Hyperinsulinemic-euglycemic Зажимы в сознании, Безудержная Мыши

Published 11/16/2011
21 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine
 

Summary

Hyperinsulinemic-euglycemic зажим, или инсулин зажим, является золотым стандартом для оценки действия инсулина

Cite this Article

Copy Citation

Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка катетеры и мышь Антенна для отбора проб доступа (MASA тм)

  1. Подготовка артериального катетера, вставив 1,3 см кусок ПЭ-10 (0,011 дюймовый внутренний диаметр) в 6 см кусок силиконовой трубки (0,012 дюйма внутреннего диаметра), как показано на рисунке 1а. Bevel кончик ПЭ-10 со скальпелем таким образом, длина от конца силиконовой до кончика конической составляет 0,9 см.
  2. Подготовка венозный катетер, сдвинув 1 мм кусок силиконовой трубки (0,020 дюйма внутреннего диаметра) 1,1 см от конца скошенной 6 см кусок силиконовой трубки (0,012 дюйма внутреннего диаметра), как показано на рисунке 1b. 1 мм кусок силиконовая резина используется в качестве сдерживающих шарик.
  3. Для подготовки MASA тм, вставьте каждый из двух 1,3 см куски 25 калибр нержавеющей стали разъемы в каждом из двух 3 см куски ПЭ-20 (0,015 дюйма внутреннего диаметра).
  4. Безопасные PE-20/connectors друг к другу, сдвинув 5 мм кусок силиконовая резинатрубки (0.040 дюйма внутреннего диаметра) по области, где стальные трубы и ПЭ-20 с концами.
  5. Согните стальных труб на угол ~ 120 ° и отдельные каждую пробирку на ~ 45 °.
  6. Место завершена установка в ложку медицинского силиконовый клей, что ПЭ-20 Трубы вертикальные и концы труб из нержавеющей стали выходить за рамки клеем (рис. 1в). Позвольте этому устанавливать в течение 24 часов.

