Eksperimentell Generation of Karsinom-Associated Fibroblaster (kafeer) fra Human mammary Fibroblaster

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer) rik på myofibroblasts stede i tumor stroma, spille en viktig rolle i å drive tumor progresjon. Vi utviklet en coimplantation svulst xengraft modell for eksperimentelt generere kafeer fra menneskelige mammary fibroblaster. Protokollen beskriver hvordan å etablere CAF myofibroblasts at få en evne til å fremme tumourigenesis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Polanska, U. M., Acar, A., Orimo, A. Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts. J. Vis. Exp. (56), e3201, doi:10.3791/3201 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Karsinomer er komplekse vev består av neoplastiske celler og en ikke-cancerous kupé referert til som "stroma '. Den stroma består av ekstracellulære matrix (ECM) og en rekke mesenchymalceller, inkludert fibroblaster, myofibroblasts, endotelceller, pericytes og leukocytter 1-3.

Svulsten-assosiert stroma er lydhør overfor betydelige parakrine signaler utgitt av nabolandet carcinoma celler. Under sykdommen prosessen, stroma ofte blir befolket av carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer), inkludert et stort antall myofibroblasts. Disse cellene har tidligere vært hentet fra mange forskjellige typer av humant karsinom for sine in vitro kultur. En undergruppe kafeer er gjenkjennelig gjennom sine oppregulering av α-glatt muskel aktin (α-SMA) uttrykk 4,5. Disse cellene er et kjennetegn på 'aktivert fibroblaster' som deler lignende eiendommer med myofibroblasts commonly observert i skadet og fibrotiske vev 6. Tilstedeværelsen av denne myofibroblastic CAF subset er sterkt knyttet til høyverdig malignitet og assosiert med dårlig prognose hos pasienter.

Mange laboratorier, inkludert vår egen, har vist at kafeer, når injisert med carcinoma celler i immunodeficient mus, er i stand til vesentlig å fremme tumourigenesis 7-10. Kafeer forberedt fra carcinoma pasienter imidlertid ofte gjennomgå senescence under forplantning i kultur begrense utbredelsen av bruken gjennom pågående eksperimentering. For å overvinne denne vanskeligheten, har vi utviklet en ny teknikk for å eksperimentelt generere udødeliggjort menneskelige mammary CAF cellelinjer (exp-kafeer) fra human mammary fibroblaster, ved hjelp av en coimplantation brystsvulst xenograft modell.

For å generere exp-kafeer, foreldrenes menneskelige mammary fibroblaster, hentet fra reduksjonen mammoplasty vev, ble først immortaliSED med hTERT, den katalytiske subenhet av telomerase holoenzyme, og konstruert for å uttrykke GFP og en puromycin motstand genet. Disse cellene ble coimplanted med MCF-7 menneskelige brystkreft celler uttrykker en aktivert ras onkogen (MCF-7-ras celler) inn i en mus xenograft. Etter en periode med inkubasjon in vivo ble først injisert menneskelige mammary fibroblaster hentet fra svulsten xenografts på grunnlag av deres puromycin motstand 11.

Vi observerte at beboeren menneskelige mammary fibroblaster har differensiert, vedta en myofibroblastic fenotype og ervervet tumor-fremme egenskaper i løpet av tumor progresjon. Viktigere, disse cellene, definert som exp-kafeer, tett etterligner tumor-fremme myofibroblastic fenotype av kafeer isolert fra brystcarsinomer dissekert fra pasienter. Våre tumor xenograft-avledet exp-kafeer derfor gi en effektiv modell for å studere biologi kafeer i menneskelig breast karsinomer. De beskrevne Protokollen kan også utvides for å generere og karakterisere ulike CAF populasjoner avledet fra andre typer av humant karsinomer.

Protocol

1. Isolering av primære cultured human normal mammary fibroblaster

Eksperimentelle prosedyrer for å isolere primære dyrkede humane normale mammary fibroblaster er skissert i fig. 1A.

