Eksperimentel Generering af Carcinoma-associerede fibroblaster (cafeer) fra Human brystkirtler fibroblaster

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Carcinoma-associeret fibroblaster (cafeer) rig på myofibroblasts stede i tumor stroma, spiller en vigtig rolle som drivkraft for tumorprogression. Vi udviklede en coimplantation tumor xengraft model for eksperimentelt at generere cafeer fra menneskelige brystkirtler fibroblaster. Protokollen beskriver, hvordan man etablerer CAF myofibroblasts, der erhverver en evne til at fremme tumorgenese.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Polanska, U. M., Acar, A., Orimo, A. Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts. J. Vis. Exp. (56), e3201, doi:10.3791/3201 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Carcinomer er komplekse væv består af neoplastiske celler og en ikke-kræft rum benævnt "stroma". Den stroma består af ekstracellulære matrix (ECM) og en række mesenchymale celler, inklusive fibroblaster, myofibroblasts, endotelceller, pericytes og leukocytter 1-3.

Den tumor-associerede stroma er lydhør over for betydelige paracrine signaler, der frigives ved omkringliggende carcinom celler. Under sygdomsforløbet, ofte stroma bliver befolket af carcinoma-associerede fibroblaster (cafeer), herunder et stort antal myofibroblasts. Disse celler har tidligere været udvundet fra mange forskellige typer af mennesker karcinomer for deres in vitro kultur. En delpopulation af cafeer adskiller sig gennem deres op-regulering af α-glat muskulatur actin (α-SMA) udtryk 4,5. Disse celler er et adelsmærke for "aktiverede fibroblaster ', der deler lignende ejendomme med myofibroblasts commonly observeret i såret, og fibrøse væv 6. Tilstedeværelsen af ​​denne myofibroblastic CAF delmængde er stærkt relateret til høj kvalitet maligniteter og forbundet med dårlig prognose hos patienter.

Mange laboratorier, herunder vores egen, har vist, at cafeer, når de injiceres med carcinom celler i nedsat immunforsvar mus, er i stand til væsentligt at fremme tumorgenese 7-10. Cafeer fremstillet af carcinoma patienter, dog ofte undergår ældning under formering i kultur begrænser hvor omfattende deres brug i hele løbende eksperimenter. For at løse dette problem, har vi udviklet en ny teknik til at eksperimentelt generere foreviget menneskelige brystkirtler CAF cellelinier (exp-cafeer) fra menneskelige brystkirtler fibroblaster, ved hjælp af en coimplantation bryst tumor xenograft model.

For at skabe exp-cafeer, forældrenes menneskelige brystkirtler fibroblaster, fremstillet af en reduktion mammoplasty væv, blev først immortalised med hTERT, den katalytiske subunit af telomerase holoenzyme, og konstrueret til at udtrykke GFP og en puromycin resistensgen. Disse celler blev coimplanted med MCF-7 humane brystcancer celler, der udtrykker en aktiveret Ras oncogene (MCF-7-ras celler) ind i en mus xenograft. Efter en inkubationstid in vivo, var det oprindeligt injiceret menneskelige brystkirtler fibroblaster udvundet fra tumorxenoplantater på grundlag af deres puromycin modstand 11.

Vi observerede, at beboeren menneskelige mælkekirtlen fibroblaster har differentieret, vedtage en myofibroblastic fænotype og erhvervet tumorfremmende egenskaber i løbet af tumorprogression. Det er vigtigt, disse celler, defineret som exp-cafeer, nøje efterligner den tumorfremmende myofibroblastic fænotype af cafeer isoleret fra bryst carcinomer dissekeret fra patienter. Vores tumor xenograft afledt exp-cafeer giver derfor en effektiv model til at studere biologi cafeer i human breast karcinomer. De beskrevne protokol kan også udvides til at generere og karakterisere forskellige CAF befolkninger stammer fra andre typer af menneskelig karcinomer.

Protocol

1. Isolering af primær dyrkede humane normale brystkirtler fibroblaster

Eksperimentelle procedurer til at isolere primære dyrkede humane normale brystkirtler fibroblaster er skitseret i Fig. 1A.

  1. Forbered cellen dissociation buffer, som beskrevet tidligere 12: Dulbecco ændrede Eagle er Medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS), penicillin-streptomycin (200 enheder / ml), collagenase type I (1 mg / ml) og hyaluronidase ( 125 enheder / ml).
  2. Vask brystvæv dissekeret af en reduktion mammoplasty (~ 0,5 gram) flere gange i fosfat bufferet saltvand (PBS). Hakke i vævet i små fragmenter (<1,5 mm 3) ved hjælp af sterile barberblade.
  3. Overfør væv fragmenter i en 15 ml koniske rør, der indeholder en passende mængde af ovenstående celle dissociation buffer (10 ml per 0,5 gram væv) og vortex i 1 min ved maksimal hastighed.
  4. Fordøje vævet fragmenter i cellen dissociation buffer feller 12-18 timer ved 37 ° C med langsom omrøring. * Bemærk, at der vil stadig være mange stykker af ufordøjet væv fragmenter tilbage i røret.
  5. Inkuber røret i 5 minutter ved stuetemperatur uden agitation. Overfør den resulterende stromale celle-beriget supernatant ind i en ny konisk rør ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette.
  6. Centrifuger stromal fraktion i 5 minutter ved 250 X g og resuspender cellepelleten i PBS. Centrifuger igen i 5 minutter ved 250 X g og resuspender cellepelleten i DMEM suppleret med 10% FCS. Kultur cellerne i DMEM indeholder 10% FCS i en 15 cm petriskål ved 37 ° C og 5% kuldioxid.
  7. Udbrede de celler, indtil sammenflydende. Det vil normalt tage 8-10 dage. Opbevar cellerne ved -80 ° C ved hjælp af frysning medium (10% dimethylsulfoxid og 20% ​​FCS i DMEM). Forbered 5 Frosne hætteglas som en original lager. Optø et hætteglas og udvide cellerne til at forberede 5 hætteglas for den sekundære bestanden indeholder fibroblaster inkuberet inden for 5 populationfordoblinger (PDS) for de efterfølgende eksperimenter. Disse procedurer minimere klonselektion og kultur stress der kan opstå ved længere vævskultur. * Bemærk, at P1.1-7 også kan bruges til at isolere cafeer fra bryst carcinomer opnås ved en mastektomi 12.

2. Generering af GFP-mærkede, puromycin-resistente, udødeliggjort humant normalt brystkirtler fibroblaster

  1. For at forevige den primære humane normale brystkirtler fibroblaster isoleres i P1.7), indføre en retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektor 12, udtrykker både hTERT og GFP. Kultur cellerne for 4-5 dage og derefter sortere GFP-positive celler ved hjælp af flowcytometri.
  2. Indførelse af en retroviral pBabe-Puro konstruere koder for en puromycin modstand genet ind i GFP-mærkede foreviget fibroblaster. Kultur cellerne i 5-7 dage i overværelse af puromycin (slutkoncentration: 1 mg / ml) at isolere GFP-positive (GFP +), puromycin-resistente (Puro R
  3. Dernæst at undersøge, hvorvidt disse fibroblaster producere aktive virus, som kan føre til den horisontale overførsel af gener koder for GFP og puromycin modstand, vokser 2.5x10 5 GFP + Puro R udødeliggjort menneskelige brystkirtler fibroblaster i en 6 cm petriskål i 2 dage.
  4. Filtrer medium betinget af disse fibroblaster med en sprøjte filter (porestørrelse: 0,45 μm) og tilføje den på 10T1 / 2 mus fibroblastic celler til 12 timer ved tilstedeværelsen af ​​protamin sulfat (5 mg / ml), som øger effektiviteten af ​​virus infektion. De mellemlange ændres derefter til 10% FCS-DMEM for yderligere 2 dage.
  5. Undersøg cellerne med en fluorescens mikroskopi. 10T1 / 2 celler inficeret med GFP virus vil blive GFP-positive. Forkæl også de celler med puromycin (1 mg / ml) i 5-7 dage og observere pladen eventuelle Puro R 10T1 / 2 celler er til stede og danner kolonier efter puromycin behandlingen.
  6. Bemærk, at horisontal gen TRANsfer ved aktiv virus produceret af forældrenes GFP + Puro R menneskelige brystkirtler fibroblaster kan gøre de omkringliggende murine celler og / eller carcinoma celler GFP + Puro R inden tumorxenoplantater. Dette kan hindre de processer for at isolere den oprindeligt injicerede GFP + Puro R menneskelige mamma fibroblaster fra tumorxenoplantater.