2. Хирургическое катетеризации

  1. До хирургии, стерилизации катетеров с 70% этанола, заполните их гепаринизированной физиологическим раствором (200 ЕД гепарина / мл физиологического раствора) и вставки из нержавеющей стали пробки.
  2. Анестезию мыши, желательно с использованием метода, который непрерывно обеспечивает анестетика (например, вдыхании ИФ).
  3. Использование стерильных, удалить волосы от разреза сайты, использующие кусачки и / или крем для удаления волос и дезинфицировать кожу спиртом затем бетадин скраба. Для установки катетера, удалить волосы наобласти от нижней челюсти к верхней части грудной клетки и между ключиц. Для экстернализации катетеры за голову, удалить волосы в зоне между основанием черепа и межлопаточной области и дезинфицировать кожу спиртом затем бетадин скраба.
  4. Положите мышь на спине на потепление поверхности и под просмотр области хирургического микроскопа. Безопасные хвоста и конечностей с хирургической лентой. Безопасные голову в носовом конусе доставки анестезии.
  5. Сделайте небольшой вертикальный разрез средней линии 5 мм головной к грудине. Использование щипцы, тупые рассекать ткани, чтобы выставить левую грудино-сосцевидный мускул. Отражение этой мышцы, чтобы разоблачить левой сонной артерии. Аккуратно дразнить от соединительной ткани сердца. Важно в этот момент, чтобы изолировать блуждающего нерва из артерии, не повреждая либо артерии или нерва.
  6. Изолировать артерии и перевязывать головного конца с шелковым швом. Свободно узел другогочасть шва на хвостовом конце подвергаются судна.
  7. Зажим сосуд с микро-сосудистый зажим зажим на хвостового конца и разрежьте чуть ниже лигируют заканчиваются весной ножницами. Осторожно вставьте катетер насколько зажима. Тщательно выпуска микро-сосудистый зажим зажим и продвижение катетера, чтобы силиконовая резина-PE перехода.
  8. Галстук как лигатуры надежно катетер и убедиться, что катетер образцы, подключив свободный конец катетера, чтобы выборка шприц.
  9. Сделайте еще один разрез 5 мм справа от средней линии и около 2 мм каудально по отношению к первому разрез. Использование щипцы, тупые рассекать ткани выявить и изолировать право яремную вену.
  10. Тщательно лигировать головного конца шелком швом и свободно связать другую часть шва на хвостовом конце.
  11. Вырезать чуть ниже головного лигатуры с пружинным ножницами и вставить катетер до сдерживающим шарик. Tie шва за борт и убедиться, что образцы катетер.
  12. Тур-н мышь и делают небольшой разрез между лопатками.
  13. Туннель 14-иглы под кожу от разреза для артериального катетера, на передней части мыши, в межлопаточной разрез на спине. Тема артериального катетера через иглу экстериоризироваться его в задней части мыши. Повторите эту процедуру для яремную вену катетер по туннельным 14-иглы под кожу на правой стороне мыши из разреза на передней панели для межлопаточной разрез на спине.
  14. Зажим артериальный катетер с микро-сосудистый зажим зажим на место разреза между лопатками. Вырезать катетер ~ 1 см выше этого зажима. Место MASA ТМ с нержавеющей стали разъемов, обращенной к главе мыши. Подключите артериального катетера, чтобы нержавеющая сталь разъем указал на левой стороне мыши. Позаботьтесь, чтобы обеспечить Есть никаких отверстий или изломы в катетер. Повторите эти действия для венозного катетера,подключить его к разъему нержавеющей стали, указывающие на правой стороне мыши.
  15. Вставьте MASA тм в разрез между лопатками. ПЭ-20 трубки соответствующей яремной вены катетер в том, чтобы в правой части мыши и ПЭ-20 трубки соответствующего артериального катетера должен быть слева.
  16. Закрыть брюшной и спинной разрез с нейлоновой нити. Для спинной заключение шов может быть запущен через закаленные силикона MASA тм, чтобы закрепить его на месте. Подтвердить проходимость катетера использованием промывки раствор, содержащий гепарин солевой раствор и антибиотики, чтобы минимизировать риск заражения. Наведите в согреться, чистая клетка для немедленного восстановления. На рисунке 2 показан готовый продукт.
  17. Разрешить мыши для восстановления, по крайней мере 5 дней. Монитор веса и общее состояние здоровья. Использование соответствующих послеоперационного обезболивающего режима утвержденной Animal Care учреждения иИспользуйте комитета.

