Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Immunology and Infection

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Summary

Eine Methode, um γδ T-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) erweitern wird beschrieben. PBMC-derived γδ T-Zellen stimuliert und erweitert mit Zoledronat und Interleukin-2 (IL-2). Großräumige Ausdehnung der γδ T-Zellen können zur autologen zellulären Immuntherapie von Krebs angewendet werden.

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Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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Abstract

Menschliche γδ T-Zellen erkennen und reagieren auf eine Vielzahl von Stress-induzierte Antigene, wodurch die Entwicklung angeborenen breiten Anti-Tumor-und anti-infektiösen Aktivität. 1 Die Mehrheit der γδ T-Zellen im peripheren Blut haben die Vγ9Vδ2 T-Zell-Rezeptor. Diese Zellen erkennen Antigen in einer Haupthistokompatibilitätskomplex-unabhängige Art und Weise und zu entwickeln starke zytolytischer und Th1-like Effektor-Funktionen. 1 Darum sind γδ T-Zellen attraktiven Kandidaten Effektorzellen zur Immuntherapie von Krebs. Vγ9Vδ2 T-Zellen zu phosphoantigens wie reagieren (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), die in Bakterien über Isoprenoidbiosynthese synthetisiert wird; 2 und Isopentenylpyrophosphat (IPP), das hergestellt wird in eukaryotischen Zellen durch die Mevalonatweges. 3 In physiologischer Zustand, ist die Erzeugung von IPP in transformierten Zellen nicht ausreichend für die Aktivierung von γδ T-Zellen. Dysregulation des Mevalonat-Weg in Tumorzellen führt zu einer Akkumulation von IPP und γδ T-Zellen-Aktivierung. 3 Weil Aminobisphosphonate (wie Pamidronat oder Zoledronat) hemmen Farnesylpyrophosphat Synthase (FPP), das Enzym wirkt hinter IPP in der Mevalonat-Weg, intrazellulären IPP und sensitibity auf γδ T-Zellen Anerkennung kann therapeutisch durch Aminobisphosphonate erhöht werden. IPP Akkumulation ist weniger effizient in nontransfomred Zellen als Tumorzellen mit einem pharmakologisch relevante Konzentration von Aminobisphosphonate, die es uns ermöglichen Immuntherapie gegen Krebs durch Aktivierung γδ T-Zellen mit Aminobisphosphonate. 4 Interessanterweise, IPP in Monozyten ansammelt, wenn PBMC mit Aminobisphosphonate behandelt werden, weil der effizienten Drogen-Aufnahme durch die Zellen. 5 Monozyten, die IPP zu akkumulieren Antigen-präsentierenden Zellen und stimulieren Vγ9Vδ2 T-Zellen im peripheren Blut. 6 auf diese Mechanismen, entwickelten wir eine Technik, die für eine groß angelegte Ausbau des γδ T-Zell-Kulturen mit Zoledronat und Interleukin -2 (IL-2). 7 Andere Methoden zur Erweiterung der γδ T-Zellen nutzen die synthetische phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) 8 oder 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP). 9 Alle diese Methoden ex ermöglichen vivo Expansion, die sich in einer großen Anzahl von γδ T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie. Allerdings ist nur Zoledronat eine FDA-Zulassung im Handel erhältlichen Reagenz. Zoledronat-expanded γδ T-Zellen-Display CD27 - CD45RA - Effektor-Memory-Phänotyp und ihre Funktion kann durch IFN-γ Produktion Assay 7 ausgewertet werden.

Protocol

1. Isolierung von PBMC

  1. Draw Blut (7,5 bis 8,0 ml) in einen BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin. Die Röhre enthält eine Natrium-Heparin als Antikoagulans und eine Ficoll-Hypaque Dichte Flüssigkeit, plus ein Polyester-Gel-Schranke, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt. Zentrifugenröhrchen / Blutprobe bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) in einer horizontalen Rotor (swing-out Kopf) für 20 min bei 1800 x g. Schalten Zentrifuge bremst ab.
  2. Nach der Zentrifugation erfolgt die Reihenfolge der Schichten wie folgt (gesehen von oben nach unten): a) Plasma - b) periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und Thrombozyten - c) Dichte Lösung - d) Polyester Gel - e) Granulozyten - f) roten Blutkörperchen (Abb. 1).
  3. Sammeln Sie nur einen Bruchteil der Plasmaschicht, so dass 5 bis 10 mm von Plasma oberhalb der Interphase, ohne die Zellschicht. Das Plasma kann für die Kultur (Abschnitt 2.5) verwendet werden.
  4. Ernte der angereicherten Fraktion (PBMC) in der Interphase mit einer Pipette aufnehmen und in 15 ml konischen Rohr.
  5. Waschen Sie die PBMC mit 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), durch Invertieren des Röhrchens 5 mal und dann 5 min bei 400 x g zentrifugieren.
  6. Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal, und dann Zellpellet in 5 ml PBS. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen. In der Regel 1,3 x10 6 Zellen sind von 1 ml Vollblut gewonnen.
  7. Bestimmen Sie die Frequenz und Phänotyp der γδ T-Zellen in PBMC mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 3) (Abb. 2).