  1. Forbered cellen dissosiasjon buffer, som beskrevet tidligere 12: Dulbecco modifiserte Eagle er Medium (DMEM) med 10% kalvefoster serum (FCS), penicillin-streptomycin (200 enheter / ml), collagenase type I (1 mg / ml) og Hyaluronidase ( 125 enheter / ml).
  2. Vask brystvev dissekert fra en reduksjon mammoplasty (~ 0,5 gram) flere ganger i fosfatbufret saltvann (PBS). Finhakk vevet i små fragmenter (<1,5 mm 3) bruker sterile barberblader.
  3. Overfør vevet fragmenter til en 15 ml konisk rør som inneholder en passende mengde av de ovennevnte celle dissosiasjon buffer (10 ml per 0,5 gram vev) og vortex for 1 min ved maksimal hastighet.
  4. Digest vevet fragmenter i cellen dissosiasjon buffer feller 12-18 t ved 37 ° C med langsom omrøring. * Merk at det vil være det fortsatt mange biter av ufordøyd vev fragmenter igjen i røret.
  5. Inkuber røret i 5 min ved romtemperatur uten agitasjon. Overfør den resulterende stromal celle-beriket supernatant inn i en ny konisk rør med en 5 ml serologiske pipetter.
  6. Sentrifuger stromale brøkdel i 5 min ved 250 X g og resuspender cellen pellet i PBS. Sentrifuger igjen for 5 min ved 250 X g og cellepelleten suspenderes i DMEM supplert med 10% FCS. Kultur cellene i DMEM inneholder 10% FCS i en 15 cm petriskål ved 37 ° C og 5% karbondioksid.
  7. Forplante cellene til confluent. Det vil vanligvis ta 8-10 dager. Oppbevar cellene ved -80 ° C ved hjelp av frysing medium (10% dimethyl sulfoxide og 20% ​​FCS i DMEM). Forbered fem frosset hetteglass som en original lager. Tine ett hetteglass og utvide cellene å forberede 5 hetteglass for de sekundære lager inneholder fibroblaster passaged innen 5 befolkningendoublings (PDS) for de etterfølgende eksperimenter. Disse prosedyrene minimere klonal seleksjon og kultur stress som kan oppstå under lengre vev kultur. * Merk at P1.1-7 kan også brukes for å isolere kafeer fra brystcarsinomer innhentet av en mastektomi 12.

2. Generering av GFP-merket, puromycin-resistent, udødeliggjort human normal mammary fibroblaster

  1. For å immortalise den primære menneskelige normal mammary fibroblaster isolert i P1.7), innføre en retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektor 12, uttrykker både hTERT og GFP. Kultur cellene i 4-5 dager og deretter sortere GFP-positive celler ved hjelp av flowcytometri.
  2. Innføre retrovirale pBabe-Puro konstruere koding en puromycin motstand genet inn i GFP-merket udødeliggjorde fibroblaster. Kultur cellene i 5-7 dager i nærvær av puromycin (endelig konsentrasjon: 1 mg / ml) for å isolere GFP-positive (GFP +), puromycin-resistent (Puro R
  3. Neste, å undersøke om disse fibroblastene produserer aktive virus, som kan føre til horisontal overføring av gener som koder for GFP og puromycin motstand, vokse 2.5x10 5 GFP + Puro R udødeliggjort menneskelige mammary fibroblaster i en 6 cm petriskål for 2 dager.
  4. Filter medium betinget av disse fibroblaster hjelp av en sprøyte filter (pore størrelse: 0,45 mikrometer) og legge det inn på 10T1 / 2 mus fibroblastic celler for 12h i nærvær av protamin sulfat (5 mikrogram / ml) som øker effektiviteten av virus infeksjon. Mediet er da endret til 10% FCS-DMEM for ytterligere to dager.
  5. Undersøke celler ved en fluorescens mikroskopi. 10T1 / 2 celler infisert av GFP viruset vil bli GFP-positive. Unn også cellene med puromycin (1 mg / ml) i 5-7 dager og observere plate hvis noen Puro R 10T1 / 2 celler er til stede og danne kolonier etter puromycin behandling.
  6. Merk at den horisontale genet transfer ved aktiv virus produseres av foreldrenes GFP + Puro R menneskelige mammary fibroblaster kan gjøre de omkringliggende murine celler og / eller carcinoma celler GFP + Puro R innen svulst xenografts. Dette kan hindre prosesser isolere utgangspunktet injiserte GFP + Puro R menneskelige mammary fibroblaster fra svulsten xenografts.

3a. Coinjection av menneskelig mammary fibroblaster med brystkreft celler i en immunodeficient mus

Eksperimentelle prosedyrer for generering exp-kafeer er illustrert i fig. 1Ba.

  1. Mix 1x10 6 MCF-7-ras menneskelige brystkreft celler og 3x10 6 GFP + Puro R, udødeliggjort menneskelige mammary fibroblaster generert på P2.2). Forbered cellene i 400 mL av kultur medium med 50% (v / v) Matrigel per injeksjon.
  2. Injiser cellen blandingen subkutant til et immunodeficient nakne mus. Når kafeer er hentet uavhengig fra ulikesvulster, implantat hvert blandingen inn i høyre og venstre flankene av flere mus.