3. Hyperinsulinemic-euglycemic зажим

  1. Быстрый мыши для 5-6ч. Для справки, время т = 0 мин относится к концу быстро и начале инсулина и глюкозы в инфузии (то есть зажим период).
  2. Установка и график типичного эксперимента представлены на рисунке 3. Использование микро-Renathane или эквивалент трубки для вливания и линии отбора проб. Приостановить двухканальной поворотный выше мыши. Это служит хабом между мышью и инфузионных / выборки шприцы. В ходе эксперимента мышей остается в клетке дома или аналогичный контейнер и привязан к поворотной.
  3. Перед подключением мыши, заполнить артериальной линии отбора проб с гепарином физиологического раствора (10 ед гепарина / мл физиологического раствора) и поместите нержавеющая сталь разъем на нижнем конце линии. Оставьте шприц с гепарином физиологическим раствором (очистка шприц), подключенных к верхней части отбора проб. Это будет использоваться для рисования с кровью SAMPле.
  4. Заполните линии венозной инфузии с неправительственными организациями, гепаринизированной солевой начиная с вливанием порт поворотный (Сегмент на рисунке 3А) вплоть до нижней линии. Вставьте верхний конец линии и место нержавеющая сталь разъем (или Y-разъем, если болюса должен быть введен) на нижнем конце линии. Если изотопный трассирующими глюкозы (например, [3 - 3 H] глюкозы) в настоящее время переплетаются, безопасный 1 мл шприц, содержащий трассирующими для вливания шприцем. Заполните линии венозной инфузии с трассирующими вместо физиологического раствора (рис. 3В).
  5. Три часа в быстро, весит мышь и подключить ПЭ-20 для яремной вены и артериальных катетеров для вливания и линии отбора проб, соответственно.
  6. Если управляющая [3 - 3 H] глюкозы трассирующими, начинают грунтовать-непрерывных трассирующими настой при Т = -90 мин (рис. 3С). Типичная доза грунтовка 1 мкКи. Подготовка 0,05 мкКи / мкл [3 - 3 H] глюкозы Solutioя в не-гепаринизированной физиологического раствора. Нагрузка раствора в 1 мл шприц и безопасный шприц в инфузионный насос. Администрирование грунтовки дозы вливая 20 мкл / мин в течение 1 мин. Следуйте с непрерывной инфузии по 0,05 мкКи / мин (1 мкл / мин) для уравновешивания период 90 мин.
  7. Подготовка infusates инсулина и глюкозы. Инсулин подготовлен в не-солевой гепаринизированной, содержащий 3% плазмы как носитель (соответствующей концентрации БСА также может быть использован). Глюкоза infusates коммерчески доступны в различных концентрациях (5, 20 и 50%).
  8. Подготовка физиологическим раствором мыть erythorocyte инфузата путем получения цельной крови от донора мыши, желательно того же фоне деформации как экспериментальные мыши. Обычно 1 мл цельной крови необходимо на исследование мыши. Центрифуга для разделения крови эритроцитов. Вымойте эритроцитов с 10 Ед / мл гепаринизированной засоленных и центрифуги для отмены физиологического раствора. Определить объем эритроцитов и ресуспендируют в равном объеме 10 Ед / мл heparinized физиологического раствора.
  9. Нарисуйте каждый инфузата в 1 мл шприц и безопасной каждый шприц для отдельных насоса вливания. Подключите каждый шприц, чтобы 4-контактный разъем (рис. 3).
  10. При т = -15 мин взять образцов крови с медленно составление 50-100 мкл крови на поляну шприц. Зажим артериальный линии отбора проб и удаления очистки шприца. Использование ручного измерения сахара в крови, принимают чтения глюкозы в крови, удалив зажим на артериальной линии отбора проб и позволяя крови течь в полосе метр глюкозы.
  11. Как только глюкоза измерение, зажим артериальной линии отбора проб и вставить тупой иглой шприца (выборка шприца) в артериальную линию выборки. Снимите зажим и рисовать объем крови (см. примечание) в выборки шприц. Зажим артериальный линии отбора проб и удаления выборки шприц. Вставьте очистки шприц обратно в артериальной линии отбора проб. Нарисуйте на поршень для удаления пузырьков воздуха и вновь наполнить50-100 мкл крови, который первоначально был составлен.

Примечание: объем крови, пробы зависит от того, анализ может быть исполнено. Например, анализ [3 - 3 H] концентрации глюкозы требуется 10 мкл плазмы, так что 50 мкл крови взяты. Это дает 20-30 мкл плазмы, который является достаточным для анализа плюс дополнительные плазмы в случае необходимости. Измерения гормонов и других метаболитов (например, инсулина, свободных жирных кислот), требуют дополнительного отбора проб крови.

  1. Внесите крови в шприце выборки в ЭДТА покрытием микропробирок. Центрифуги и собирать плазмы. Хранить плазму на льду до конца учебы или сразу хранить при -20 ° C.
  2. Повторите шаги 3,10 через 3,12 при Т = -5 мин. Получить дополнительную крови (50 мкл) для измерения базового уровня инсулина в плазме крови. Мера базовой гематокрита, рисуя кровь в гепарином или ЭДТА обработанных капиллярной трубке. Измерений, полученные птом образцы плазмы при Т = -15 и -5 мин представляют базовые (т.е. поста) значения.
  3. После того как образец при Т = -5 мин, заполните линии для инфузии глюкозы, инсулина и физиологическим раствором отмытых эритроцитов до 4-контактный разъем. Подключите 4-контактный разъем для трубки прикреплен к поворотной порт инфузии (или трубка подключена к Y-разъем, если вливая [3 - 3 H] глюкозы), как показано на рисунке 3.
  4. Начните вливание солевого-отмытых эритроцитов в первую очередь. Установить скорость инфузии, чтобы заменить общий объем крови быть, отобранная в течение периода исследования (например, если в общей сложности 500 мкл крови, отобранная в течение 120 мин исследования, установить скорость инфузии до 4,2 мкл / мин). В отличие от других infusates, эритроцитов решение имеет красный цвет. Обогащая это решение Первая позволяет для любого потенциального сопротивления или препятствия в инфузии линии, которые будут выявлены и исправлены.
  5. Как только эритроцитов достигает инфузата мыши, начнем инсулина иглюкозы вливаний. Это теперь т = 0 мин. Инсулин переплетаются с постоянной, заранее определенной скоростью. Скорость инфузии инсулина из 4 мЕд • кг -1 • мин -1, как правило, подавляет выработку эндогенного глюкозы на 80-100% и стимулировать глюкозы исчезновения в 2-3 раза. Начальная скорость инфузии глюкозы (ГИР) оценивается на основе базового уровня глюкозы в крови и предыдущий опыт.
  6. Если вливая [3 - 3 H] глюкозы, можно избрать для увеличения скорости трассирующими вливания, чтобы соответствовать оценкам увеличение глюкозы в обороте (как правило 2-3 раза).
  7. Учитывая высокий уровень глюкозы в оборот в мыши, образцы крови должны быть получены от артериальной линии не менее чем через каждые 10 мин для измерения концентрации глюкозы в течение срока эксперимента. Отрегулируйте ГИР для достижения и поддержания целевых euglycemia (рис. 3С). Эта цель может варьироваться в зависимости от модели или цели исследования. Хороший GL целевойucose концентрации 150 мг • л-1, так как это типичная 6ч уровень глюкозы натощак для чау-кормили мышей C57BL/6J.
  8. Целью является достижение euglycemia быстро, в идеале в течение первых 40-50 мин, а также иметь глюкозы и ГИР стабильным к началу стационарного периода (Т = 80 мин).
  9. Если вливая [3 - 3 H] глюкозы, получить дополнительную кровь при Т = 80, 90, 100, 110 и 120 минут для измерения плазмы [3 - 3 H] глюкозы конкретного вида деятельности.
  10. Сбор дополнительной крови при Т = 100 и 120 мин для измерения инсулина в плазме крови и любой другой гормон (ы) или метаболит (ы). При Т = 110 мин, рисовать кровь в гепарином или ЭДТА обработанных капиллярная трубка для измерения зажим гематокрита.
  11. После того как образец при Т = 120 мин берется, 2 [14 C] дезоксиглюкозы могут быть введены для измерения тканеспецифические поглощение глюкозы. Администрирование 12 мкКи болюсно в болюсного линии, подключенной к яремной отбора проб (рис. 3В
  12. Получить образцы крови (50 мкл) от артериальной линии отбора проб на т = 2, 15, 25 и 35 мин после введения болюса для измерения плазмы 2 [14 C] дезоксиглюкозы уровнях.
  13. После последнего образца, обезболить мышь с вливанием пентобарбитал дано непосредственно в артериальную линию. Быстро анализировать любые ткани, необходимые для оценки усвоения глюкозы (например, скелетных мышц различного типа, в жировой ткани, сердца, головного мозга) и любые другие ткани (например, печень, селезенка, почки). Привязка замораживания тканей в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до анализа. Ткань глюкозы анализируется путем измерения накопления фосфорилированных 2 [14 C] дезоксиглюкозы в замороженных тканях и исчезновение 2 [14 C] дезоксиглюкозы из плазмы.

4. Представитель Результаты

Пример результатов, полученных в эксперименте зажим инсулина показано на рисунке 4.Этот пример показывает способность высоким содержанием жиров для осаждения резистентность к инсулину у мышей. Все презентации результатов инсулина зажим должен включать следующие быть интерпретируемым: время хода уровня глюкозы в крови, время хода ГИР и плазменные уровни инсулина (базовый и зажим). Как показано здесь, уровень глюкозы натощак (рис. 4а) и инсулина (рис. 4С) уровни выше у мышей, которых кормили высоким содержанием жиров, что свидетельствует о резистентности к инсулину. Представляя время хода уровня глюкозы всей зажим исследования (рис. 4А) позволяет читателю оценить, насколько хорошо euglycemia был сохранен, что свидетельствует о качестве зажима. Кроме того, время хода ГИР (рисунок 4B) позволяет читателю определить, как быстро стационарных была достигнута. Показаны эти данные, как время курсов значительно более информативным, чем обычной практикой в ​​зажим мыши инсулина литературе представления 2-часовой экспериментв качестве единой точки отсчета представляющие средние значения с неопределенным "зажим" период (4-13). В настоящее время, например, уровни глюкозы были равны между контролем и с высоким содержанием жира кормили групп, но ГИР была значительно ниже в высоким содержанием жиров кормили группы (рис. 4В). Это свидетельствует о обесценения в весь организм инсулина. Зажим уровень инсулина также были выше в высоким содержанием жиров кормили группы (рис. 4С), дальнейшую поддержку присутствия инсулинорезистентны фенотип у этих мышей. Использование изотопного вливаний трассирующими позволяет оценить действия инсулина в определенных тканях. [3 - 3 H] глюкозы используется для оценки скорости эндогенного появление глюкозы (Эндора), который является индекс продукции глюкозы печенью (ПГП) и скорость всего тела глюкозы исчезновения (Rd). В то время как инсулин полностью подавляет HGP у контрольных мышей, это нарушение у мышей кормили высоким содержанием жиров (рис. 4D). Кроме того, способность винсулина, чтобы стимулировать Rd у контрольных мышей скомпрометирована в мышей, которых кормили высоким содержанием жиров (рис. 4E). 2 [14 C] дезоксиглюкозы используется для оценки индекса метаболизма глюкозы (Кв), мера тканеспецифические поглощение глюкозы. Как видно из этого примера, стимулируемое инсулином потребление глюкозы в скелетных мышцах нарушается у мышей кормили высоким содержанием жиров (рис. 4F).

Рисунок 1
Рисунок 1: Подготовка артериальная (А) и (Б) венозных катетеров и (С) MASA тм. Артериальные катетеры готовят путем введения 1,3 см кусок ПЭ-10 около 3 мм в 6 см кусок 0,012 "силиконовой ID. ПЭ-10 наконечник скошенные, что длина от конической к силиконовой составляет 0,9 см. Венозная катетеры, сделанные скользящей небольшой кусочек 0.020 "ID силиконовой 1,1 см от конца скошенной 6 см кусок 0,012" силиконовой ID. 0.020 "ID силиконовой актов кусок как сдерживающее борта к себе лечения катетер яремной вены. Для сборки MASA тм, каждый из двух 1,3 см 25 калибра разъемы вставляется в каждом из двух 3 см куски ПЭ-20. Они удерживаются вместе небольшой кусочек 0,040 "силиконовой ID. Разъемы наклонился, чтобы углом 120 ° и разделенных на угол 45 °. Весь узел погружается в медицинский силиконовый клей.

Рисунок 2
Рисунок 2: катетеризация мыши. Катетеры имплантируется в левую сонную артерию и яремную вену правой. Свободные концы катетеры вовне за голову и связаны с MASA тм. MASA ТМ вводится подкожно между лопатками. Это позволяет для сосудистого доступа в ходе экспериментов инсулина зажим без необходимости сдерживать, ручку или анестезию мыши.

