ゾレドロネートを使用してヒト末梢血γδT細胞の拡大

Immunology and Infection

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Summary

末梢血単核細胞(PBMC)からのγδT細胞を拡大する方法が記載されている。 PBMC由来のγδT細胞を刺激し、ゾレドロネートとインターロイキン-2(IL - 2)を使用して展開されます。 γδT細胞の大規模の拡大は、癌の自家細胞免疫療法に適用することができます。

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Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

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Abstract

人間のγδT細胞が認識し、ストレス誘発抗原のさまざまに反応する、それによって生来の広範な抗腫瘍および抗感染活動を展開することができます。末梢血中のγδT細胞の1大多数がVγ9Vδ2T細胞受容体を持っている。これらの細胞は主要組織適合性複合体に依存しない方法で抗原を認識し、強力な細胞傷害性とTh1細胞のようなエフェクター機能を開発する。1したがって、γδT細胞は、癌免疫療法のための魅力的な候補エフェクター細胞である。 Vγ9Vδ2T細胞は、次のようなphosphoantigensに対応する(E)-4 -ヒドロキシ-3 -メチル-ブト-2 -エニルピロリン酸(HMBPP)、イソプレノイド生合成を介して細菌で合成され、生成される2、イソペンテニルピロリン酸(IPP)、メバロン ​​酸経路を介して真核細胞で。生理的な状態で3、非形質転換細胞におけるIPPの世代は、γδT細胞の活性化のために十分ではありません。腫瘍細胞でのメバロン ​​酸経路の調節不全は、IPPの蓄積とγδT細胞の活性化につながる。3 aminobisphosphonatesが(そのようなパミドロネートまたはゾレドロネートなど)ファルネシルピロリン酸合成酵素(FPPS)、メバロン ​​酸経路でIPPの下流で作用する酵素の細胞内レベルを抑制するので、 IPPとγδT細胞の認識にsensitibityは、治療上aminobisphosphonates増加させることができる。 IPPの蓄積は私たちにaminobisphosphonatesとγδT細胞を活性化することによって、癌の免疫療法を可能にすること、aminobisphosphonatesの薬理学的に関連する濃度で腫瘍細胞よりもnontransfomred細胞に効率的ではありません。おもしろい4 PBMCがaminobisphosphonatesで処理されるとき、IPPのために効率的で、単球に蓄積これらの細胞による薬物取り込み。IPPとなる抗原提示細胞を蓄積し、末梢血でVγ9Vδ2T細胞を刺激する5単球6これらのメカニズムに基づいて、我々は、ゾレドロネートおよびインターロイキンを使用して、γδT細胞培養物の大規模展開のための技術を開発-2(IL - 2)。γδT細胞の拡大のための7他の方法は、合成phosphoantigensのブロモヒドリンピロリン酸(BrHPP)8または2 -メチル-3 -ブテニル-1 -ピロリン酸(2M3B1PP)を利用する。これらのメソッドの9すべてがexを許可養子免疫療法における使用のためのγδT細胞の多数の結果in vivoでの展開、。ただし、ゾレドロネートがFDA承認された市販の試薬です。ゾレドロネート-拡張されたγδT細胞はCD27を表示- CD45RA -エフェクターメモリー表現型とそれらの機能は、IFN -γ産生アッセイによって評価することができる7。

Protocol

1。 PBMCの分離

  1. ヘパリンナトリウムでBDバキュテイナCPTの細胞調製チューブへの血液(7.5〜8.0ミリリットル)を描く。チューブはヘパリンナトリウム抗凝固剤とフィコール- Hypaque密度流体、および2つの液体を分離するポリエステルゲル障壁を、含まれています。 1800 × gで20分間水平ローター(スイングアウトの頭)で、室温(18℃〜25℃)でチューブ/血液サンプルを遠心分離します。ブレーキをオフ遠心切り替えます。
  2. 遠心後、レイヤーの順序は、(上から下まで見て)次のように行われます。)プラズマ - b)の末梢血単核細胞(PBMC)および血小板 - c)の密度のソリューション - D)ポリエステルゲル - E)、顆粒球 - F)赤血球( 図1)。
  3. 細胞層を乱すことなく、相間上記プラズマの5〜10 mmを残して、プラズマ層の​​割合を収集する。プラズマは、文化(セクション2.5)に使用することができます。
  4. ピペットと15 mlのコニカルチューブに移すとの相間で濃縮分画(PBMC)を回収する。
  5. 5回チューブを反転させ、生理食塩水(PBS)リン酸緩衝し、400 × gで5分間遠心操作して、10mlでPBMCを洗ってください。
  6. 二回の洗浄ステップを繰り返し、次にPBS 5 mlに細胞ペレットを再懸濁します。細胞数を決定します。通常1.3 × 10 6細胞を全血1 mlのから回収されています。
  7. フローサイトメトリー(セクション3)( 図2)でPBMCにおけるγδT細胞の頻度と表現型を決定します。