3a. Coinjection af menneskelige mammae fibroblaster med mammacancer celler ind i et immundefekte mus

Eksperimentelle procedurer for at generere exp-cafeer er illustreret i Fig. 1Ba.

  1. Bland 1x10 6 MCF-7-ras humane bryst carcinom celler og 3x10 6 GFP + Puro R, udødeliggjort menneskelige brystkirtler fibroblaster genereret på P2.2). Forbered de celler i 400 μl af dyrkningsmediet med 50% (v / v) Matrigel per injektion.
  2. Injicere cellen blandingen subkutant i et nedsat immunforsvar nude mus. Når cafeer udvindes uafhængigt af forskelligetumorer, implantat hver blandingen i højre og venstre flanker af flere mus.

3b. Injektion af humant mammae fibroblaster i et nedsat immunforsvar mus

  1. For at generere kontrol fibroblaster mod exp-cafeer, forberede 3x10 6 GFP + Puro R udødeliggjort menneskelige brystkirtler fibroblaster genereret på P2.2 i 400 μl af dyrkningsmediet med 50% (v / v) Matrigel per injektion (Fig. 1Bb). Bland ikke fibroblaster med carcinom celler.
  2. Implantere fibroblaster udarbejdet i P3b.1 ind subkutane steder af nøgne mus.

* Bemærk, at de podede fibroblaster vil danne fibroblastic væv, men ikke tumor under huden.

4a. Dissektion af tumor xenograft

  1. Euthanise musen husning en subkutan menneskelig brystkræft xenograft 42 dage post-implantation (Fig. 1Ba). * Bemærk, at når andre carcinom celler og / eller fibroblaster er coimplantedKan fibroblaster skal inkuberes i længere tid end 42 dage inden tumoren xenograft at indlede deres myofibroblastic fænotype.
  2. Harvest tumor xenograft fra flanken på musen ved stump dissektion ved hjælp af pincet og saks. Nedsænk tumorvæv i PBS.

4b. Dissektion af fibroblast xenograft

  1. Euthanise musen huser de fibroblast xenograft 42 dage post-implantation (Fig. 1Bb).
  2. Dissekere det subkutane fibroblast xenograft bruge pincet og saks. Placer fibroblastic væv i PBS. * Bemærk, at en fibroblast xenograft, der vises som et lille gennemsigtigt væv, kan være svært at finde under huden.

5. Forberedelse af primær dyrkede celler fra implanteret

  1. Brug en steril biosikkerhed kabinet at dissekere tumor (~ 0,5 gram) eller fibroblastic væv (~ 0,1 gram). Overfør fjernede væv på toppen af ​​en 15 cm kultur dish med 1 ml PBS. Hakke i vævet i små væv fragmenter (<1,5 mm 3) ved hjælp af sterile barberblade. * Bemærk, at hvis fibroblast xenograft vejer mindre end 0,1 gram, indsamle yderligere et par fibroblast implanteret, og bland dem sammen for at øge antallet af celler til isolation.
  2. Overfør væv fragmenter i en 15 ml koniske rør, der indeholder cellen dissociation buffer (10 ml per 0,5 gram væv) og vortex i 1 min ved maksimal hastighed.
  3. Inkubér cellesuspensionen for 3 timer ved 37 ° C med kontinuerlig langsom omrøring.

6. Isolering af puromycin-resistente celler i kultur

  1. Centrifuger cellesuspensionen dissocierede enten fra tumor eller fibroblast xenograft i 5 minutter ved 250 X g og resuspender cellepelleten i PBS. Centrifuger igen i 5 minutter ved 250 x g. Resuspender resulterende cellepelleten i 10% FCS-DMEM. Kultur cellerne i en 15 cm petriskål i overværelse af puromycin (1 mg / ml) ved 37 ° Cog 5% kuldioxid for at fjerne alle forurenende carcinom celler og / eller murine stromale celler. Udbrede de celler, indtil sammenflydende (2-4 uger). Opbevar cellerne ved -80 ° C ved hjælp af frysning medium. * Bemærk, at den resulterende Puro R celler, der er udpeget 42-dage gamle exp-CAF1 (Fig. 1Ba) eller kontrol fibroblastceller-1 celler (Fig. 1Bb), er udødelige og positiv for GFP. Det anbefales at undersøge, om disse celler producerer aktive virus ved hjælp af 10T1 / 2 celler, som beskrevet i P2.3-6.

7a. Isolering af exp-CaF2 celler i kultur

For yderligere at øge den aktiverede myofibroblastic fænotype af cafeer, bland den 42-dage gamle exp-CAF1 celler med MCF-7-ras celler og indsprøjter dem igen subkutant i en nøgen mus med yderligere perioder på 200 dage. Dissekere og adskille tumor xenograft i en enkelt-celle suspension og kultur cellerne i en 15 cm petriskål med 10% FCS-DMEM i overværelse af puromycin (1 mg / ml), som angivet i P6.1. Udbrede de celler, indtil sammenflydende (8-10 dage). Opbevar cellerne ved -80 ° C ved hjælp af frysning medium. Den resulterende Puro R-celler er navngivet 242-daggamle exp-CaF2 celler (Fig. 1Ba).

7b. Udvinding af kontrol fibroblast-2 celler i kultur

For at generere kontrol fibroblaster mod exp-CaF2 celler, injicere 42-dage gamle kontrol fibroblastceller-1 celler alene uden carcinom celler subkutant i en nøgen mus desuden for 200 dage. Dissekere og adskille fibroblastic vævet ind i en enkelt celle suspension og kultur cellerne i en 15 cm petriskål med 10% FCS-DMEM i overværelse af puromycin (1 mg / ml) som angivet i P6.1. Udbrede de celler, indtil sammenflydende (3-4 uger). Opbevar cellerne ved -80 ° C ved hjælp af frysning medium. Den resulterende Puro R-celler er navngivet kontrol fibroblastceller-2 celler (Fig. 1Bb).

8. Repræsentative resultater:

Kontrol fibroblast-2 og exp-CaF2 CELls, som er blevet udvundet fra bryst tumorxenoplantater, farves stærkt positiv for mesenchymale markører, herunder menneskeskabt specifikke vimentin, prolyl-4-hydroxylase, kollagen 1A, fibronektin, S100A4, og fibroblast overflade protein (Fig. 2A) 11, hvilket tyder på menneskelige oprindelse og mesenchymale arten af ​​disse celler. I modsætning hertil var cytokeratin, en markør for epitelceller, ikke farvet i disse GFP + fibroblaster (Fig. 2B). Disse resultater tyder derfor på, at den udpakkede exp-CaF2 og kontrol fibroblastceller-2 celler stamme fra forældrenes menneskelige mælkekirtlen fibroblaster begynde med indføres i musen implanteret.

Vigtigere er det, en højere andel af exp-CaF2 celler farvet positive for α-SMA og ekstracellulære matrix glycoprotein tenascin-C 5, som begge er markører for myofibroblasts i forhold til 42-dage gamle exp-CAF1 og kontrol fibroblastceller-2 celler (Fig . 2C, D) 11. Disse data tyder på, at hjemmehørende menneskelige brystkirtler fibroblaster gradvis udvikle sig til CAF myofibroblasts inden tumorxenoplantater.

Figur 1
Figur 1 Skematisk fremstilling af isolation af menneskelige brystkirtler fibroblaster. A) indskrænkning mammoplasty væv var hakket i sterile barberblade (P1.2) og overføres til en 15 ml konisk rør (P1.3). De små væv fragmenter blev fordøjet i cellen dissociation buffer (P1.4) og forberedt for kultur in vitro (P1.5-7). For at forevige den isolerede primære humane brystkirtler fibroblaster, en retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektor, udtrykker både hTERT og GFP, blev indført, og den deraf følgende GFP-positive celler blev sorteret ved hjælp af flowcytometri (P2.1). En retrovirale pBabe-Puro vektor der koder for en puromycin resistensgenet blev derefter indført i disse celler. Efter puromycin behandling,-GFP mærket (GFP +) puromycin-resistente (Puro R), immortalised menneskelige mamma fibroblaster blev isoleret (P2.2).

Ba) at generere exp-cafeer, GFP + Puro R udødeliggjort menneskelige brystkirtler fibroblaster var coinjected med MCF-7-ras mammacancer celler subkutant i en immundefekt nude mus (P3a). Tumor xenograft blev opereret på 42 dage efter implantation (P4a) og dissocierede i en enkelt-celle suspension (P5). Disse celler blev derefter dyrket in vitro i overværelse af puromycin at fjerne alle forurenende carcinom celler og mus stromale celler (P6). Den resulterende puromycin-resistente celler var kaldt eksperimentelt genereret CAF1 (exp-CAF1) celler. Disse celler, opereret 42 dage efter implantation, blev endnu engang blandet med MCF-7-ras celler og implanteres subkutant i en vært mus som før (P7a). Den resulterende tumor fik lov til at vokse i yderligere perioder på 200 dage, derefter dissekeret, adskilt, og dyrkes i overværelse af puromycin. Den isoleredepuromycin-resistente celler var betegnet exp-CaF2 celler (242 dage gamle).

Bb) at isolere eksportkontrol på celler mod exp-cafeer, GFP + Puro R udødeliggjort menneskelige brystkirtler fibroblaster blev injiceret subkutant i en nøgen mus som rene kulturer, uden at MCF-7-ras celler (P3b). Den fibroblastic væv, dissekeret 42 dage post-implantation (P4b), blev adskilt i encellede suspensioner (P5) og puromycin-resistente celler, som er opkaldt kontrol fibroblastceller-1 celler, blev isoleret som beskrevet tidligere (P6). Disse fibroblaster var igen implanteret subkutant i en nøgen mus uden MCF-7-ras celler desuden for 200 dage (P7b). Den fibroblastic væv blev dissekeret, adskilt, og dyrkes i overværelse af puromycin. Den isolerede puromycin-resistente celler var kaldt kontrol fibroblastceller-2 celler (242 dage gamle).

Figur 2
Figur 2 (B) I modsætning, pan-cytokeratin, en markør for epitelceller , er ikke påvist i exp-CaF2 celler, der udtrykker GFP (grøn). Cellekerner er farvet med 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blå). Skala bar, 50 m (henvist fra Kojima et al. 11)

(C) Immunofluorescens af exp-CaF2 celler og kontrol fibroblastceller-2 celler (kontrol f.) ved hjælp af antistoffer mod α-SMA (rød) eller tenascin-C (TN-C) (rød). Cellekerner er farvet med DAPI (blå). Skala bar, 50 μm. (D) 48% af exp-CaF2 celler pletten positive for α-SMA, mens 14% af 42-daggamle exp-CAF1 og 2,5% af kontrolgruppen fibroblast-2 cellepopulationer er positive for α-SMA. (Henvist fra Kojima et al.11)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Manglen på CAF-specifikke markører og graden af ​​heterogenitet observeret blandt cafeer gøre karakteriseringen af ​​denne celle type, en udfordring i sig selv. At studere cafeer in vitro har også været hæmmet af den ekstra komplikation, at disse celler senesce og stoppe prolifererende når dyrkes i en længere periode. Vores tidligere forsøg på direkte at udødeliggøre primære cafeer ved hjælp af en retroviral hTERT cDNA konstruere mislykkedes. Derfor, for yderligere at undersøge tumorfremmende egenskaber af disse celler, har vi udviklet en metode til at generere foreviget cafeer fra menneskelige brystkirtler fibroblaster ved hjælp af en coimplantation tumor xenograft model. Primære humane brystkirtler fibroblaster, udvundet af reduktionen mammoplasty væv, blev udødeliggjort, før det sprøjtes med mammacancer celler i mus. Den menneskelige fibroblaster blev derefter isoleret fra den resulterende tumorxenoplantater (se fig. 1Ba for detaljer). Vigtigt er det, den menneskelige mammae fibroblaster i stigende grad einvolverede i tumorfremmende myofibroblastic cafeer i løbet af tumorprogression. Vi har faktisk observeret, at 242-dage-gammel exp-CaF2 celler viser en langt større tumorfremmende myofibroblastic evne i forhold til 42 - eller 70-dage-gammel exp-CAF1 celler og kontrol fibroblastceller-2 celler 11. Sådanne tumorfremmende myofibroblastic evne exp-CaF2 celler, som også er observeret i cafeer tilberedt af brystkræftpatienter, afhænger af etableringen af autocrine signalering sløjfer medieret af TGF-β og SDF-1 cytokiner 11. Hverken genoverførsel eller celle fusion mellem carcinom celler og fibroblaster, formidler fænotyper af cafeer genereret på vores xenograft model 11. Tilsammen disse observationer tyder på, at xenograft-afledte exp-cafeer tjene som et nyttigt værktøj til at studere cafeer stede i menneskets bryst karcinomer. De beskrevne eksperimentelle protokol kan også udvides til at isolere forskellige cafeer oprindelse fra andre typer af menneskelig karcinomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) for generøse støtte og tilsyn med dette arbejde og Mr. Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester) for kritisk redigering af dette manuskript. Dette projekt blev støttet af Research Storbritannien (CR-britisk) indrømme nummer C147/A6058 (AO)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 61965-026
Fetal calf serum GIBCO, by Life Technologies 10270
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-1G
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272
Vimentin (V9) antibody Novocastra Laboratories

NCL-L-

VIM-V9
Tenascin C (BC-8) antibody

a gift from
Dr. Luciano

Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody Sigma-Aldrich C6198

Prolyl-4-hydroxylase

Dako M0877
(5B5) antibody
Collagen type1 1A antibody Sigma-Aldrich HPA011795
Pan-cytokeratin antibody Sigma-Aldrich C5992
Fibronectin antibody BD Biosciences 610077

S100A4/FSP-1 (fibroblast-

specific protein-1) antibody
Dako A5114

Fibroblast surface protein

(clone 1B10) antibody
Abcam ab11333
MSCV-IRES-GFP construct Request to the the authors
pBabe-puro construct

Purchase

from Addgene
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
DAPI Sigma-Aldrich D9564
15 ml conical tube Corning 430766
Nude mouse Taconic NCRNU-F Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells ATCC CCL-226

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence? Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
  2. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
  3. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  4. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
  5. De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
  6. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
  7. Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
  8. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
  9. Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
  10. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
  11. Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
  12. Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).

Comments

1 Comment

  1. Can I immortalize the primary fibroblasts with pBaba-hygro-hTERT plasmid directly? Should I make viral particles or direct transfection in the fibroblasts will work? If direct transfection, what reagent is suitable for primary fibroblasts? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 2:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics