Hyperinsulinämische-euglykämische Schellen in dem Bewusstsein, Unrestrained Mäuse

Published 11/16/2011
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Medicine
 

Summary

Die hyperinsulinämische-euglykämische Clamp-oder Insulin-Clamp, ist der Goldstandard für die Beurteilung der Wirkung von Insulin

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Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

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Abstract

Typ 2 Diabetes ist durch einen Defekt in der Insulin-Wirkung gekennzeichnet. Die hyperinsulinämische-euglykämische Clamp-oder Insulin-Clamp, gilt weithin als der "Goldstandard"-Methode zur Beurteilung der Wirkung von Insulin in vivo. Während einer Insulin-Clamp ist Hyperinsulinämie durch einen konstanten Insulin-Infusion erreicht. Normoglykämie wird über eine gleichzeitige Glukose-Infusion mit einer variablen Rate beibehalten. Diese Variable Glukose Infusionsrate (GIR) wird durch die Messung des Blutzuckers in kurzen Abständen während des gesamten Experiments und die Anpassung der GIR entsprechend bestimmt. Die GIR ist bezeichnend für die Ganzkörper-Insulinwirkung, wie die Mäuse mit erhöhter Wirkung von Insulin erfordern eine größere GIR. Das Insulin Clamp kann die Verabreichung von Isotopen-2 greifen [14 C] Desoxyglucose zu beurteilen, Gewebe-spezifische Glukoseaufnahme und [3 bis 3 H]-Glucose auf die Fähigkeit von Insulin, um die Rate der endogenen Glukose Aussehen (Endora) zu unterdrücken, einem Marker der Beurteilung Glukoneogenese in der Leber und zur Anregung derRate der Ganzkörper-Glukose Verschwinden (Rd).

Die Miniaturisierung der Insulin-Clamp für den Einsatz in der genetischen Mausmodellen der Stoffwechselkrankheit zu erheblichen Fortschritten in der Diabetes-Forschung führte. Methoden zur Durchführung von Insulin Klammern variieren zwischen den Labors. Es ist wichtig zu beachten, dass die Art und Weise, ein Insulin-Clamp durchgeführt wird, kann erhebliche Auswirkungen auf die erzielten Ergebnisse. Wir haben eine umfassende Bewertung der verschiedenen Ansätze zur Durchführung von Insulin Klemmen in bewusster Mäusen 1 sowie eine Bewertung der metabolischen Reaktion von vier häufigsten verwendeten Inzucht-Mausstämme mit verschiedenen Clamp-Technik 2 veröffentlicht. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Durchführung von Insulin Klemmen auf bewusste, hemmungsloser Mäusen durch die Vanderbilt Maus Metabolic Phänotypisierung Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu / MMPC) entwickelt. Dies umfasst eine Beschreibung der Verfahren zum Implantieren Katheter während der Insulin Clamp verwendet. Das Protokoll, das von den BeschäftigtenVanderbilt MMPC nutzt ein einzigartiges Zwei-Katheter-System 3. Ein Katheter wird in die Jugularvene für Infusionen eingesetzt. Ein zweiter Katheter wird in die Halsschlagader, die zur Blutentnahme ermöglicht, ohne die Notwendigkeit, zurückzuhalten oder Griff mit der Maus eingefügt. Diese Technik bietet einen wesentlichen Vorteil für die am weitesten verbreitete Methode zur Gewinnung von Blutproben während der Insulin-Klemmen, die aus dem abgetrennten Spitze des Schwanzes Probe. Im Gegensatz zu dieser letzteren Methode, Probenahme aus einem arteriellen Katheter ist nicht belastend für die Maus 1. Wir beschreiben auch Verfahren zur Verwendung Isotopen-Tracer-Infusionen, um Gewebe-spezifische Wirkung von Insulin zu bewerten. Wir bieten auch Richtlinien für die angemessene Präsentation der Ergebnisse aus der Insulin-Klemmen erhalten.

Protocol

1. Vorbereitung von Kathetern und Maus-Antenne für Sampling Access (MASA tm)

  1. Bereiten arteriellen Katheter durch Einfügen eines 1,3 cm Stück PE-10 (0,011 Zoll Innendurchmesser) in eine 6 cm Stück Silastic Schlauch (0,012 Zoll Innendurchmesser), wie in Abbildung 1A dargestellt. Bevel die Spitze des PE-10 mit einem Skalpell so die Länge von dem Ende der Silastic an der Spitze der Schräge beträgt 0,9 cm.
  2. Bereiten Venenkatheter, indem eine 1 mm Stück Silastic Schlauch (0,020 Zoll Innendurchmesser) 1,1 cm aus dem abgeschrägten Ende einer 6 cm Stück Silastic Schlauch (0,012 Zoll Innendurchmesser), wie in Abbildung 1B gezeigt. Die 1 mm Stück Silastic ist als eine einstweilige Perle eingesetzt.
  3. Zur Herstellung eines MASA tm, legen Sie jeweils zwei 1,3 cm große Stücke von 25-mm-Edelstahl-Anschlüsse in jeweils zwei 3 cm Stücke von PE-20 (0,015 Zoll Innendurchmesser).
  4. Sichern Sie die PE-20/connectors miteinander, indem Sie einen 5 mm Stück SilasticSchlauch (0,040 Zoll Innendurchmesser) über den Bereich, wo der Stahl-Rohre und PE-20 erfüllen.
  5. Biegen Sie die Stahlrohre zu einem ~ 120 °-Winkel und trennen Sie die einzelnen Rohr ~ 45 °.
  6. Ort abgeschlossen rig in einem Klecks aus medizinischem Silikon Klebstoff, so dass die PE-20-Schlauch senkrecht ist und die Enden der Edelstahlrohre erstrecken sich über den Klebstoff (Abbildung 1C). Lassen Sie diese für 24 Stunden eingestellt.

2. Chirurgische Katheterisierung

  1. Vor der Operation zu sterilisieren Katheter mit 70% Ethanol, füllen sie mit heparinisierten Kochsalzlösung (200 U Heparin / ml Kochsalzlösung) und Behälter aus Edelstahl Stecker.
  2. Anesthetize Maus, vorzugsweise unter Verwendung einer Methode, die kontinuierlich liefert das Anästhetikum (zB inhaliert Isofluran).
  3. Mit einer sterilen Technik, entfernen Haare aus dem Einschnitt Sites mit Klipper und / oder eine Enthaarungscreme und Desinfektion der Haut mit Alkohol durch eine betadine Peeling gefolgt. Für Katheter, entfernen Haare auf demRegion, die sich aus dem Unterkiefer auf der Oberseite des Brustkorbs und zwischen dem Schlüsselbein. Für Externalisierung der Katheter hinter dem Kopf, entfernen Haare in den Bereich zwischen der Basis des Schädels und der interskapularen Region und desinfizieren die Haut mit Alkohol durch eine betadine Peeling gefolgt.
  4. Legen Sie die Maus auf dem Rücken auf eine wärmende Oberfläche und unter dem Sichtfenster von einem Operationsmikroskop. Sichern Sie die Schwanz und Extremitäten mit chirurgischen Band. Sichern Sie die Leiter in die Bugspitze Auslieferung der Anästhesie.
  5. Machen Sie eine kleine vertikale Mittellinienschnitt 5 mm cephalica bis zum Brustbein. Mit einer Pinzette, stumpf sezieren das Gewebe auf der linken Seite Kopfnickers aussetzen. Reflect dieses Muskels auf der linken Halsschlagader freizulegen. Gently tease aus Bindegewebe von der Arterie. Es ist an dieser Stelle wichtig, den Vagusnerv aus der Arterie ohne Beschädigung entweder der Arterie oder die Nerven zu isolieren.
  6. Isolieren Sie die Arterie und ligieren das Kopfende mit Seidenfaden. Lose Knoten anderenStück Naht am kaudalen Ende des freigelegten Gefäß.
  7. Clamp Gefäß mit einem Mikro-serrefine Klemme am kaudalen Ende und kurz unterhalb der ligiert Ende mit Feder Schere. Vorsichtig Katheter bis in die Klemme. Nach vorsichtiger Mikro-serrefine Klemme und vorab den Katheter in den Silastic-PE-Übergang.
  8. Tie beiden Ligaturen fest mit dem Katheter ein und bestätigen Sie, dass der Katheter-Proben, indem Sie das freie Ende des Katheters auf einer Sampling-Spritze.
  9. Machen Sie einen anderen Schnitt 5 mm auf der rechten Seite der Mittellinie und etwa 2 mm kaudal des ersten Schnitt. Mit einer Pinzette, stumpf sezieren das Gewebe zu entlarven und zu isolieren, die rechte Jugularvene.
  10. Sorgfältig ligieren das Kopfende mit Seidenfaden und locker binden ein weiteres Stück der Naht am kaudalen Ende.
  11. Kurz unterhalb der cephalica Ligatur mit Feder Schere und legen Sie den Katheter bis in die einstweilige Wulst. Tie eine Naht hinter dem Wulst und bestätigen, dass der Katheter-Proben.
  12. Turn mit der Maus über und machen einen kleinen Schnitt zwischen den Schulterblättern.
  13. Tunnel eine 14-Gauge-Nadel unter die Haut von der Wunde für den arteriellen Katheter, an der Vorderseite der Maus, um die Interskapular Schnitt auf der Rückseite. Thema der arteriellen Katheter durch die Nadel, um es auf der Rückseite der Maus exteriorisieren. Wiederholen Sie dies für die Jugularvene Katheter durch Tunneln der 14-Gauge-Nadel unter die Haut auf der rechten Seite der Maus aus dem Inzisionsstelle auf der Vorderseite der Interskapular Schnitt auf der Rückseite.
  14. Klemmen Sie den arteriellen Katheter mit einem Mikro-serrefine Klemme am Inzisionsstelle zwischen den Schulterblättern. Schneiden Sie den Katheter ~ 1 cm oberhalb dieser Klemme. Legen Sie die MASA tm mit dem Edelstahl-Anschlüssen in Richtung zum Kopf der Maus. Verbinden Sie den arteriellen Katheter zur Edelstahl-Anschluss in Richtung der linken Seite der Maus darauf. Achten Sie darauf, es gibt keine Löcher oder Knicke in den Katheter. Wiederholen Sie dies für den Katheter,Anschluss an das Anschlussstück aus Edelstahl zeigt auf der rechten Seite der Maus.
  15. Legen Sie die MASA tm in den Einschnitt zwischen den Schulterblättern. Die PE-20-Schlauch entsprechend der Halsschlagader Katheter sollte auf der rechten Seite der Maus und der PE-20-Schlauch entsprechend der arteriellen Katheter sollte auf der linken Seite sein.
  16. Close ventralen und dorsalen Einschnitte mit Nylonfaden. Für die dorsal geschlossen, kann die Naht durch die gehärteten Silikon der MASA tm ausgeführt werden, um es zu fixieren. Bestätigen Sie die Durchgängigkeit der Katheter mit einer Spüllösung mit heparinisierten Kochsalzlösung und ein Antibiotikum, um das Risiko einer Infektion zu minimieren. Bewegen Sie die Maus in einem erwärmten, sauberen Käfig für die sofortige Wiederherstellung. Abbildung 2 zeigt das fertige Produkt.
  17. Lassen Sie die Maus, um für mindestens 5 Tage zu erholen. Monitor Gewicht und die allgemeine Gesundheit. Nutzen Sie die entsprechenden postoperativen Schmerzmittel Regime wie von der Institution Animal Care genehmigt undVerwenden Sie Committee.

3. Hyperinsulinämische-euglykämische Clamp

  1. Schnell mit der Maus für die 5-6h. Als Referenz verweist die Zeit t = 0 min bis zum Ende des Fastens und der Beginn der Insulin-und Glukose-Infusion (dh die Klemme Zeitraum).
  2. Das Setup-und Zeitplan für einen typischen Experiments sind in Abbildung 3 dargestellt. Verwenden Sie Micro-Renathane oder gleichwertig Schlauch für Infusions-und Sampling-Linien. Suspend ein Zweikanal-Schwenk über die Maus. Dies dient als Drehscheibe zwischen der Maus und Infusion / Probenahme Spritzen. Während des Experiments bleibt die Maus in einem eigenen Käfig oder ähnliche Behälter und ist mit dem Schwenk angebunden.
  3. Vor dem Anschluss der Maus, füllen Sie die arterielle Entnahmeleitung mit heparinisierten Kochsalzlösung (10 U Heparin / ml Kochsalzlösung) und platzieren Sie ein Edelstahl-Anschluss am unteren Ende der Zeile. Lassen Sie eine Spritze mit Heparin-Kochsalzlösung (Clearing Spritze) an der Spitze der Entnahmeleitung. Dies wird für die Erstellung von Blut samp werdenles.
  4. Füllen Sie das venöse Infusion mit nicht-heparinisierten Kochsalzlösung ab der Infusion Port des Schwenk (Segment A in Abbildung 3A) bis hin zum Ende der Zeile. Stecken Sie das obere Ende der Linie und platzieren Sie ein Edelstahl-Anschluss (oder ein Y-Stecker, wenn ein Bolus verabreicht werden soll) am unteren Ende der Zeile. Wenn ein Isotopen-Glucose-Tracer (z. B. [3 bis 3 H]-Glucose) wird infundiert wird, sichern eine 1 ml Spritze mit dem Tracer zu einem Infusionsspritze. Füllen Sie das venöse Infusion mit Tracer statt Kochsalzlösung (Abbildung 3B).
  5. Drei Stunden in der schnellen, wiegen die Maus und die Verbindung der PE-20 für die Jugularvene und arteriellen Katheter zur Infusion und Entnahmeleitungen jeweils.
  6. Wenn die Verwaltung [3 bis 3 H]-Glucose-Tracer, beginnen eine grundierte-kontinuierlichen Tracer Infusion bei t = -90 min (Abbildung 3C). Ein typisches Priming Dosis beträgt 1 Ci. Bereiten Sie eine 0,05 Ci / ul [3 bis 3 H]-Glucose solution in nicht-heparinisierten Kochsalzlösung. Laden Sie die Lösung in eine 1 ml Spritze und sichern Sie die Spritze in einer Infusionspumpe. Verwalten Sie die Impfdosis der Grundimmunisierung durch Infusion von 20 mu l / min für 1 min. Folgen Sie mit einer kontinuierlichen Infusion von 0,05 Ci / min (1 ml / min) für 90 min Äquilibrierung Zeitraum.
  7. Bereiten Infusionen von Insulin und Glukose. Insulin wird in nicht-heparinisierten Kochsalzlösung, die 3%-Plasma als Träger (eine entsprechende Konzentration von BSA kann auch verwendet werden) vorbereitet. Glucose Infusionen sind im Handel in verschiedenen Konzentrationen (5, 20 und 50%).
  8. Bereiten Sie mit Kochsalzlösung gewaschen erythorocyte Infusionslösung durch den Erwerb von Vollblut von einem Spender mit der Maus, vorzugsweise aus dem gleichen Stamm Hintergrund der experimentellen Maus. In der Regel 1 ml Vollblut pro Studie Maus benötigt. Zentrifugieren Sie das Blut zu trennen Erythrozyten. Wash Erythrozyten mit 10 U / ml heparinisierten Kochsalzlösung und Zentrifuge, die Saline zu verwerfen. Bestimmen Sie das Volumen der Erythrozyten und resuspendieren in einem gleichen Volumen von 10 U / ml heparinized Kochsalzlösung.
  9. Zeichnen Sie jede Infusionslösung in einer 1 ml Spritze und sichere jede Spritze, um eine individuelle Infusionspumpe. Schließen Sie jede Spritze mit einem 4-poligen Stecker (Abbildung 3).
  10. Bei t = -15 min dauern eine Blutprobe durch langsames Aufstellung 50-100 &mgr; l von Blut in den Clearing-Spritze. Klemmen Sie den arteriellen Entnahmeleitung und entfernen Sie die Clearing-Spritze. Mit einem handgeführten Blutzuckermessgerät, werfen Sie einen Blutzuckerwert, indem Sie die Klemme an der arteriellen Entnahmeleitung und damit das Blut in die Blutzuckermessgerät Streifen fließen.
  11. Nachdem die Glucose-Messung genommen wird, klemmen die arterielle Entnahmeleitung und legen Sie eine stumpfe Nadel einer Spritze (Probenahme Spritze) in die arterielle Entnahmeleitung. Entfernen Sie die Klemme und ziehen Sie eine Menge Blut (siehe Anmerkung) in die Probenahme Spritze. Klemmen Sie den arteriellen Entnahmeleitung und entfernen Sie die Sampling-Spritze. Legen Sie die Clearing-Spritze wieder in den arteriellen Entnahmeleitung. Zeichnen Sie auf den Kolben, um die Luftblasen zu entfernen und wieder ziehen die50-100 &mgr; l von Blut, das ursprünglich erstellt wurde.

Hinweis: Das Volumen der Blutproben ist abhängig von der Analyse gemacht. Zum Beispiel, Analyse [3 bis 3 H] Glucose-Konzentration 10 ul Plasma benötigt, so 50 ul Blut gezeichnet werden. Dies ergibt 20-30 ul von Plasma, das ausreichend für die Analyse sowie zusätzliche Plasma, wenn benötigt wird. Messungen von Hormonen und anderen Metaboliten (z. B. Insulin, freie Fettsäuren) benötigen Probenahme von zusätzlichen Blut.

  1. Dispense das Blut in den Sampling-Spritze in eine EDTA-beschichteten Mikroröhrchen. Zentrifuge und sammeln das Plasma. Halten Sie das Plasma auf Eis, bis zum Ende des Studiums oder unmittelbar bei -20 ° C.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 3,10 bis 3,12 bei t = -5 min. Erhalten zusätzliche Blut (50 ul) für die Messung der Grundlinie Plasma-Insulinspiegel. Messen Sie Baseline Hämatokrit, indem das Blut in eine Heparin-oder EDTA-behandelte Kapillare. Die Messungen erhaltenen from Plasmaproben bei t = -15 und -5 min stellen Grundlinie (dh Fasten-) Werte.
  3. Nach der Probe bei t = -5 min, füllen Sie die Infusionsleitungen für Glukose, Insulin und Kochsalzlösung gewaschen Erythrozyten bis zum 4-poligen Stecker. Verbinden Sie den 4-poligen Stecker, um den Schlauch an der Schwenk-Infusion-Port (oder den Schlauch an den Y-Stecker angeschlossen werden, wenn die Infusion [3 bis 3 H]-Glucose), wie in Abbildung 3 dargestellt.
  4. Beginnen Sie die Infusion der Kochsalzlösung gewaschen Erythrozyten zuerst. Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit auf das Gesamtvolumen des Blutes wird über die Dauer der Studie entnommen (zB wenn insgesamt 500 ul Blut über 120 min der Studie werden abgetastet, die Infusionsgeschwindigkeit auf 4,2 ml / min) zu ersetzen. Im Gegensatz zu den anderen Infusionen, ist die Erythrozyten-Lösung rot. Infusion dieser Lösung lässt erstmals für jeden potentiellen Widerstand oder Hindernisse in der Infusion Linien identifiziert und korrigiert werden.
  5. Sobald die Erythrozyten-Infusionslösung erreicht die Maus, beginnen die Insulin-undGlucoseinfusionen. Dies ist nun t = 0 min. Insulin ist bei einer konstanten, vorgegebenen Rate infundiert. Eine Insulin-Infusion von 4 mU • kg -1 • min -1 wird in der Regel zu unterdrücken endogenen Glukose-Produktion von 80-100% und stimulieren Glucose Verschwinden von 2-3 fache. Die anfängliche Glucose Infusionsrate (GIR) basiert auf der Grundlinie des Blutzuckerspiegels und die bisherigen Erfahrungen geschätzt.
  6. Wenn die Infusion [3-3 H] Glucose, kann man wählen, um die Tracer-Infusionsrate zu erhöhen, um den geschätzten Anstieg der Glucose-Umsatz (in der Regel eine 2-3 fache Erhöhung) übereinstimmen.
  7. In Anbetracht der hohen Rate von Glukose Umsatz in der Maus, sollte Blutproben aus dem arteriellen Linie nicht weniger als alle 10 min für die Messung von Glukose-Konzentration über die Dauer des Experiments erreicht werden. Passen Sie die GIR zu erzielen und beizubehalten Ziel Normoglykämie (Abbildung 3C). Dieses Ziel kann je nach Modell oder die Ziele der Studie. Ein gutes Ziel glucose Konzentration beträgt 150 mg • dL-1, da dies ein typisches 6h gefastet Blutzuckerspiegel für einen Chow-fed C57BL/6J Maus ist.
  8. Das Ziel ist, Normoglykämie schnell zu erreichen, idealerweise innerhalb der ersten 40-50 min, und in Glukose und GIR stabil durch den Beginn der Steady-State-Periode (t = 80 min) haben.
  9. Wenn die Infusion [3 bis 3 H] Glukose, erhalten zusätzliche Blut bei t = 80, 90, 100, 110 und 120 min für die Messung von Plasma [3 bis 3 H]-Glucose spezifische Aktivität.
  10. Sammeln Sie zusätzliche Blut bei t = 100 und 120 min für die Messung der Plasma-Insulin und andere Hormone (s) oder Metaboliten (s). Bei t = 110 min, ziehen Blut in eine Heparin-oder EDTA-behandelte Kapillare zur Messung der Klemme Hämatokrit.
  11. Nach der Probe zum Zeitpunkt t = 120 min entnommen, 2 [14 C] Desoxyglucose können für die Messung von Gewebe-spezifische Glukoseaufnahme verabreicht werden. Verwalten einer 12 uCi Bolus in den Bolus Linie an die Gurgel Entnahmeleitung (Abbildung 3B
  12. Erhalten Blutproben (50 ul) aus dem arteriellen Entnahmeleitung bei t = 2, 15, 25 und 35 min nach der Verabreichung des Bolus für die Messung von Plasma-2 [14 C] Desoxyglucose Ebenen.
  13. Nach der letzten Probe, betäuben die Maus mit einer Infusion von Pentobarbital direkt in der arteriellen Linie gegeben. Schnell zu zerlegen jedes Gewebe, das für die Beurteilung der Glukoseaufnahme (zB Skelettmuskeln von verschiedenen Arten, Fettgewebe, Herz, Gehirn) und alle anderen Gewebe (zB Leber, Milz, Nieren) erforderlich. Snap freeze Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur Analyse. Tissue Glukose wird durch die Messung der Akkumulation von phosphorylierten 2 analysiert [14 C] Desoxyglucose im gefrorenen Gewebe und das Verschwinden von 2 [14 C] Desoxyglucose aus dem Plasma.

4. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel der Ergebnisse aus einer Insulin-Clamp Experiment erhalten ist in Abbildung 4 dargestellt.Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit einer fettreichen Ernährung zu fällen Insulinresistenz bei Mäusen. Alle Präsentationen von Insulin Clamp Ergebnisse müssen folgende zu sein interpretierbar: einen zeitlichen Verlauf des Blutzuckerspiegels, eine zeitliche Verlauf der GIR-und Plasma-Insulinspiegel (Baseline und Klemme). Wie hier gezeigt, Nüchternglukose (Abbildung 4A) und Insulin (4C) sind höher in Mäusen eine fettreiche Ernährung, bezeichnend für die Insulinresistenz. Präsentation einer zeitlichen Verlauf der Blutzuckerwerte während der Klammer-Studie (Abbildung 4A) ermöglicht es dem Leser zu beurteilen, wie gut Normoglykämie aufrechterhalten wurde, das ist bezeichnend für die Qualität der Klemme. Ebenso erlaubt eine zeitliche Verlauf der GIR (Abbildung 4B) der Leser zu bestimmen, wie schnell ein steady-state erreicht wurde. Es werden die Daten als Zeit-Verläufe ist wesentlich informativer als die herkömmliche Praxis in der Maus-Insulin Clamp Literatur präsentiert einen 2-stündigen Experimentsals eine einzige Bezugspunkt darstellt Mittelwerte aus einer undefinierten "Klammer"-Periode (4-13). Im vorliegenden Beispiel wurden Blutzuckerspiegel gleich zwischen der Steuerung und fettreichen-fed-Gruppen, aber die GIR war signifikant niedriger in den hohen Fett-gefütterten Gruppe (Abbildung 4B). Dies ist ein Hinweis auf eine Wertminderung in Ganzkörper-Insulinwirkung. Clamp Insulinspiegel waren ebenfalls höher in den hohen Fett-gefütterten Gruppe (4C), weitere unterstützende Anwesenheit eines Insulin-resistenten Phänotyp in diesen Mäusen. Der Einsatz von Isotopen-Tracer-Infusionen können für die Beurteilung der Wirkung von Insulin in bestimmten Geweben. [3 bis 3 H]-Glucose wird verwendet, um die Rate der endogenen Glukose Aussehen (Endora), die einen Index der Glukoneogenese in der Leber (HGP) und die Rate der Ganzkörper-Glukose Verschwinden (Rd) ist zu schätzen. Während Insulin vollständig unterdrückt HGP in Mäusen der Kontrollgruppe ist dies in Mäusen eine fettreiche Ernährung (Abbildung 4D) beeinträchtigt. Ebenso die Fähigkeit inSulin zu Rd in Kontroll-Mäusen zu stimulieren ist bei Mäusen, die eine fettreiche Ernährung (Abbildung 4E) gefährdet. 2 [14 C] Desoxyglucose wird verwendet, um die Glukose Stoffwechsel-Index (Rg), ein Maß für die Gewebe-spezifische Glukoseaufnahme zu beurteilen. Wie in diesem Beispiel zu sehen, ist das Insulin-stimulierte Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur bei Mäusen eine fettreiche Ernährung (Abbildung 4F) beeinträchtigt.

Abbildung 1
Abbildung 1: Herstellung von arteriellen (A) und (B) Kathetern und (C) MASA tm. Arterielle Katheter werden durch Einfügen eines 1,3 cm Stück PE-10 ca. 3 mm in eine 6 cm Stück von 0,012 "ID Silastic vorbereitet. Die PE-10 Spitze abgeschrägt ist, so dass die Länge von der Schräge an der Silastic 0,9 cm ist. Venöse Katheter werden, indem ein kleines Stück von 0,020 "ID Silastic 1,1 cm aus dem abgeschrägten Ende einer 6 cm Stück von 0,012" ID Silastic gemacht. Die 0,020 "ID Silastic Stück wirkt wie eine einstweilige Wulst zu se Heilung des Katheters an die Halsschlagader. Für die Montage der MASA tm, die jeweils aus zwei 1,3 cm 25-Gauge-Anschlüsse ist in jeweils zwei 3 cm Stücke von PE-20 eingesetzt. Diese werden durch ein kleines Stück von 0,040 "ID Silastic statt. Die Anschlüsse zu einem Winkel von 120 ° gebogen sind und getrennt in einem 45 ° Winkel. Die gesamte Baugruppe in der medizinischen Silikonkleber eingetaucht ist.

Abbildung 2
Abbildung 2: katheterisiert Maus. Katheter werden operativ in die linke Halsschlagader und die rechte Jugularvene implantiert. Die freien Enden der Katheter sind hinter dem Kopf externalisiert und an einen MASA tm. Die MASA tm wird subkutan zwischen die Schulterblätter eingefügt. Dies ermöglicht Gefäßzugang bei Insulin-Clamp-Experimenten ohne die Notwendigkeit zu bändigen, Griff oder betäuben die Maus.

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Abbildung 3: Darstellung des Aufbaus und Zeitplan für eine Insulin-Clamp Experiment. Die Maus ist mit einem Dual-Channel-Schwenk, der als Drehscheibe für Infusions-und Sampling-Spritzen Taten angebunden. Typische Konfigurationen für Experimente nicht mit Tracer-Infusionen (A) und mit beiden [3 bis 3 H] Glucose und 2 [14 C] Desoxyglucose (B) gezeigt. Eine Zeitleiste von Verfahren für den Aufbau und die Durchführung der Insulin-Klemme (C) wird ebenfalls angezeigt. Während der Klemme, Blutproben ( Blut ) Werden alle 10 min, um den Blutzucker zu messen. Die GIR ist es daher, Normoglykämie pflegen angepasst. Die Proben für die Baseline-Blutzucker-, Plasma-Insulin und Plasma [3 bis 3 H]-Glucose sind bei t = -15 und -5 min genommen. Proben für die Klammer Plasma [3 bis 3 H]-Glucose sind bei t = 80, 90, 100, 110 und 120 und für Klemm Insulin bei t = 100 und 120 min entnommen. 2 [14 C] Desoxyglucose ist nach der Probe bei t = 120 min und b verabreichtlood ist bei t = 2, 15, 25 und 35 min nach gesammelt. Die Gewebe werden nach dem t = 35 min entnommen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Ergebnisse aus einer Insulin-Clamp Experiment verglichen Mäuse auf einem Kontroll-Diät (Chow) auf Mäuse auf eine fettreiche Diät (HFD). Zeitlicher Verlauf der arteriellen Glukose (A) und GIR (B), Baseline und klemmen Insulin (C), Endora (D), und Rd (E) und Skelettmuskel (gastrocnemius und vastus lateralis) Rg (F) gezeigt. Alle Ergebnisse zeigen die Wirkung der fettreichen Ernährung zu einer Insulinresistenz induzieren.

Discussion

Die hyperinsulinämische-euglykämische Clamp-oder Insulin-Clamp, gilt weithin als der "Goldstandard"-Methode zur Beurteilung der Wirkung von Insulin in vivo. Diese Technik hat mehrere Arten einschließlich des Menschen, Hunde, Ratten und Mäusen angewendet worden. Angesichts der wachsenden Zahl von transgenen Mausmodellen für Stoffwechselerkrankungen, hat die Miniaturisierung der Technik für den Einsatz in der Maus bedeutende Fortschritte zu metabolischer Forschung zur Verfügung gestellt.

Während die Konzepte hinter den Insulin-Clamp unkompliziert sind, in der Praxis gibt es verschiedene Ansätze für die Durchführung von Insulin Clamp-Experimenten. Dies ist kein trivialer Punkt, denn die Art und Weise, in der das Experiment durchgeführt wird beeinflusst Ergebnisse 1. Hier präsentieren wir Ihnen das Protokoll von der Vanderbilt MMPC verwendet. Der wesentliche Unterschied zwischen unserem Protokoll und das der anderen ist, dass wir einen arteriellen Katheter verwenden für den Erhalt von Blutproben. Dies ist im Gegensatz zu den weiter verbreitete Ansatz der obtaining Blutproben durch Abtrennen der Spitze des Schwanzes 4, 7, 11, 12, 14-17. Der Vorteil der Entnahme aus einem arteriellen Katheter ist, dass das Experiment in einer bewussten und hemmungslos Maus durchgeführt wird. Probenahme aus dem Schwanz erfordert oft Zurückhaltung und erhöht Indizes von Stress, wenn große Blut-Proben 1 erworben werden. Stress Hormone stimulieren endogenen Glukose-Produktion und beeinträchtigen Glucoseverwertung 18, 19, möglicherweise, um den Eindruck einer Insulin-resistenten Phänotyp. Probenahme aus den abgetrennten Schwanz benötigen möglicherweise spezielle Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses Genehmigung wegen ihrer stressigen Natur. Die arterielle Katheterisierung Verfahren wurde entwickelt, um die Belastung der Maus Abtrennen des Schwanzes zu vermeiden.

Ein wesentlicher Aspekt der Durchführung Insulin Klammern ist die Fähigkeit, Normoglykämie aufrecht zu erhalten. Es gibt keine Algorithmen, die korrekt vorhersagen können, wie die GIR basierend auf Blutzuckerwerte angepasst werden sollte. Wie die Chirurgie,Personal führt Insulin Clamp-Experimenten wird tüchtig in die Aufrechterhaltung angemessener Normoglykämie nur durch Erfahrung. Es ist wichtig zu beachten, dass aufgrund ihrer höheren Stoffwechselrate die Daten von der Maus-Studien gewonnen werden grundsätzlich laut. Dies macht die komplette Präsentation von Daten, einschließlich Zeit-Verläufe von Glukose und GIR und absolute Werte für Plasma-Insulin, Endora, Rd und Rg entscheidend für die Fähigkeit von jedem Leser die Ergebnisse zu interpretieren. Die hohe Glukose-Flussraten in der Maus (ca. 5-mal höher als die Rate bei Menschen) garantieren eine hohe Frequenz von Glukose Probenahme. Während das Blutvolumen der Maus beschränkt ist, ist ein Minimum Sampling-Frequenz von einmal alle 10 Minuten notwendig, um sicher sein, dass eine ausreichende Klammer erreicht worden ist.

Wie in Abbildung 4 dargestellt ist, kann Klemme Insulinspiegel werden unterschiedlich zwischen den Gruppen. Faktoren wie Ernährung Interventionen transgenen Manipulationen oder Unterschiede in der Hintergrund-Stämme können sich auf fasting Insulinspiegel, die anschließend beeinflussen können Klemme Insulinspiegel. Interpretation der Ergebnisse, wenn Klemme Insulinspiegel unterschiedlich sind problematisch sein kann. Dies kann experimentell, indem Pilotversuchen zur Insulin-Infusion Preise erzielen, die entsprechende Klemme Insulinspiegel zwischen den Gruppen zu erreichen wählen Sie angesprochen werden. Alternativ können Somatostatin zur Pankreas-Sekretion hemmen und Insulin und Glukagon kann experimentell kontrollierten Raten ersetzt werden. Dieser Ansatz wird häufig auch in Insulin-Klemmen an Ratten als Mäuse getan. Wenn dieser experimentellen Ansätze nicht getroffen werden, kann der Steady-State-GIR der Klemme Insulinspiegel normalisiert werden, oder eine Insulin-Empfindlichkeit-Index (S I) kann von Clamp-Daten wie S I = GIR / (G • DELTA), wo abgeleitet werden G ist die Steady-State-Glucose-Konzentration und DELTA ist der Unterschied zwischen Fasten und Klemme Insulin-Konzentrationen. Eine Annahme entweder mit Ansatzes ist, dass die Klemme Insulin erreicht wirdinnerhalb des Bereichs, wo die Insulinsensitivität linear auf den Insulinspiegel ist nach der Gruppe untersucht verwandt. Diese letztere Annahme ist nicht anwendbar, beim Vergleich von Insulin resistent und Insulin empfindlicher Gruppen. Idealerweise sollte ein Insulin-Dosis-Wirkungs-Kurve generiert, um die entsprechenden Insulin-Infusion zu wählen. Da jedoch die Voraussetzung für weitere Experimente, ist dies selten getan.

Die Vielseitigkeit von arteriellen Katheter zur Verfügung gestellt erstreckt sich auf experimentelle Ansätze jenseits euglykämische Klammern. Zum Beispiel kann hyperglycemic Klammern, in denen Glukose bei einem variablen Zinssatz zu Hyperglykämie gegenüber Nüchternglukose halten infundiert wird, verwendet werden, um endogenen Pankreasfunktion in vivo 2, 20, 21 zu beurteilen. Die Messung der ersten Phase der Insulinsekretion bei diesem Test erfordert häufige Übernahme von Blutproben (dh alle 2-5 min), was nicht machbar ist, wenn den Erhalt einer Probe von der Spitze des Schwanzes. Darüber hinauserhöhten Katecholaminen aus tail Probenahme beeinträchtigen können Insulinsekretion und erhöhen Glucagonsekretion 22. Das Insulin Clamp-Protokoll kann auch so modifiziert, dass für die Glukosewerte zu relativen Hypoglykämien fallen zu Gegen-regulatorische Antwort 2, 23, 24 zu beurteilen. Arterielle Katheter können auch verwendet werden, um die Dynamik des Glukosestoffwechsels während des Trainings 25-30 beurteilen. Das ist deutlich vorteilhaft gegenüber herkömmlichen Ansätzen bei einzelnen Zeitpunkten durchgeführt Pre-und Post-Sport oder in isolierten Muskeln ex vivo. Die hier vorgestellten Verfahren kann auch verwendet werden, um nicht nur Glukose, aber auch Fettsäure-Stoffwechsel 31 zu beurteilen.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Grant 5-U24-DK059637-10 der Vanderbilt Maus Metabolic Phänotypisierung Center unterstützt.

References

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Comments

21 Comments

  1. Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 8:09 AM
  2. Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala

    Reply
    Posted by: Julio A.
    November 29, 2012 - 8:46 AM
  3. Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona

    Reply
    Posted by: Rona S.
    November 29, 2012 - 9:39 AM
  4. Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 26, 2014 - 1:17 PM
  5. Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 26, 2014 - 2:06 PM
  6. Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,

    Reply
    Posted by: Teayoun K.
    March 28, 2014 - 12:20 PM
  7. Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    March 28, 2014 - 3:42 PM
  8. Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.

    Reply
    Posted by: Joseph C.
    April 8, 2014 - 5:11 PM
  9. Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 11, 2014 - 4:15 PM
  10. Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    April 15, 2014 - 11:17 AM
  11. Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    April 16, 2014 - 10:32 AM
  12. Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 12:32 PM
  13. Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.

    Reply
    Posted by: Carlo M.
    October 2, 2014 - 1:29 PM
  14. Thanks. I will try it!

    Kai

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 4:11 PM
  15. Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:05 PM
  16. Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:25 PM
  17. Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:38 PM
  18. We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.

    Reply
    Posted by: Julio A.
    October 2, 2014 - 1:31 PM
  19. Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 2:56 PM
  20. Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    October 2, 2014 - 1:47 PM
  21. Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.

    Reply
    Posted by: Kai M.
    November 4, 2014 - 1:04 PM

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