi ai campioni (gli anticorpi monoclonali sono elencati nella Tabella 1).
  3. Incubare in ghiaccio al buio per 20 min.
  4. Aggiungere 2 ml di tampone FACS per ogni campione, e poi vortice. Campioni Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 ° C. Con attenzione decantare il surnatante.
  5. Risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer FACS e vortice. Analizzare campioni su un citofluorimetro (Fig. 2).

4. IFN-γ saggio produzione 10

  1. Il giorno prima del test, preparare le cellule stimolatore di coltura 3-5 x10 Daudi 5 cellule / ml in RPMI 1640 medium più 10% FCS (RPMI-10) durante la notte con Zometa (5 mM) (nel seguito denominati Z-Daudi).
  2. Raccogliere Z-Daudi e risospendere in RPMI-10 a 2x10 6 cellule / ml. Aggiungere 100 ml di Z-Daudi (2x10 5) a ciascun pozzetto di una piastra a fondo rotondo da 96 pozzetti.
  3. Preparare γδ cellule T a 2x10 6 cellule / ml in RPMI-10 contenente Brefeldin A a 20 mg / ml. Trasferire 100 ml di γδ sospensione cellulare T (2x10 5) in ciascun pozzetto contenente Z-Daudi cellule o di pozzetti di controllo (100 ml di RPMI-10 solo, o RPMI-10 con 20 ng / ml di forbolo miristato 12-13-acetato[PMA] e 2 mg / ml di ionomicina).
  4. Mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Incubare per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
  5. Centrifugare la piastra per 5 minuti a 400 x g a 4 ° C e risospendere il pellet in 200 ml di PBS freddo.
  6. Trasferire i campioni di tubi FACS. Aggiungere 4 ml di PBS freddo e centrifugare le provette per 5 min a 400 x g a 4 ° C.
  7. Risospendere il pellet in 50 ml di buffer di FACS con FITC-coniugato anti-TCRVγ9 (5 mL) e PE/Cy5-conjugated anti-CD3 (2,5 microlitri). Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente.
  8. Aggiungere 100 ml di reagente IntraPrep 1 e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente.
  9. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e aggiungere 100 ml di reagente 2 IntraPrep. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente senza agitazione.
  10. Aggiungere 5 ml di PE-coniugato anti-IFN-γ mAb alla provetta. Incubare al riparo dalla luce per 15 minuti a temperatura ambiente.
  11. Aggiungere 4 ml di PBS in ogni provetta e centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di tampone FACS.
  12. Analizzare le cellule citofluorimetro. Porta il CD3 + + TCRVγ9 cellule ed esaminare l'espressione di IFN-γ (Fig. 4).

5. Rappresentante dei risultati:

E 'importante per determinare la percentuale di cellule T nel γδ PBMC all'inizio della cultura. Come mostrato in fig. 2 A, la percentuale dei CD3 + + TCRVγ9 γδ cellule T in PBMC è stata di 1,6% al giorno 0. Le popolazioni dominanti erano CD45RA + CD27 + CD27 + ingenuo o CD45RA - fenotipi memoria centrale. Quando γδ cellule T sono stati stimolati in modo efficiente, hanno formato grappoli nei giorni 3-5 (Fig. 3 A e B). Quando la formazione di cluster è stato ritardato, la crescita di altri tipi cellulari, quali CD4 + e CD8 + cellule T αβ o cellule NK potrebbe dominare la crescita di γδ cellule T (fig. 3 C e D). Dopo 14 giorni di cultura, la frequenza di cellule T γδ aumentato a oltre il 93,8% delle cellule coltivate in successo culture γδ cellule T (Fig. 2 E). Le colture di cellule T γδ upregulated NKG2D e CD69 espressione (fig. 2 G e H). Hanno mostrato CD27 - CD45RA - fenotipo memoria effettore (Fig. 2 F). Le funzioni di γδ cellule T sono stati valutati per quanto riguarda la produzione di citochine e citotossicità. L'IFN-γ intracellulare colorazione γδ dimostrato che le cellule T prodotte IFN-γ in risposta alla PMA / ionomicina trattamento o Z-Daudi cellule che IPP accumulato dopo il trattamento con zoledronato (Fig. 4). Questi risultati indicano che zoledronato può efficacemente stimolare e ampliare funzionale delle cellule T γδ.

tubo FITC PE ECD PE/Cy5
1 CD3 CD19 CD45 CD14
2 CD3 TCRαβ CD4 CD8
3 CD3 CD56
4 TCR Vγ9 TCRαβ CD45 CD3
5 TCR Vγ9 NKG2D
6 TCR Vγ9 CD69
7 TCR Vγ9 del mouse IgG1
8 TCR Vγ9 CD45RA CD27
9 TCR Vγ9 del mouse IgG1 del mouse IgG1

Tabella 1. Anticorpi monoclonali utilizzati in colorazione multicolore delle cellule T γδ. Un esempio di analisi fenotipica di cellule T γδ eseguiti nel nostro laboratorio è mostrato in fig. 2.

Figura 1
Figura 1. Separazione dei PBMC. Sangue (7,5-8,0 ml) è disegnato in un tubo BD Preparazione Vacutainer cella CPT con eparina di sodio e direttamente centrifugati per 20 min a 1800 x g. Dopo la centrifugazione, gli strati risultante come si è visto da cima a bottom: a) al plasma - b) PBMC e piastrine - c) soluzione di densità - d) gel poliestere - e) Granulociti - f) i globuli rossi.

Figura 2
Figura 2. Fenotipo superficie tipica delle cellule T γδ. PBMC sono stati stimolati con zoledronato e IL-2 per 14 giorni. Le cellule sono state colorate con FITC anti-TCR Vγ9 e PE/Cy5-labeled anti-CD3 di monitorare l'espansione della γδ cellule T (A ed E). γδ cellule T sono stati identificati dalla loro espressione di TCRVγ9, e la loro espressione di CD27 e CD45RA (B e F), NKG2D (C e G), o CD69 (D e H) è stata esaminata.

Figura 3
Figura 3. Rappresentante γδ colture di cellule T. PBMC sono stati stimolati con IL-2 (1000 UI / ml) e zoledronato (5 mM). Campi rappresentativi sono visibili (IX71 microscopio invertito [Olympus] x 200). Cluster e aggregati di cellule T γδ può essere osservato il giorno 3 (A) e il giorno 5 (B), quando γδ cellule T sono state espanse con successo. Al contrario, nessun cluster o aggregati sono stati osservati quando γδ crescita delle cellule T non era adeguata (C e D).

Figura 4
Figura 4. IFN-γ produzione. γδ cellule T sono state incubate con RPMI-10 solo (A) o PMA / ionomicina (B) o Z-Daudi (C) per 4 ore. In primo luogo, espressione di superficie di TCRVγ9 era macchiato e poi IFN-γ produzione è stata esaminata dal intracellulare IFN-γ colorazione.

Figura 5
Figura 5. Cinetica di γδ colture cellulari T. (A) il numero assoluto di cellule in coltura, (B) percentuale di γδ cellule T, e (C) numero assoluto di γδ cellule T nei punti di tempo indicato.

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Discussion

Il metodo presentato qui permette l'espansione delle cellule T efficiente γδ da PBMC. γδ cellule T attivate e ampliato da zoledronato e IL-2 sviluppano completa funzioni effettrici, riflessa dalla produzione di citochine e citotossicità. E 'stato riportato che il sintetico phosphoantigens pirofosfato bromohydrin (BrHPP) e 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfato (2M3B1PP) anche espandere le cellule T γδ, tuttavia, non sono disponibili in commercio. Al contrario, zoledronato è già concesso in licenza per le applicazioni cliniche di Zometa. Pertanto, un reagente affidabile è facilmente disponibile.

La selezione dei terreni di coltura e siero è critica. Utilizzare terreni di coltura appropriati come ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) o OpTmizer (Invitrogen) per il successo di espansione delle cellule T γδ. 11 Verificare che il plasma autologo, pool umano AB sieri o FCS in grado di supportare γδ cultura T cellulare. Ricordate anche che PBMC da alcuni donatori non rispondono alla stimolazione zoledronato indipendentemente reagenti altra cultura. Se ciò accade, l'unica opzione è quella di cambiare il donatore.

Come abbiamo dimostrato, l'arricchimento di γδ cellule T è stato raggiunto relativamente presto, quasi l'80% delle cellule in coltura sono state γδ cellule T di giorno 7. γδ cellule T hanno continuato a proliferare fino a 12-14 giorni (Fig. 5). Circa 2,2 x 10 8 cellule γδ T può essere ottenuto da 1 x 10 6
PBMC contenente 1,6 x 10 4 γδ cellule T. Questo metodo di coltura è stato utilizzato in fase I trial clinici che hanno valutato la sicurezza e la fattibilità di Zoledronato espanso terapia γδ trasferimento delle cellule T nei pazienti con mieloma multiplo o cancro ai polmoni. 12,13

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZOMETA Novartis AG zoledronate
PROLEUKIN Novartis AG human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD Biosciences 362753
RPMI1640 Invitrogen 21870-076
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7
OpTmizer Invitrogen 0080022SA
brefeldin A Sigma-Aldrich B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585-1MG
ionomycin Sigma-Aldrich 13909-1ML
IntraPrep Beckman Coulter Inc. A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD Beckman Coulter Inc. 6604727
anti-human CD8-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607011
anti-human CD14-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07765
anti-human CD19-PE Beckman Coulter Inc. A07769
anti-human CD45-ECD Beckman Coulter Inc. A07784
anti-human CD56-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07789
anti-human TCRαβ-PE Beckman Coulter Inc. A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC Beckman Coulter Inc. IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607107
anti-human CD45RA-ECD Beckman Coulter Inc. IM2711
anti-human CD69-PE BD Biosciences 555531
anti-human NKG2D-PE Beckman Coulter Inc. A08934
Anti-humal IFNγ-PE Beckman Coulter Inc. IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE Beckman Coulter Inc. A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07797A07798

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References

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