2。 γδT細胞の拡大

  1. 室温で400 × gで5分間、15 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。
  2. それぞれ、1000 IU / mlおよび5μMの最終濃度にヒトIL - 2(IL - 2)とゾレドロネート(ゾメタ)を追加することにより、培養液(CM)を準備する。 ALyS203(細胞科学技術研究所)またはOpTmizer(Invitrogen社)のメディアは、γδT細胞(参照6〜9の詳しい情報)の良好な拡張をサポートしています。ゾメタは、液体形態(4 mg/5-mlバイアル)で提供されています。 5μM溶液を調製し、培養液30mlにゾメタの50μlを加える。
  3. 再懸 ​​濁し、培養液中の細胞ペレットと1 × 10 6細胞/ mlに調整します。
  4. 24ウェルプレートの各ウェルに1 × 10 6細胞を含むCMのピペットで1ミリリットル。大規模な文化のために、細胞はプレートのウェル、皿、またはフラスコの表面領域に応じて2 0.5 × 10 6細胞/ cmで播種することができます。
  5. それは文化のボリューム(24ウェルプレートの各ウェルに100μL)の約10%になるように自己血漿(セクション1.3)、プールしたヒトAB血清、またはFCSを追加。加湿37℃、5%CO 2 24〜48時間のためのインキュベーターでプレートを置きます。
  6. 0.5〜2 × 10 6細胞/ mlの細胞密度で培養を維持する。ヒトIL - 2のみ(1000 IU / ml)を(ゾメタなし)ごとに2〜3日を含む新鮮な培地を追加し、必要に応じて新しい井戸やフラスコに培養細胞を譲渡する、細胞増殖の程度( 図3)によると。供給血漿または血清中濃度が1%以上を維持できるように、培地に血清。
  7. 収穫の日12月14日で細胞や頻度、表現型、およびフローサイトメトリーにより、γδT細胞の機能を決定します(下記参照)。

3。フローサイトメトリーによる表現型解析

  1. 蛍光活性化細胞選別(FACS)のチューブに2 × 10 5細胞を含む200μlのサンプルを移す。
  2. 冷PBS 2 mlを加え、400 x gで5分間遠心します。その後、50μlのFACS緩衝液(PBS + 1%FCS + 0.1%アジ化ナトリウム)でペレットを懸濁します。サンプル(モノクローナル抗体は、表1にリストされている)に、各抗体の5μlを添加する。
  3. 20分間暗所で氷上でインキュベートする。
  4. 各サンプルに2 mlのFACS緩衝液を追加してから、渦。 4℃で400 × gで5分℃でサンプルを遠心上清を注意深くデカントする。
  5. 300μlのFACS緩衝液と渦で、細胞を再懸濁します。フローサイトメーター( 図2)上のサンプルを分析する。

4。 IFN -γ産生アッセイ10

  1. アッセイの前日、RPMI 1640培地+10%FCS(RPMI - 10)ゾメタ(5μM)(以下、Z - Daudiを指定)と一晩の培養を3から5 × 10 5 Daudi細胞/ mlで刺激細胞を準備する。
  2. 2 × 10 6細胞/ mlでRPMI - 10 Z -ダウディ再懸濁しますを収集する。丸底96ウェルプレートの各ウェルにZ -ダウディ(2 × 10 5)100μlを追加します。
  3. で20μg/ mlでブレフェルジンを含むRPMI - 10に2 × 10 6細胞/ mlでγδT細胞を準備します。各ウェルを含むZ - Daudi細胞にγδT細胞懸濁液(2 × 10 5)100μlを転送したり、井戸(のみRPMI - 10、またはホルボール12 -ミリステート13 -アセテートの20 ng / mlのとRPMI - 10の100μlを制御する[PMA]イオノマイシンのプラス2μg/ mlの)。
  4. 数回上下にピペッティングして混ぜる。 37℃、5%CO 2インキュベーターで4時間インキュベートする。
  5. 4℃で400 × gで5分間プレートを遠心し、冷PBS 200μlでペレットを懸濁します。
  6. FACSチューブへサンプルを移す。冷PBS 4 mlを加え、4℃で400 × gで5分間チューブを遠心℃に
  7. FITC結合抗TCRVγ9(5μl)をとPE/Cy5-conjugated抗CD3 mAb(2.5μl)を持つFACS緩衝液50μlにペレットを再懸濁します。室温で15分間遮光してインキュベートする。
  8. IntraPrepの試薬1の100μlを加え、室温で15分間インキュベートする。室温で400 × gで5分間、各チューブと遠心分離機にPBS 4 mlを加え。
  9. 吸引により上清を除き、IntraPrep試薬2の100μlを加える。振とうせずに室温で5分間インキュベートする。
  10. 試験管に、PE結合抗- IFN -γモノクローナル抗体の5μlを添加する。室温で15分間遮光してインキュベートする。
  11. 室温で400 × gで5分間、各チューブと遠心分離機にPBS 4 mlを加え。吸引により上清を除去し、FACS緩衝液0.5 mlに細胞ペレットを再懸濁します。
  12. フローサイトメーターで細胞を分析する。 CD3 +TCRVγ9+細胞のゲートとIFN -γ( 図4)の発現を調べる。

5。代表的な結果:

培養開始時にPBMCにおけるγδT細胞の割合を決定することが重要です。 に示す。 2、PBMC中のCD3の割合+TCRVγ9+γδT細胞は、0日目1.6%であった。中央メモリー表現型-支配的な集団は、CD27 + CD45RA +ナイーブまたはCD27 + CD45RAでした。 γδT細胞が効率的に刺激されたとき、彼らは日3-5( 図3、B)上にクラスターを形成。クラスターの形成が遅延したときは、次のような他の細胞型、の成長CD4 +またはCD8 +αβT細胞やNK細胞がγδT細胞( 図3 CとD)の成長を支配することができます。文化の14日後、γδT細胞の頻度は、成功したγδT細胞の培養における培養細胞以上の93.8パーセント( 図2 E)に増加した。培養γδT細胞アップレギュレートNKG2DとCD69の発現( 図2 G及びH)。彼らは、CD27を表示- CD45RA -エフェクターメモリー表現型( 図2 F)。 γδT細胞の機能は、サイトカイン産生および細胞毒性に関して評価した。細胞内IFN -γ染色γδT細胞は、PMA /イオノマイシンの治療またはZ - Daudi細胞に反応してIFN -γを産生することが明らかにそのゾレドロネートの治療後に蓄積されたIPP( 図4)。これらの結果は、ゾレドロネートが効率的に機能するγδT細胞を刺激し、展開することができますを示している。

チューブ FITC PE ECD PE/Cy5
1 CD3 CD19 CD45 CD14
2 CD3 TCRαβ CD4 CD8
3 CD3 CD56
4 TCRVγ9 TCRαβ CD45 CD3
5 TCRVγ9 NKG2D
6 TCRVγ9 CD69
7 TCRVγ9 マウスIgG1
8 TCRVγ9 CD45RA CD27
9 TCRVγ9 マウスIgG1 マウスIgG1

表1。γδT細胞のマルチカラー染色に使用されるモノクローナル抗体。当研究室で行わγδT細胞の表現型解析の例をに示します。 2。

図1
図1。PBMCの分離。血液(7.5〜8.0ミリリットル)をヘパリンナトリウムでBDバキュテイナCPTの細胞調製チューブに引き込まれて、直接1800 × gで20分間遠心分離する。遠心分離後、得られた層は、boの上から見たttom:)プラズマ - b)のPBMCおよび血小板 - c)の密度のソリューション - D)ポリエステルゲル - E)顆粒球 - f)の赤血球。

図2
図2。γδT細胞の典型的な表面表現型。 PBMCを14日間ゾレドロネートとIL - 2で刺激した。細胞はで染色したFITC標識抗TCRVγ9とγδT細胞(およびE)の拡大を監視するために抗CD3 PE/Cy5-labeled。 γδT細胞はTCRVγ9の発現により同定した、とCD27とCD45RA(BとF)、NKG2D(CとG)、またはCD69(DおよびH)のそれらの発現を調べた。

図3
図3。代表γδT細胞の培養。 PBMCをIL - 2(1000 IU / ml)とゾレドロネート(5μM)で刺激した。代表的なフィールドは、(IX71倒立顕微鏡[オリンパス] × 200)表示されます。 γδT細胞のクラスターと集計は、γδT細胞が正常に展開された3日目(A)と5日目(B)、で観察することができます。 γδT細胞増殖は、(CとD)十分でない場合には対照的に、クラスターまたは凝集物が観察されなかった。

図4
図4。IFN -γ産生。 γδT細胞は、RPMI - 10(A)またはPMA /イオノマイシン(B)または4時間Z -ダウディ(C)とともにインキュベートした。最初に、TCRVγ9の表面発現は、染色した後、IFN -γ産生は、細胞内IFN -γ染色により検討した。

図5
図5。γδT細胞培養の速度論。培養細胞の(A)の絶対数、(B)γδT細胞、および指定された時点で、γδT細胞の(C)絶対数の割合。

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Discussion

ここで紹介する方法は、PBMCからのγδT細胞の効率的な展開を可能にします。ゾレドロネートで活性化と拡大γδT細胞とIL - 2は、サイトカイン産生と細胞毒性によって反射された完全なエフェクター機能を、開発する。それが合成phosphoantigensのブロモヒドリンピロリン酸(BrHPP)と2 - メチル-3 - ブテニル-1 - ピロリン酸(2M3B1PP)ことが報告されてもγδT細胞を展開していますが、それらは市販されていない。対照的に、ゾレドロネートは既にゾメタなどの臨床応用のためにライセンスされています。したがって、信頼性の高い試薬が容易に入手可能です。

培地と血清の選択は重要です。成功したγδT細胞の拡大のためにそのようなALyS203(細胞科学技術研究所)またはOpTmizer(Invitrogen社)などの適切な培地を使用する。11その自己血漿を確認し、プールしたヒトAB血清またはFCSは、γδT細胞培養をサポートすることができます。また、いくつかのドナーからのPBMCは関係なく、他の培養試薬のゾレドロネートの刺激に反応しないことに注意してください。その場合、唯一のオプションは、ドナーを変更することです。

我々が示したように、γδT細胞の濃縮は、比較的早期に達成された。培養細胞の約80%が7日目でγδT細胞であった。 γδT細胞は12-14日( 図5)にまで増殖し続けた。約2.2 × 10 8γδT細胞を1 × 10 6から取得できます。
PBMCは、1.6 × 10 4γδT細胞を含む。この培養法は、フェーズで使用されている私、多発性骨髄腫や肺癌患者における安全性とゾレドロネート-拡張されたγδT細胞の転送療法の可能性を評価する臨床試験。12,13

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Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZOMETA Novartis AG zoledronate
PROLEUKIN Novartis AG human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD Biosciences 362753
RPMI1640 Invitrogen 21870-076
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7
OpTmizer Invitrogen 0080022SA
brefeldin A Sigma-Aldrich B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585-1MG
ionomycin Sigma-Aldrich 13909-1ML
IntraPrep Beckman Coulter Inc. A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD Beckman Coulter Inc. 6604727
anti-human CD8-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607011
anti-human CD14-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07765
anti-human CD19-PE Beckman Coulter Inc. A07769
anti-human CD45-ECD Beckman Coulter Inc. A07784
anti-human CD56-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07789
anti-human TCRαβ-PE Beckman Coulter Inc. A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC Beckman Coulter Inc. IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. 6607107
anti-human CD45RA-ECD Beckman Coulter Inc. IM2711
anti-human CD69-PE BD Biosciences 555531
anti-human NKG2D-PE Beckman Coulter Inc. A08934
Anti-humal IFNγ-PE Beckman Coulter Inc. IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE Beckman Coulter Inc. A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 Beckman Coulter Inc. A07797A07798

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References

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