Author Produced

Flash Fotolyse av Caged forbindelser i Cilia av olfactory sensoriske nevroner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fotolyse av caged forbindelser gjør at produksjonen av raske og lokalisert økning i konsentrasjonen av ulike fysiologisk aktive forbindelser. Her viser vi hvordan du anskaffer patch-clamp opptak kombinert med fotolyse av caged cAMP eller bur Ca for studiet av olfactory transduksjon i dissosiert mus olfactory sensoriske nevroner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fotolyse av caged forbindelser gjør at produksjonen av raske og lokalisert økning i konsentrasjonen av ulike fysiologisk aktive forbindelser en. Caged forbindelser er molekyler laget fysiologisk inaktive ved en kjemisk bur som kan brytes av en flash av ultrafiolett lys. Her viser vi hvordan du anskaffer patch-clamp opptak kombinert med fotolyse av caged forbindelser for studiet av olfactory transduksjon i dissosiert mus olfactory sensoriske nevroner. Prosessen med olfactory transduksjon (Figur 1) foregår i flimmerhårene av olfactory sensoriske nevroner, hvor odorant binding til reseptorer fører til økning av cAMP som åpner syklisk nukleotid-gated (CNG) kanaler 2. Ca oppføringen gjennom CNG kanaler aktiverer Ca-aktivert Cl kanaler. Vi viser hvordan man skal distansere neuroner fra musen olfactory epitelet 3 og hvordan du kan aktivere CNG kanaler eller Ca-aktivert Cl kanaler ved fotolyse av caged cAMP 4 eller bur Ca 5 </ Sup>. Vi bruker en flash-lampe 6,7 til å søke ultrafiolett blinker til ciliary regionen for å uncage cAMP eller Ca mens patch-clamp opptakene er tatt for å måle strømmen i hele-cellers spenning-klemme konfigurasjon 8-11.

Discussion

Flash fotolyse av caged forbindelser kombinert med patch-clamp opptak er en nyttig teknikk for å oppnå raske og lokale hopper i konsentrasjonen av fysiologisk aktive molekyler både innenfor og utenfor cellene. Flere typer bur compounds1 har blitt syntetisert, og denne teknikken kan brukes til ulike typer celler, inkludert dyrkede celler uttrykker ionekanaler som kan aktiveres eller modulert av fotolyse av noen av de tilgjengelige bur forbindelser 11.

Fotolyse av caged forbindelser krever pulser med høy intensitet nær UV-lys for å uncage en tilstrekkelig mengde molekyler på kort tid. Ulike lyskilder kan brukes: en kontinuerlig operert kvikksølv eller xenon arc lampe styres av en lukker og koplet til epifluorescent port av mikroskopet, en Xenon flash lampe, et UV-laser, og den nylig utviklede høy effekt UV lys emitting diode (LED ). Hver type lyskilde har fordeler og vanskeligstiltekurransemessige fortrinn i henhold til den spesifikke applikasjonen og til kostnaden av apparatet. Sammenlignet med en flash lampe, kontinuerlig opererte lamper har en lavere lysintensitet og dermed varigheten av lys pulser kontrollert av en lukker må økes opptil flere hundre ms å få en tilstrekkelig mengde uncaged molekyler. UV lasere er svært kostbart. Høy effekt UV LED 14 for flash fotolyse er nylig kommersielt tilgjengelig og kan gi et godt alternativ til andre metoder. Men en fordel med flash lamper at de har en bredere utslipp spekter enn UV LEDs, som tillater bruk av flere typer bur forbindelser med ulike spektrale kjennetegn De største fordelene å bruke en Xenon-blits lampe for uncaging i søknaden vår er: en god tidsoppløsning, ja varigheten av lyset puls er ca 1 ms; et bredt UV-spekter som er egnet for fotolyse av molekyler med ulike fotokjemiske egenskaper; muligheten til å velge kronension av den lyse flekken til å lyse opp ciliary regionen, muligheten til enkelt å velge forskjellige lys intensiteter 6. I tillegg har Xenon flash-lampe en rimelig pris, er det lett implementeres i en elektrofysiologiske oppsett, og krever ikke spesielt vedlikehold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
  2. Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
  3. Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
  4. Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
  5. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
  6. Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
  7. Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
  8. Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
  9. Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
  10. Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
  11. Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
  12. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
  13. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
  14. Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics