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Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Neuroscience

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Summary

Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di cAMP in gabbia o in gabbia Ca per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi.

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Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (55), e3195, doi:10.3791/3195 (2011).

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Abstract

Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attive 1. Composti in gabbia sono molecole fatte fisiologicamente inattivo da una gabbia chimico che può essere interrotta da un lampo di luce ultravioletta. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di composti in gabbia per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi. Il processo di trasduzione olfattiva (Figura 1) si svolge nel ciglia di neuroni sensoriali olfattivi, dove odoranti legandosi ai recettori porta all'aumento di cAMP che si apre nucleotidi ciclici (CNG) canali 2. Ingresso di Ca attraverso canali CNG attiva Ca-attivati ​​i canali Cl. Mostriamo come dissociare i neuroni dell'epitelio olfattivo del mouse 3 e come attivare i canali CNG o Ca-attivati ​​i canali Cl da fotolisi di cAMP in gabbia in gabbia Ca 4 o 5 </ Sup>. Noi usiamo una lampada flash 6,7 per applicare lampeggia ultravioletti alla regione ciliare di uncage cAMP o Ca mentre patch-clamp registrazioni sono prese per misurare la corrente in tutta la cellula-voltage-clamp configurazione 8-11.

Discussion

Flash fotolisi di composti in gabbia in combinazione con registrazioni patch-clamp è una tecnica utile per ottenere salti rapidi e locali della concentrazione di molecole attive fisiologicamente sia all'interno che all'esterno delle cellule. Diversi tipi di compounds1 in gabbia sono stati sintetizzati, e questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di cellule, comprese le cellule in coltura esprimono canali ionici che possono essere attivate o modulata da fotolisi di alcuni dei composti disponibili in gabbia 11.

Fotolisi di composti in gabbia necessita di impulsi ad alta intensità di luce UV vicino a uncage una quantità sufficiente di molecole in breve tempo. Varie fonti di luce può essere utilizzato: un funzionamento continuo a vapori di mercurio o xeno lampada controllata da un otturatore e accoppiato alla porta epifluorescente del microscopio, un flash Xenon lampada, un laser UV, e il recente sviluppo UV ad alta potenza diodo luminoso (LED ). Ogni tipo di sorgente luminosa ha vantaggi e svantaggitaggi in base alla specifica applicazione e il costo dell'apparato. Rispetto ad una lampada flash, le lampade continuamente impiegati hanno un minore intensità della luce e quindi la durata degli impulsi di luce controllata da un otturatore deve essere aumentata fino a diverse centinaia di ms per ottenere una sufficiente quantità di molecole di Uncaged. I laser UV sono molto costosi. Ad alta potenza UV LED 14 per fotolisi flash sono recentemente disponibili in commercio e potrebbe fornire una buona alternativa ad altri metodi. Tuttavia, un vantaggio di lampade flash è che hanno un ampio spettro di emissione rispetto ai LED UV, permettendo l'uso di diversi tipi di composti in gabbia con differenti caratteristiche spettrali I principali vantaggi di utilizzare una lampada Xenon flash per uncaging nella nostra applicazione sono: una buona risoluzione temporale, infatti la durata di un impulso di luce è di circa 1 ms, un ampio spettro UV che è adatto per fotolisi di molecole con differenti proprietà fotochimiche, la possibilità di scegliere il centesimoESPANSIONE del punto luce per illuminare la regione ciliare, la possibilità di selezionare facilmente diverse intensità di luce 6. Inoltre, il flash Xenon-lampada ha un costo ragionevole, è facilmente implementata in un elettrofisiologico set-up, e non richiede una manutenzione particolare.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter module flash lamp to microscope Rapp OptoElectronic FlashCube 70
Air table TMC MICRO-g 63-534
Digitizer Axon Instruments Digidata 1322A
Data Acquisition Software Axon Instruments pClamp 8
Data Analysis Software WaveMetrics Igor
Mirror for adapter module Rapp OptoElectronic M70/100
Electrode holder Axon Instruments 1-HL-U
Faraday’s cage Custom Made
Filter cube Olympus Corporation U-MWU Excitation filter removed
Flash lamp Rapp OptoElectronic JML-C2
Forceps Dumont #55 World Precision Instruments, Inc. 14099
Glass capillaries World Precision Instruments, Inc. PG10165-4
Glass bottom dish World Precision Instruments, Inc. FD35-100
Illuminator Olympus Corporation Highlight 3100
Inverted microscope Olympus Corporation IX70
Micromanipulators Luigs & Neumann SM I
Micropipette Puller Narishige International PP-830
Monitor HesaVision MTB-01
Neutral density filters Omega Optical varies
Objective 100X Carl Zeiss, Inc. Fluar 440285 Either Zeiss or Olympus
Objective 100X Olympus Corporation UPLFLN 100XOI2 Either Zeiss or Olympus
Optical UV shortpass filter Rapp OptoElectronic SP400
Patch-clamp amplifier Axon Instruments Axopatch 200B
Photo Diode Assembly Rapp OptoElectronic PDA
Quartz light guide Rapp OptoElectronic varies We use 600 μm diameter
Silver wire World Precision Instruments, Inc. AGT1025
Silver ground pellet Warner Instruments 64-1309
Xenon arc lamp Rapp OptoElectronic XBL-JML
Reagent Company Catalogue number
BCMCM-caged cAMP BioLog B016
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A8806
CaCl2 standard solution 0.1 M Fluka 21059
Caged Ca: DMNP-EDTA Invitrogen D6814
Cysteine Sigma-Aldrich C9768
Concanavalin A type V (ConA) Sigma-Aldrich C7275
CsCl Sigma-Aldrich C4036
DMSO Sigma-Aldrich D8418
DNAse I Sigma-Aldrich D4527
EDTA Sigma-Aldrich E9884
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P3911
KOH Sigma-Aldrich P1767
Leupeptin Sigma-Aldrich L0649
MgCl2 Fluka 63020
Papain Sigma-Aldrich P3125
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1274
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Sigma-Aldrich S5881
NaPyruvate Sigma-Aldrich P2256

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References

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