2. Expansion von γδ T-Zellen

  1. Centrifuge Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie die Überstände.
  2. Bereiten Kulturmedium (CM) durch Zugabe von humanem IL-2 (IL-2) und Zoledronat (Zometa), um Endkonzentrationen von 1000 IU / ml und 5 um beträgt. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) oder OpTmizer (Invitrogen) Medien unterstützen eine gute Erweiterung des γδ T-Zellen (weitere Informationen in den Referenzen 6 und 9). Zometa wird in flüssiger Form (4 mg/5-ml Durchstechflasche) zur Verfügung gestellt. Zur Herstellung eines 5 uM Lösung, mit 50 ul von Zometa um 30 ml Kulturmedium.
  3. Resuspendieren Zellpellet in Kulturmedium und passen zu 1x10 6 Zellen / ml.
  4. Pipettieren von 1 ml CM mit 1x10 6 Zellen in jedes Well einer 24-Well-Platte. Für großflächige Kulturen, können die Zellen auf 0,5 x 10 6 Zellen / cm ausgesät werden 2 nach den Flächen der Platte Brunnen, Schüssel oder Flasche.
  5. Add autologem Plasma (Abschnitt 1.3), gepoolten menschlichen AB sera oder FCS, so dass es etwa 10% des Volumens der Kultur (100 ul pro Well einer 24-Well-Platte) ist. Legen Sie die Platten in einem befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für 24-48 Std.
  6. Pflegen Sie die Kultur mit einer Zelldichte von 0,5-2 x 10 6 Zellen / ml. Fügen Sie frisches Medium mit humanem IL-2 (1000 IU / ml) nur (ohne Zometa) alle 2-3 Tage und Transfer kultivierten Zellen in neue Brunnen oder Flaschen wie nötig, je nach dem Grad der Zellproliferation (Abb. 3). Versorgung Plasma oder Serum, das Medium, so dass die Konzentration im Serum beibehalten werden mindestens 1% betragen.
  7. Ernten Sie die Zellen am Tag 12-14 und die Frequenz bestimmen, Phänotyp und Funktion der γδ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie (siehe unten).

3. Phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie

  1. Transfer-200 ul Proben mit 2 x 10 5 Zellen zur Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) Röhren.
  2. 2 ml kaltem PBS und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g. Dann, das Sediment resuspendieren in 50 ul FACS Puffer (PBS + 1% FCS + 0,1% Natriumazid). Add 5 ul jeder Antikörper an die Proben (die monoklonalen Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt).
  3. Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 20 min.
  4. 2 ml FACS-Puffer zu jeder Probe und dann Wirbel. Centrifuge Proben für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C. Überstand vorsichtig dekantieren.
  5. Resuspendieren der Zellen in 300 ul FACS-Puffer und vortexen. Analysieren Sie die Proben an einem Durchflusszytometer (Abb. 2).

4. IFN-γ Produktion Assay 10

  1. Der Tag vor dem Test, bereiten Stimulatorzellen durch Kultivierung von 3-5 x10 5 Daudi Zellen / ml in RPMI 1640-Medium plus 10% FCS (RPMI-10) über Nacht mit Zometa (5 pM) (im Folgenden bezeichnet Z-Daudi).
  2. Sammeln Z-Daudi und resuspendieren in RPMI-10 bei 2x10 6 Zellen / ml. 100 l von Z-Daudi (2x10 5) in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte.
  3. Bereiten γδ T-Zellen bei 2x10 6 Zellen / ml in RPMI-10 mit Brefeldin A bei 20 pg / ml. Transfer 100 ul der γδ T-Zell-Suspension (2x10 5) in jede Vertiefung mit Z-Daudi-Zellen oder in Vertiefungen (100 ul RPMI-10 nur oder RPMI-10 mit 20 ng / ml Phorbol 12-myristat 13-Acetat-Steuerung[PMA] plus 2 pg / ml Ionomycin).
  4. Mix von Auf-und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 4 h in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator.
  5. Zentrifugieren Sie die Platte für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C und Resuspendieren der Pellets in 200 ul kaltem PBS.
  6. Übertragen Sie die Proben auf FACS-Röhrchen. 4 ml kaltem PBS und Zentrifugieren für 5 min bei 400 x g bei 4 ° C.
  7. Resuspendieren der Pellets in 50 ul FACS-Puffer mit FITC-konjugierten Anti-TCRVγ9 (5 ul) und PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 ul). Inkubieren von Licht für 15 min bei Raumtemperatur geschützt.
  8. 100 l von IntraPrep Reagenz 1 und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. 4 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur.
  9. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und 100 ul der IntraPrep Reagenz 2. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln.
  10. Add 5 ul PE-konjugierten anti-IFN-γ mAk in das Reagenzglas. Inkubieren von Licht für 15 min bei Raumtemperatur geschützt.
  11. 4 ml PBS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und Zellpellet in 0,5 ml FACS-Puffer.
  12. Analysieren Sie die Zellen durch Durchflusszytometer. Gate auf CD3 + TCRVγ9 + Zellen und untersuchen die Expression von IFN-γ (Abb. 4).

5. Repräsentative Ergebnisse:

Es ist wichtig, den Anteil der γδ T-Zellen in PBMC zu Beginn der Kultur bestimmen. Wie in Abb.. 2 A, der Anteil der CD3 + TCRVγ9 + γδ T-Zellen in PBMC lag bei 1,6% am Tag 0. Die dominierende Populationen wurden CD27 + CD45RA + CD27 + naiven oder CD45RA - zentraler Speicher Phänotypen. Wenn γδ T-Zellen effizient stimuliert wurden, bildeten sie sich zu Clustern an den Tagen 3-5 (Abb. 3 A und B). Als Cluster-Bildung verzögert wurde, das Wachstum von anderen Zelltypen, wie zB CD4 + oder CD8 + αβ T-Zellen oder NK-Zellen das Wachstum von γδ T-Zellen (Abb. 3 C und D) zu dominieren. Nach 14 Tagen der Kultur, nahm die Häufigkeit der γδ T-Zellen um mehr als 93,8% der kultivierten Zellen in erfolgreiche γδ T-Zell-Kulturen (Abb. 2 E). Die kultivierten γδ T-Zellen hochreguliert NKG2D und CD69 Expression (Abb. 2 G und H). Sie zeigten CD27 - CD45RA - Effektor-Memory-Phänotyp (Abb. 2 F). Die Funktionen der γδ T-Zellen wurden im Hinblick auf die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität untersucht. Die intrazelluläre IFN-γ Färbung zeigte, dass γδ T-Zellen IFN-γ produziert als Reaktion auf PMA / Ionomycin Behandlung oder Z-Daudi-Zellen, die summiert IPP nach Zoledronat-Behandlung (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass Zoledronat effizient stimulieren und zu erweitern funktionale γδ T-Zellen.

Rohr FITC PE ECD PE/Cy5
1 CD3 CD19 CD45 CD14
2 CD3 TCRαβ CD4 CD8
3 CD3 CD56
4 TCR Vγ9 TCRαβ CD45 CD3
5 TCR Vγ9 NKG2D
6 TCR Vγ9 CD69
7 TCR Vγ9 Maus IgG1
8 TCR Vγ9 CD45RA CD27
9 TCR Vγ9 Maus IgG1 Maus IgG1

Tabelle 1. Monoklonale Antikörper in multicolor Färbung von γδ T-Zellen verwendet. Ein Beispiel für die phänotypische Analyse von γδ T-Zellen in unserem Labor durchgeführt ist in Abb.. 2.

Abbildung 1
Abbildung 1. Separation von PBMC. Blood (7,5 bis 8,0 ml) wird in eine BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin gezogen und direkt für 20 min bei 1800 x g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation der resultierenden Schichten von oben nach bo gesehenttom: a) Plasma - b) PBMC und Thrombozyten - c) Dichte Lösung - d) Polyester Gel - e) Granulozyten - f) Rote Blutkörperchen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Typische Oberfläche Phänotyp der γδ T-Zellen. PBMC wurden mit Zoledronat und IL-2 für 14 Tage stimuliert. Die Zellen wurden mit FITC-markiertem anti-TCR Vγ9 und PE/Cy5-labeled anti-CD3, um den Ausbau der γδ T-Zellen (A und E) zu überwachen. γδ T-Zellen wurden durch ihre Expression von TCRVγ9 identifiziert und ihre Expression von CD27 und CD45RA (B und F), NKG2D (C und G) oder CD69 (D und H) wurde untersucht.

Abbildung 3
Abbildung 3. Representative γδ T-Zell-Kulturen. PBMC wurden mit IL-2 (1000 IU / ml) und Zoledronat (5 pM) stimuliert. Vertreter Felder angezeigt werden (inverse Mikroskop IX71 [Olympus] x 200). Cluster und Aggregate von γδ T-Zellen können am Tag 3 (A) und Tag 5 (B), wenn γδ T-Zellen wurden erfolgreich ausgebaut beobachtet werden. Im Gegensatz dazu waren keine Cluster oder Aggregate beobachtet werden, wenn γδ T-Zell-Wachstum war nicht ausreichend (C und D).

Abbildung 4
Abbildung 4. IFN-γ Produktion. γδ T-Zellen wurden mit RPMI-10 nur (A) oder PMA / Ionomycin (B) oder Z-Daudi (C) für 4 h inkubiert. Zunächst wurde die Oberflächenexpression von TCRVγ9 gefärbt und dann IFN-γ Produktion wurde durch intrazelluläre IFN-γ Färbung untersucht.

Abbildung 5
Abbildung 5. Kinetik der γδ T-Zell-Kultur. (A) Absolute Zahl der kultivierten Zellen, (B) Anteil der γδ T-Zellen und (C) absolute Anzahl der γδ T-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten.

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Discussion

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine effiziente Erweiterung der γδ T-Zellen aus PBMC. γδ T-Zellen aktiviert und durch Zoledronat erweitert und IL-2 entwickeln komplette Effektor-Funktionen, durch die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität wider. Es wurde berichtet, dass die synthetischen phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) und 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP) auch erweitern γδ T-Zellen, jedoch sind sie nicht im Handel erhältlich. Im Gegensatz dazu ist Zoledronat bereits für klinische Anwendungen als Zometa lizenziert. Daher ist ein zuverlässiges Reagenz leicht zugänglich.

Die Auswahl von Kulturmedien und Serum ist kritisch. Verwenden Sie geeignete Kulturmedien wie ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) oder OpTmizer (Invitrogen) für eine erfolgreiche γδ T-Zell-Expansion. 11 Überprüfen Sie, dass autologe Plasma können gepoolten menschlichen AB Seren oder FCS Unterstützung γδ T-Zell-Kultur. Denken Sie auch daran, dass PBMC von einigen Spendern zu Zoledronat Stimulation unabhängig von anderen Kultur-Reagenzien nicht ansprechen. Wenn das passiert, ist die einzige Möglichkeit für den Spender zu ändern.

Wie wir gezeigt haben, war die Anreicherung von γδ T-Zellen relativ früh erreicht, fast 80% der kultivierten Zellen wurden γδ T-Zellen an Tag 7. γδ T-Zellen weiter zu vermehren bis zu 12-14 Tage (Abb. 5). Ca. 2,2 x 10 8 γδ T-Zellen können aus 1 x 10 6 erhältlich
PBMC mit 1,6 x 10 4 γδ T-Zellen. Diese Kultur-Methode hat in Phase I der klinischen Studien eingesetzt zur Untersuchung der Sicherheit und Durchführbarkeit von Zoledronat-expanded γδ T-Zell-Transfer-Therapie bei Patienten mit multiplem Myelom oder Lungenkrebs. 12,13

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZOMETA Novartis AG zoledronate
PROLEUKIN Novartis AG human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD Biosciences 362753
RPMI1640 Invitrogen 21870-076
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7
OpTmizer Invitrogen 0080022SA
brefeldin A Sigma-Aldrich B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585-1MG
ionomycin Sigma-Aldrich 13909-1ML
IntraPrep Beckman Coulter Inc. A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD Beckman Coulter Inc. 6604727
anti-human CD8-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607011
anti-human CD14-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07765
anti-human CD19-PE Beckman Coulter Inc. A07769
anti-human CD45-ECD Beckman Coulter Inc. A07784
anti-human CD56-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07789
anti-human TCRαβ-PE Beckman Coulter Inc. A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC Beckman Coulter Inc. IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607107
anti-human CD45RA-ECD Beckman Coulter Inc. IM2711
anti-human CD69-PE BD Biosciences 555531
anti-human NKG2D-PE Beckman Coulter Inc. A08934
Anti-humal IFNγ-PE Beckman Coulter Inc. IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE Beckman Coulter Inc. A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07797A07798

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References

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