3b. Injeksjon av menneskelige mammary fibroblaster inn en immunodeficient mus

  1. For å generere kontroll fibroblaster mot exp-kafeer, forberede 3x10 6 GFP + Puro R udødeliggjort menneskelige mammary fibroblaster generert på P2.2 i 400 mL av kultur medium med 50% (v / v) Matrigel per injeksjon (Fig. 1Bb). Ikke bland fibroblaster med carcinoma celler.
  2. Implanter fibroblaster utarbeidet i P3b.1 inn subkutane områder av nakne mus.

* Merk at inokulert fibroblaster vil danne fibroblastic vev, men ikke svulst under huden.

4a. Disseksjon av tumor xenograft

  1. Euthanise musen harboring en subkutan human brystkreft xenograft 42 dager etter implantasjon (Fig. 1Ba). * Merk at når andre carcinoma celler og / eller fibroblaster er coimplanted, Kan fibroblaster må inkuberes lenger enn 42 dager i løpet av svulsten xenograft å initiere sine myofibroblastic fenotype.
  2. Høste svulsten xenograft fra flanken av musen ved stump disseksjon bruke pinsett og saks. Senk svulstvev i PBS.

4b. Disseksjon av fibroblast xenograft

  1. Euthanise musen harboring den fibroblast xenograft 42 dager etter implantasjon (Fig. 1Bb).
  2. Dissekere subkutane fibroblast xenograft bruke pinsett og saks. Plasser fibroblastic vevet inn i PBS. * Merk at en fibroblast xenograft, som vises som en liten gjennomsiktig vev, kan det være vanskelig å finne under huden.

5. Utarbeidelse av primær dyrkede celler fra xenografts

  1. Bruk en steril biosikkerhet kabinett å dissekere svulsten (~ 0,5 gram) eller fibroblastic vev (~ 0,1 gram). Overfør excised vev på toppen av en 15 cm kultur dish med 1 ml PBS. Finhakk vev i små vev fragmenter (<1,5 mm 3) bruker sterile barberblader. * Merk at hvis fibroblast xenograft veier mindre enn 0,1 gram, samle noen ekstra fibroblast xenografts og bland dem sammen for å øke antall celler for isolasjon.
  2. Overfør vevet fragmenter til en 15 ml konisk tube som inneholder cellen dissosiasjon buffer (10 ml per 0,5 gram vev) og vortex for 1 min ved maksimal hastighet.
  3. Inkuber cellesuspensjonen for 3 t ved 37 ° C med kontinuerlig langsom omrøring.

Seks. Isolering av puromycin-resistente celler i kultur

  1. Sentrifuger cellesuspensjonen skilt enten fra tumor eller fibroblast xenograft i 5 min ved 250 X g og resuspender cellen pellet i PBS. Sentrifuger igjen for 5 min ved 250 X g. Resuspender den resulterende cellepelleten i 10% FCS-DMEM. Kultur cellene i en 15 cm petriskål i nærvær av puromycin (1 mg / ml) ved 37 ° Cog 5% karbondioksid for å eliminere eventuelle forurensende karsinom celler og / eller murine stromale celler. Forplante cellene til confluent (2-4 uker). Oppbevar cellene ved -80 ° C ved hjelp av frysing medium. * Merk at den resulterende Puro R celler, utpekt 42 dager gammel exp-CAF1 (Fig. 1Ba) eller kontroll fibroblast-1 celler (Fig. 1Bb), er udødelig og positive for GFP. Det anbefales å kontrollere om disse cellene produserer aktive virus ved hjelp 10T1 / 2 celler, som beskrevet i P2.3-6.

7a. Isolering av exp-CaF2 celler i kultur

For ytterligere å øke den aktiverte myofibroblastic fenotypen av kafeer, bland den 42 dager gamle exp-CAF1 celler med MCF-7-ras celler og injisere dem igjen subkutant i en naken mus for ytterligere perioder på 200 dager. Dissekere og dissosierer svulsten xenograft til en enkelt-cellesuspensjon og kultur cellene i en 15 cm petriskål med 10% FCS-DMEM i nærvær av puromycin (1 mg / ml), som angitt i P60,1. Forplante cellene til confluent (8-10 dager). Oppbevar cellene ved -80 ° C ved hjelp av frysing medium. Den resulterende Puro R celler er oppkalt 242 dager gammel exp-CaF2 celler (Fig. 1Ba).

7b. Utvinning av kontroll fibroblast-2 celler i kultur

For å generere kontroll fibroblaster mot exp-CaF2 celler, injiserer 42 dager gammel kontroll fibroblast-1 celler alene uten carcinoma celler subkutant inn en naken mus i tillegg for 200 dager. Dissekere og distansere det fibroblastic vevet inn i en enkelt celle suspensjon og kultur cellene i en 15 cm petriskål med 10% FCS-DMEM i nærvær av puromycin (1 mg / ml) som angitt i P6.1. Forplante cellene til confluent (3-4 uker). Oppbevar cellene ved -80 ° C ved hjelp av frysing medium. Den resulterende Puro R celler er oppkalt kontroll fibroblast-2 celler (Fig. 1Bb).

8. Representant Resultater:

Kontroll fibroblast-2 og exp-CaF2 cells, som har blitt hentet fra brystsvulst xenografts, beiset sterkt positivt for mesenchymale markører, inkludert menneske-spesifikke vimentin, prolyl-4-hydroksylase, kollagen 1A, fibronectin, S100A4, og fibroblast overflate protein (fig 2A) 11, som indikerer human opprinnelse og mesenchymale natur av disse cellene. I kontrast, ble cytokeratin, en markør for epitelceller, ikke farget i disse GFP + fibroblaster (Fig. 2B). Disse funnene derfor foreslå at de utpakkede exp-CaF2 og kontroll fibroblast-2 celler har sin opprinnelse fra foreldrenes menneskelige mammary fibroblaster først introdusert i musen xenografts.

Viktigere, beiset en høyere andel av exp-CaF2 celler positive for α-SMA og ekstracellulære matrix glykoprotein tenascin-C 5, som begge er markører for myofibroblasts sammenlignet med 42 dager gamle exp-CAF1 og kontroll fibroblast-2 celler (fig . 2C, D) 11. Disse dataene indikerer at hjemmehørende menneskelige mammary fibroblasts gradvis utvikle seg til CAF myofibroblasts innen svulst xenografts.

Figur 1
Figur 1 Skjematisk fremstilling av isolasjon av menneskelig mammary fibroblaster. A) Reduksjonen mammoplasty vev ble hakket bruker sterile barberblader (P1.2) og overført til en 15 ml konisk tube (P1.3). De små vevet fragmenter ble fordøyd i cellen dissosiasjon buffer (P1.4) og klargjort for kultur in vitro (P1.5-7). For å immortalise den isolerte primære menneskelige mammary fibroblaster, en retrovirale pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektor, uttrykker både hTERT og GFP, ble introdusert, og den resulterende GFP-positive celler ble sortert ved hjelp av flow cytometri (P2.1). En retrovirale pBabe-Puro vektor koding en puromycin motstand genet ble deretter introdusert i disse cellene. Ved puromycin behandling, GFP-merket (GFP +) puromycin-resistente (Puro R), immortalised human mammary fibroblaster ble isolert (P2.2).

Ba) For å generere exp-kafeer, GFP + Puro R udødeliggjort human mammary fibroblaster var coinjected med MCF-7-ras brystkreft celler subkutant i en immunodeficient nakne mus (P3a). Svulsten xenograft ble resected på 42 dager etter implantering (P4A) og dissosiert i en enkelt-cellesuspensjon (P5). Disse cellene ble så dyrket in vitro i nærvær av puromycin å eliminere eventuelle forurensende karsinom celler og mus stromale celler (P6). Den resulterende puromycin-resistente cellene ble kalt eksperimentelt generert CAF1 (exp-CAF1) celler. Disse cellene, resected 42 dager etter implantasjon, ble nok en gang blandet med MCF-7-ras celler og implantert subkutant i en rekke mus som før (P7a). Den resulterende svulsten var lov til å vokse for ytterligere perioder på 200 dager, deretter dissekert, dissosiert, og dyrket i nærvær av puromycin. Den isolertepuromycin-resistente cellene ble kalt exp-CaF2 celler (242 dager gammel).

Bb) å isolere kontroll celler mot exp-kafeer, GFP + Puro R udødeliggjort human mammary fibroblaster ble injisert subkutant i en naken mus som ren kulturer uten MCF-7-ras celler (P3b). Den fibroblastic vev, dissekert 42 dager etter implantasjon (P4b), ble skilt i encellede suspensjoner (P5) og puromycin-resistente celler, oppkalt kontroll fibroblast-1 celler ble isolert som beskrevet tidligere (P6). Disse fibroblaster var nok en gang implantert subkutant inn en naken mus uten MCF-7-ras celler i tillegg for 200 dager (P7b). Den fibroblastic vev ble dissekert, dissosiert, og dyrket i nærvær av puromycin. Den isolerte puromycin-resistente cellene ble kalt kontroll fibroblast-2 celler (242 dager gammel).

Figur 2
Figur 2 (B) I kontrast pan-cytokeratin, en markør for epitelceller , blir ikke oppdaget i exp-CaF2 cellene uttrykker GFP (green). Cellekjerner er farget med 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blå). Scale bar, 50 mikrometer (referert fra Kojima et al. 11)

(C) immunfluorescens av exp-CaF2 celler og kontroll fibroblast-2 celler (kontroll f.) med antistoffer mot α-SMA (rød) eller tenascin-C (TN-C) (red). Cellekjerner er beiset med DAPI (blå). Scale bar, 50 mikrometer. (D) 48% av exp-CaF2 celler flekken positive for α-SMA, mens en4% av 42-dagers gammel exp-CAF1 og 2,5% av kontroll fibroblast-2 cell populasjoner er positive for α-SMA. (Referert fra Kojima et al.11)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mangelen på CAF-spesifikke markører og graden av heterogenitet observert blant kafeer gjengi karakterisering av denne cellen typen en utfordring i seg selv. Studerer kafeer in vitro har også blitt hindret av den ekstra komplikasjon som disse cellene senesce og stoppe proliferating når kultivert for en lang periode. Våre tidligere forsøk på å direkte immortalise primære kafeer bruke en retrovirale hTERT cDNA konstruere var mislykket. Derfor, for å ytterligere undersøke svulsten fremme egenskapene til disse cellene, har vi utviklet en metode for å generere udødeliggjort kafeer fra menneskelige mammary fibroblaster ved hjelp av en coimplantation svulst xenograft modell. Primære menneskelige mammary fibroblaster, hentet fra den reduksjonen mammoplasty vev, ble udødeliggjort før han ble injisert med brystkreft celler i mus. Den menneskelige fibroblaster ble deretter isolert fra den resulterende svulst xenografts (se fig. 1Ba for detaljer). Viktigere, den menneskelige mammary fibroblaster stadig einvolvert i tumor-fremme myofibroblastic kafeer i løpet av tumor progresjon. Vi har faktisk observert at 242-dagers gammel exp-CaF2 cellene vise en langt større tumor-fremme myofibroblastic evne i forhold til 42 - eller 70-dager gammel exp-CAF1 celler og kontroll fibroblast-2 celler 11. Slike tumor-fremme myofibroblastic evne til exp-CaF2 celler, som også er observert i kafeer forberedt fra brystkreft pasienter, avhenger av etablering av autocrine signalering looper mediert av TGF-β og SDF-1 cytokiner 11. Verken genoverføring eller celle fusjon mellom carcinoma celler og fibroblaster, formidler fenotyper av kafeer generert på våre xenograft modell 11. Samlet utgjør disse observasjonene tyder på at xenograft-avledet exp-kafeer tjene som et nyttig verktøy for å studere kafeer stede i menneskers brystcarsinomer. De beskrevne forsøksprotokoll kan også utvides for å isolere ulike kafeer opprinnelse fra andre typer av humant karsinomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) for generøs støtte og oppfølging av dette arbeidet og Mr. Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester) for kritisk redigering av dette manuskriptet. Dette prosjektet ble støttet av Forskning Storbritannia (CR-britiske) stipend nummer C147/A6058 (AO)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 61965-026
Fetal calf serum GIBCO, by Life Technologies 10270
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-1G
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272
Vimentin (V9) antibody Novocastra Laboratories

NCL-L-

VIM-V9
Tenascin C (BC-8) antibody

a gift from
Dr. Luciano

Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody Sigma-Aldrich C6198

Prolyl-4-hydroxylase

Dako M0877
(5B5) antibody
Collagen type1 1A antibody Sigma-Aldrich HPA011795
Pan-cytokeratin antibody Sigma-Aldrich C5992
Fibronectin antibody BD Biosciences 610077

S100A4/FSP-1 (fibroblast-

specific protein-1) antibody
Dako A5114

Fibroblast surface protein

(clone 1B10) antibody
Abcam ab11333
MSCV-IRES-GFP construct Request to the the authors
pBabe-puro construct

Purchase

from Addgene
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
DAPI Sigma-Aldrich D9564
15 ml conical tube Corning 430766
Nude mouse Taconic NCRNU-F Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells ATCC CCL-226

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence? Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
  2. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
  3. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  4. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
  5. De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
  6. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
  7. Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
  8. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
  9. Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
  10. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
  11. Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
  12. Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).

Comments

1 Comment

  1. Can I immortalize the primary fibroblasts with pBaba-hygro-hTERT plasmid directly? Should I make viral particles or direct transfection in the fibroblasts will work? If direct transfection, what reagent is suitable for primary fibroblasts? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 2:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics