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बंदी कम्पाउँड की घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की cilia में फ़्लैश Photolysis

Neuroscience

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Summary

बंदी यौगिकों के Photolysis विभिन्न physiologically सक्रिय यौगिकों की एकाग्रता में तेजी और स्थानीय बढ़ जाती है के उत्पादन की अनुमति देता है. यहाँ, हम बताते हैं कैसे प्राप्त करने के लिए पैच दबाना बंदी शिविर के photolysis के साथ संयुक्त या अलग माउस घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स में घ्राण पारगमन के अध्ययन के लिए Ca बंदी रिकॉर्डिंग.

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Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

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Abstract

बंदी यौगिकों के Photolysis विभिन्न physiologically सक्रिय एक यौगिकों की एकाग्रता में तेजी और स्थानीय बढ़ जाती है के उत्पादन की अनुमति देता है. बंदी यौगिकों एक रासायनिक पिंजरे है कि पराबैंगनी प्रकाश की एक फ्लैश के द्वारा तोड़ा जा सकता है है physiologically निष्क्रिय कर दिया अणु होते हैं. यहाँ, हम बताते हैं कि कैसे प्राप्त करने के लिए पैच दबाना dissociated माउस घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स में घ्राण पारगमन के अध्ययन के लिए बंदी यौगिकों के photolysis के साथ संयुक्त रिकॉर्डिंग. घ्राण पारगमन की प्रक्रिया (चित्रा 1) घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स, जहां रिसेप्टर्स करने के लिए बाध्य odorant शिविर की वृद्धि हुई है कि चक्रीय nucleotide-gated (सीएनजी) 2 चैनल खोलता है की ओर जाता है है की cilia में जगह लेता है. सीएनजी चैनलों के माध्यम से Ca प्रविष्टि Ca सक्रिय सीएल चैनल सक्रिय. हम बताते हैं कैसे माउस घ्राण 3 उपकला और बंदी 4 शिविर का photolysis या Ca बंदी 5 से सीएनजी चैनलों या Ca सक्रिय सीएल चैनलों को सक्रिय कैसे से न्यूरॉन्स अलग कर देना करने के लिए </> समर्थन. हम एक फ्लैश 6,7 दीपक उपयोग सिलिअरी क्षेत्र को रिहा कर देना शिविर या Ca पराबैंगनी चमक जबकि पैच दबाना रिकॉर्डिंग पूरे सेल वोल्टेज क्लैंप 8-11 विन्यास में मौजूदा उपाय करने के लिए लिया जाता है लागू है.

Discussion

बंदी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त यौगिकों के फ्लैश photolysis physiologically सक्रिय दोनों के अंदर और बाहर कोशिकाओं के अणुओं की एकाग्रता में तेजी और स्थानीय कूदता प्राप्त करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. बंदी compounds1 के कई प्रकार संश्लेषित किया गया है, और इस तकनीक सुसंस्कृत आयन चैनलों कि या सक्रिय किया जा सकता उपलब्ध बंदी 11 यौगिकों में से कुछ के photolysis द्वारा modulated व्यक्त कोशिकाओं सहित कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.

बंदी यौगिकों के Photolysis निकट यूवी प्रकाश के उच्च तीव्रता के दालों की आवश्यकता है एक कम समय में अणुओं की एक पर्याप्त राशि को रिहा कर देना. विभिन्न प्रकाश स्रोतों का इस्तेमाल किया जा सकता है: एक लगातार संचालित पारा या क्सीनन चाप दीपक एक शटर द्वारा नियंत्रित है और माइक्रोस्कोप, एक क्सीनन फ़्लैश दीपक, यूवी लेजर, और हाल ही में विकसित उच्च शक्ति यूवी प्रकाश उत्सर्जक डायोड की epifluorescent बंदरगाह के लिए युग्मित (एलईडी ). प्रकाश स्रोत के प्रत्येक प्रकार के फायदे और disadvanविशिष्ट अनुप्रयोग के लिए और तंत्र की लागत के लिए अनुसार tages. एक फ्लैश दीपक की तुलना में, लगातार संचालित दीपक एक कम तीव्रता प्रकाश और इसलिए एक शटर द्वारा नियंत्रित प्रकाश दालों की अवधि है एमएस के कई सैकड़ों के लिए वृद्धि की जानी चाहिए uncaged अणुओं की एक पर्याप्त राशि प्राप्त करने के. यूवी लेज़रों बहुत महंगे हैं. फ्लैश photolysis के लिए उच्च शक्ति यूवी 14 एल ई डी हाल ही में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और अन्य तरीकों के लिए एक अच्छा विकल्प प्रदान कर सकता है. हालांकि, फ्लैश लैंप की एक और लाभ यह है कि वे यूवी एल ई डी की तुलना में एक व्यापक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है, विभिन्न वर्णक्रमीय विशेषताओं के साथ बंदी यौगिकों मुख्य लाभ के लिए हमारे आवेदन में uncaging लिए एक क्सीनन फ़्लैश दीपक का उपयोग कर रहे हैं के कई प्रकार के के उपयोग की अनुमति: एक अच्छा समय संकल्प, वास्तव में प्रकाश नाड़ी की अवधि के बारे में 1 एमएस है, एक व्यापक यूवी स्पेक्ट्रम कि अणुओं की विभिन्न रासायनिक गुणों के साथ photolysis के लिए उपयुक्त है, संभावना पैसा भी चुनने के लिएप्रकाश सिलिअरी क्षेत्र रोशन हाजिर nsion; संभावना को आसानी से विभिन्न प्रकाश तीव्रता 6 का चयन करें. इसके अतिरिक्त, क्सीनन फ़्लैश दीपक एक उचित कीमत है, यह आसानी से एक electrophysiological सेट अप में कार्यान्वित किया जाता है, और एक विशेष रखरखाव की आवश्यकता नहीं है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

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References

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