JPG "/>
Рисунок 3: изображение установки и график эксперимента зажим инсулина. Мышь привязаны к двухканальной поворотный, который действует как концентратор для инфузий и отбора проб шприцы. Типичные установки для экспериментов не используются трассирующие инфузий (А) и с использованием как [3 - 3 H] глюкозы и 2 [14 C] дезоксиглюкозы (В) показано на рисунке. Тайм-линии процедур для создания и выполнения инсулина зажим (C) также показано на рисунке. Во время зажима, образцы крови ( кровь ) Берутся каждые 10 мин для измерения глюкозы в крови. ГИР корректируется для поддержания euglycemia. Образцы для базовой глюкозы в крови, инсулина в плазме крови и плазмы [3 - 3 H] глюкозы принимаются на т = -15 и -5 мин. Образцы для зажима плазмы [3 - 3 H] глюкозы принимаются при Т = 80, 90, 100, 110 и 120 и для зажима инсулина при Т = 100 и 120 мин. 2 [14 C] дезоксиглюкозы назначается после образца при Т = 120 мин и бlood собирается на т = 2, 15, 25 и 35 мин после. Ткани принято после того, т = 35 мин образца.

Рисунок 4
Рисунок 4: Результаты эксперимента инсулина зажим сравнивая мышей на контрольную диету (Chow) мышам с высоким содержанием жиров (HFD). Время хода артериальной глюкозы (А) и ВМР (B), базовый и зажим инсулина (С), Эндора (D), и Rd (E) и скелетные мышцы (икроножные и vastus латеральной) RG (F) показаны. Все результаты свидетельствуют о влиянии кормления с высоким содержанием жира, чтобы вызвать резистентность к инсулину.

Discussion

Hyperinsulinemic-euglycemic зажим, или инсулин зажим, широко считается «золотым стандартом» метод оценки действия инсулина в естественных условиях. Эта методика была применена для нескольких видов, включая человека, собак, крыс и мышей. Учитывая все большее число моделей трансгенных мышей при нарушении обмена веществ, миниатюризации техники для использования в мышь при условии значительных успехов на метаболические исследования.

Хотя концепции, лежащие в инсулине зажим просто, на практике Существуют различные подходы для проведения экспериментов инсулина зажимом. Это не тривиальный момент, поскольку манера, в которой эксперимент проводится влияет на результаты, полученные 1. Здесь мы приводим протокол, используемый Вандербильта MMPC. Ключевое различие между нашими протокол и что других в том, что мы используем артериального катетера для получения образцов крови. Это в отличие от более широко используется подход OBTaining образцы крови от разрыва кончик хвоста 4, 7, 11, 12, 14-17. Преимущество выборки из артериального катетера в том, что эксперимент проводится в сознательном и безудержной мыши. Отбор проб от хвоста часто требует сдержанности и увеличивает показатели стресса, когда крупные образцы крови приобретаются 1. Гормоны стресса стимулируют выработку эндогенного глюкозы и глюкозы нарушить распоряжение 18, 19, потенциально создавая впечатление фенотип устойчивы к инсулину. Отбор проб из отрубленной хвоста могут потребоваться специальные Уходу за животными и утверждение Используйте комитета из-за его напряженный характер. Артериальной процедура катетеризации был разработан, чтобы избежать стресса для мыши разрыва хвост.

Ключевым аспектом выполнения инсулина зажимов является способность поддерживать euglycemia. Существуют алгоритмы, которые не могут правильно предсказать, как ГИР должна быть скорректирована на основе показаний глюкозы в крови. Как хирургии,персонала, проводящего эксперименты инсулина зажим будет стать специалистами в сохранении разумных euglycemia только через опыт. Важно отметить, что из-за их более высокой скорости обмена веществ данные, полученные из мышиных исследования будут по своей сути шумно. Это делает полное представление данных, включая время курсы глюкозы и ГИР и абсолютного значения для инсулина в плазме, Эндора, Rd и Rg решающее значение для способности любой читатель интерпретировать результаты. Высокий уровень глюкозы в поток ставок в мышь (примерно в 5 раз выше, чем скорость у людей) гарантирует высокую частоту дискретизации глюкозы. В то время как объем крови от мыши ограничена, минимальная частота отбора проб каждые 10 минут нужно быть уверенным, что адекватное зажим была достигнута.

Как показано на рисунке 4, зажим уровней инсулина могут быть различны между группами. Такие факторы, как диета вмешательств, манипуляций трансгенные или различия в фоновом штаммы могут повлиять на ФАСTing уровень инсулина, что может в дальнейшем повлиять на уровень зажим инсулина. Интерпретация результатов, когда уровень инсулина зажим разные может быть проблематичным. Это может быть экспериментально решать путем проведения пилотных экспериментов, чтобы выбрать инфузии инсулина ставки, обеспечивающие достижение эквивалентных зажим уровень инсулина между группами. Кроме того, соматостатин может быть использована для подавления секреции поджелудочной железы гормона, инсулина и глюкагона может быть заменен на экспериментально контролируемых ставок. Этот последний подход чаще всего делается в инсулине зажимы на крыс, чем у мышей. Если эти экспериментальные подходы не будут приняты, стационарное ВМР могут быть нормализованы до уровня инсулина зажим, или индекс чувствительности к инсулину (S I) могут быть выведены из зажима данных S I = ГИР / (G • ΔI), где G является стационарной концентрации глюкозы и ΔI разница между постом и концентрации инсулина зажим. Одно предположение с любой из этих подходов является то, что уровень инсулина зажим достигнутыхв пределах диапазона, где чувствительность к инсулину линейно зависит от уровня инсулина в соответствии с группой изучается. Это последнее предположение не может применяться при сравнении устойчивы инсулина и инсулина чувствительным группам. В идеале, ответ дозы инсулина кривой должен быть сформирован, чтобы выбрать подходящий инфузии инсулина. Однако из-за потребности в дополнительных экспериментах, это делается редко.

Универсальность предоставляемых артериальной катетеризации распространяется за пределы экспериментальных подходов euglycemic зажимов. Например, гипергликемическое зажимы, в которой глюкоза переплетаются с переменной скоростью для поддержания гипергликемия относительно глюкозы, могут быть использованы для оценки эндогенной функции поджелудочной железы в 2 естественных, 20, 21. Измерение первой фазы секреции инсулина во время этого теста требует частого приобретения образцов крови (то есть каждые 2-5 мин), который не представляется возможным при получении образцов от кончика хвоста. Кроме того,повышенные катехоламинов в результате хвост выборки может нарушить секрецию инсулина и повысить секрецию глюкагона 22. Протокол инсулина зажим также могут быть изменены, чтобы обеспечить уровень глюкозы снизится до относительной гипогликемии оценить дерегулирующее ответ 2, 23, 24. Артериальная катетеризация также может быть использован для оценки динамики метаболизма глюкозы во время упражнений 25-30. Это значительно выгоднее по сравнению с традиционными подходами проводиться на одном моменты времени до и после физических упражнений или в изолированных естественных бывших мышц. Методы, представленные здесь, могут также быть использованы для оценки не только глюкозу, но и метаболизм жирных кислот 31.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом 5-U24-DK059637-10 до Метаболический Вандербильта Центр Фенотипирование мышь.

References

  1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
  3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
  4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
  5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
  6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
  7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
  8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
  9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
  10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
  11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
  12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
  13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
  14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
  15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
  16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
  17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
  18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
  19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
  20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
  21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
  22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
  23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
  24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
  25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
  26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
  27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
  28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
  29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. (2004).
  30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
  31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

Comments

21 Comments

  1. Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 8:09 AM
  2. Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala

    Reply
    Posted by: Julio A.
    November 29, 2012 - 8:46 AM
  3. Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 9:39 AM
  4. Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 26, 2014 - 1:17 PM
  5. Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 26, 2014 - 2:06 PM
  6. Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 28, 2014 - 12:20 PM
  7. Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 28, 2014 - 3:42 PM
  8. Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.

    Reply
    Posted by: Joseph C.
    April 8, 2014 - 5:11 PM
  9. Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 11, 2014 - 4:15 PM
  10. Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    April 15, 2014 - 11:17 AM
  11. Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 16, 2014 - 10:32 AM
  12. Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 12:32 PM
  13. Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.

    Reply
    Posted by: Carlo M.
    October 2, 2014 - 1:29 PM
  14. Thanks. I will try it!

    Kai

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 4:11 PM
  15. Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:05 PM
  16. Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:25 PM
  17. Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:38 PM
  18. We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:31 PM
  19. Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 2:56 PM
  20. Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:47 PM
  21. Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    November 4, 2014 - 1:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats