Author Produced

Flash Fotolys av Caged föreningar i Cilia av Olfactory sensoriska neuroner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fotolys i bur föreningar medger framställning av snabba och lokaliserade ökning av koncentrationen av olika fysiologiskt aktiva föreningar. Här visar vi hur du får patch-clamp inspelningar i kombination med fotolys av bur läger eller bur Ca för studier av luktsinnet transduktion i dissocierade mus lukt sensoriska nervceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fotolys i bur föreningar medger framställning av snabba och lokaliserade ökning av koncentrationen av olika fysiologiskt aktiva föreningar 1. Caged föreningar är molekyler som fysiologiskt inaktiva genom en kemisk bur som kan brytas genom en blixt av ultraviolett ljus. Här visar vi hur du får patch-clamp inspelningar i kombination med fotolys av bur föreningar för studier av luktsinnet transduktion i dissocierade mus lukt sensoriska nervceller. Processen med luktsinnet transduktion (Figur 1) sker i flimmerhåren i lukt sensoriska neuroner, där luktämnen bindning till receptorer leder till en ökning av cAMP som öppnar cyklisk nukleotid-medierade (CNG) kanaler 2. Ca inlägg via CNG kanaler aktiverar Ca-aktiverade Cl-kanaler. Vi visar hur man kan separera nervceller från mus luktepitel 3 och hur man aktiverar CNG-kanaler eller Ca-aktiverade Cl kanaler genom fotolys av bur cAMP 4 eller burar Ca 5 </ Sup>. Vi använder en blixt lampa 6,7 gälla ultraviolett blinkar i strålkroppen regionen att uncage cAMP eller Ca medan patch-clamp inspelningar vidtas för att mäta strömmen i hela-cellspänningen-clamp konfiguration 8-11.

Discussion

Flash fotolys av bur föreningar i kombination med patch-clamp inspelningar är en användbar teknik för att få snabb och lokala hopp i koncentrationen av fysiologiskt aktiva molekyler både inom och celler utanför. Flera typer av bur compounds1 har syntetiserats, och denna teknik kan tillämpas på olika typer av celler, inklusive odlade celler som uttrycker jonkanaler som kan aktiveras eller justeras efter fotolys av några av de inburade finns föreningar 11.

Fotolys i bur föreningar kräver pulser med hög intensitet nära UV-ljus för att uncage en tillräcklig mängd molekyler i en kort tid. Olika ljuskällor kan användas: en kontinuerlig drift kvicksilver eller xenon båge lampa som styrs av en slutare och kopplad till epifluorescent hamnen i mikroskop, en Xenon blixt lampa, en UV-laser, och den nyligen utvecklade hög effekt UV-lysdiod (LED ). Varje typ av ljuskälla har sina fördelar och nackdelarnaTages enligt de specifika ansökan och kostnaden för apparaten. Jämfört med en blixtlampa, den ständigt drivs lampor har en lägre ljusintensitet och därmed längden på ljuspulser som kontrolleras av en slutare måste ökas upp till flera hundra ms för att få en tillräcklig mängd uncaged molekyler. UV-lasrar är mycket dyra. Hög effekt UV-lysdioder 14 för flash fotolys har nyligen kommersiellt tillgängliga och kan ge ett bra alternativ till andra metoder. Det är dock en fördel med blixt lampor att de har en bredare emissionsspektrum än UV-lysdioder, som medger användning av flera olika typer av burar föreningar med olika spektrala egenskaper De främsta fördelarna att använda en Xenon blixt lampa för uncaging i vår ansökan är: en bra tidsupplösning, ja hur länge ljuset puls är cirka 1 ms, ett brett UV-spektrumet som är lämplig för fotolys av molekyler med olika fotokemiska egenskaper, möjligheten att välja dimension av ljuset plats för att belysa strålkroppen regionen, möjlighet att enkelt välja olika ljusintensiteter 6. Dessutom har Xenon-blixt-lampan en rimlig kostnad, är det lätt att genomföras i en elektrofysiologisk inställning, och inte kräver en speciell skötsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics