İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

* These authors contributed equally
JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tümör stroma içinde mevcut miyofibroblastlar zengin, tümör progresyonu sürüş önemli bir rol oynamaktadır. Biz deneysel insan meme fibroblastlar CAFs üretmek için bir coimplantation tümör xengraft modeli geliştirdi. Protokolü tumourigenesis teşvik etmek için bir yeteneği kazandırmak CAF miyofibroblastlar kurmak anlatılmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Polanska, U. M., Acar, A., Orimo, A. Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts. J. Vis. Exp. (56), e3201, doi:10.3791/3201 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Karsinomlar neoplastik hücreler ve 'stroma' olarak anılan bir kanser olmayan gözü oluşan karmaşık dokulardır. Stroma ekstrasellüler matriks (ECM) ve mezenkimal hücreler, fibroblastlar, miyofibroblastlar endotel hücreleri, perisitlerden ve 1-3 lökosit de dahil olmak üzere , çeşitli oluşur.

Tümör ile ilişkili stroma komşu karsinom hücreleri tarafından yayımlanan önemli parakrin sinyaller duyarlı. Hastalık süreci boyunca, stroma genellikle miyofibroblastlar büyük numaraları da dahil olmak üzere, karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tarafından doldurulur olur. Bu hücreler in vitro kültürü için daha önce birçok farklı insan karsinomların tipleri çıkarılan edilmiştir. CAFs bir ICSI'nin α-düz kas aktin up-regülasyon (α-SMA) ifade 4,5 ile ayırt edilebilir. Bu hücreler miyofibroblastlar c ile benzer özellikleri paylaşan bir işaretidir 'aktif fibroblastlar'ommonly yaralı ve fibrotik dokuların 6 gözlenmiştir. Bu miyofibroblastik CAF alt kümesinin varlığı son derece yüksek dereceli maligniteler ile ilgili ve yoksul hastaların prognozları ile ilişkilidir.

Birçok laboratuar, kendi de dahil olmak üzere CAFs karsinom hücreleri ile bağışık yetmezliği olan farelere enjekte tumourigenesis 7-10 önemli ölçüde teşvik yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Ancak karsinom hastaları hazırlanan CAFs,, sık sık devam eden deney boyunca kullanım yaygınlığı sınırlayıcı kültürünün yayılma sırasında yaşlanması tabi. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, biz coimplantation meme tümörü xenograft modeli kullanılarak, deneysel insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirdi meme insan CAF hücre hatları (exp-CAFs) oluşturmak için yeni bir teknik geliştirdi.

Azalma mammoplasty doku elde exp CAFs, ebeveyn insan meme fibroblastlar, üretmek için, ilk immortalihTERT, telomeraz holoenzyme katalitik subunit ve ifade GFP ve bir puromycin direnç geninin için tasarlanmış sed. Bu hücreler aktive ras onkogen (MCF-7-ras hücreleri) bir fare xenograft ifade MCF-7 insan meme kanseri hücreleri ile coimplanted. In vivo bir inkübasyon döneminden sonra, başlangıçta enjekte insan meme fibroblastlar, onların puromycin direnci 11 temelinde tümör xenografts çıkarıldı .

Biz bir miyofibroblastik fenotip benimseyerek, yerleşik insan meme fibroblastlar farklılaşmış olduğu görülmektedir ve tümör progresyonu sırasında tümör destekleyici özellikleri satın aldı. Önemlisi, bu hücrelerin, exp-CAFs olarak tanımlanan yakından hastaların disseke meme karsinomları izole CAFs tümör teşvik miyofibroblastik fenotip taklit. Bu nedenle tümör xenograft türetilen exp CAFs, insan breas CAFs biyolojisini çalışmak için etkili bir modelt karsinomlar. Açıklanan protokol aynı zamanda, insan karsinomları diğer türleri türetilen çeşitli CAF popülasyonları ve tanımlamak için uzatılabilir.

Protocol

1. Primer kültürlerinde insan normal meme fibroblastlar izolasyonu

Şekil izole primer kültürlerinde insan normal meme fibroblastlar için deneysel prosedürleri özetlenmiştir. 1A.

  1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı Orta (DMEM) gibi daha önce 12 açıklanan hücre disosiasyon tampon,% 10 fetal buzağı serumu (FCS), penisilin-streptomisin (200 üniteler / ml), kollajenaz tip I (1 mg / ml) ve hiyalüronidaz (hazırlayın 125 ünite / ml).
  2. Meme dokusunun bir azalma mammoplasty (~ 0,5 gram) birkaç kez fosfat tamponlu salin (PBS) disseke yıkayın. Steril Jilet kullanarak küçük parçaları (<1.5 mm 3) doku Kıyma.
  3. Yukarıdaki hücre disosiasyon tampon (0.5 gram doku başına 10 ml) ve maksimum hızda 1 dakika için vorteks uygun bir miktar içeren 15 ml konik boru içine doku parçaları aktarın.
  4. Disosiasyon tampon f hücre doku parçaları Digestveya 12-18 h 37 ° C yavaş ajitasyon * Not hala birçok tüp içinde kalan sindirilmemiş doku parçalarının parçaları olacağı.
  5. Ajitasyon olmadan tüpü oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 5 ml serolojik pipetlemeyin kullanarak yeni bir konik tüp içine elde edilen stromal hücre ile zenginleştirilmiş süpernatant aktarın.
  6. Stromal fraksiyonu 250 X g de 5 dakika santrifüj ve PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 250 X g de 5 dakika için tekrar Santrifüj ve% 10 FCS ile desteklenmiş DMEM hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Kültür DMEM 37 ° C ve% 5 karbondioksit az 15 cm petri% 10 FCS içeren hücreler.
  7. Konfluent kadar hücreleri yayma. Genellikle 8-10 gün sürer. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta (% 10 dimetil sülfoksit ve DMEM 20% FCS). Özgün bir stok olarak 5 dondurulmuş şişeleri hazırlayın. 5 nüfus içinde geçişli bir flakon çözülme ve hücreler, fibroblastlar içeren ikincil hisse senedi için 5 flakon hazırlamak için genişletmeksonraki deneyler için çiftlenmeler (PDS). Bu prosedürler uzun süreli doku kültürü sırasında meydana gelebilir klonal seçimi ve kültür stresi en aza indirmek. P1.1-7 aynı zamanda bir mastektomi 12 ile elde edilen meme karsinomlarında CAFs izole etmek için kullanılabileceğini unutmayın.

2. GFP-etiketli puromycin dayanıklı, ölümsüzleştirilmiştir normal insan meme fibroblastlar Üretimi

  1. P1.7 izole birincil normal insan meme fibroblastlar) ölümsüzleştirmek için, hem hTERT ve GFP ifade eden bir retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektör 12, tanıtmak. Kültür sonra 4-5 gün boyunca hücre ve GFP pozitif flow sitometri kullanarak hücrelerin sıralayabilirsiniz.
  2. GFP etiketli ölümsüzleştirilmiştir fibroblastlar bir puromycin direnç geninin kodlama inşa retroviral pBabe-puro tanıtın. Kültür puromycin varlığını 5-7 gün (son konsantrasyonu: 1 mcg / ml) hücreler, GFP pozitif (GFP +), puromycin dayanıklı (puro R izole etmek için
  3. Sonra, bu fibroblastlar, GFP ve puromycin direnci kodlayan genlerin yatay transferi yol büyüyebilir aktif virüsler, 2.5x10 5 GFP + puro R 2 gün boyunca 6 cm Petri kabındaki insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirdi. Üreten olmadığını incelemek için
  4. Filtre orta bir şırınga filtresi (gözenek boyutu: 0.45 mikron) kullanarak bu fibroblastlar tarafından klimalı ve virüs enfeksiyonu verimliliğini artırır protamin sülfat (5 mg / ml) varlığında 12 saat için 10T1 / 2 fare fibroblastik hücreler üzerine ekleyin. Orta, sonra ek olarak 2 gün boyunca% 10 FCS-DMEM değiştirildi.
  5. Floresan mikroskobu ile hücrelerin inceleyin. GFP virüs tarafından enfekte 10T1 / 2 hücreleri GFP pozitif olacak. 5-7 gün puromycin (1 mcg / ml) ile de hücrelerin tedavi ve herhangi bir puro R 10T1 / 2 hücreleri puromycin tedaviden sonra mevcut ve form koloniler halinde plaka gözlemlemek.
  6. Not yatay gen tranebeveyn, GFP + puro R insan meme fibroblastlar tarafından üretilen aktif virüsler tarafından sfer içinde tümör xenografts çevreleyen fare hücreleri ve / veya karsinom hücreleri GFP + puro R neden olabilir. Bu başlangıçta enjekte GFP + puro R tümör xenografts insan meme fibroblastlar tecrit işlemleri engelleyebilir.

3a. Immünyetmezligi fare meme kanseri hücreleri, insan meme fibroblastlar Coinjection

Exp-CAFs üretmek için deneysel prosedürleri Şekil gösterilmiştir. 1BA.

  1. Mix 1x10 6 MCF-7-ras insan meme karsinomu hücreleri ve 3x10 6 GFP + R puro, P2.2 oluşturulan ölümsüzleştirdi insan meme fibroblastlar). Hücreleri,% 50 (v / v) enjeksiyon başına Matrigel 400 ul kültür ortamı hazırlayın.
  2. Subkutan immünyetmezligi çıplak bir farenin hücre karışımı enjekte edilir. CAFs farklı bağımsız olarak ayıklanırtümörler, bazı farelerin sağ ve sol yanları içine her karışımı implant.

3b. Insan meme fibroblastlar immünyetmezligi bir fare içine enjeksiyon

  1. Exp-CAFs karşı kontrol fibroblastlar oluşturmak için,% 50 (v / v) Matrigel başına enjeksiyon (Şekil 1Bb) ile kültür ortamı 400 ul P2.2 üretilen 3x10 6 GFP + puro R ölümsüzleştirdi insan meme fibroblastlar hazırlar. Fibroblastlar karsinom hücreleri ile karıştırın VERMEYİN.
  2. Çıplak farelerin deri altı sitelerine P3b.1 hazırlanan fibroblastlar İmplant.

* Inoküle fibroblastlar cilt altında fibroblastik doku değil, tümör oluşturacak unutmayın.

4a. Tümör xenograft diseksiyonu

  1. Diğer karsinom hücreleri ve / veya fibroblastlar coimplanted 42 gün post-implantasyon (Şekil 1BA). * Not subkutan insan meme kanseri xenograft barındıran fare EuthaniseFibroblastlar miyofibroblastik fenotip başlatmak için tümörün xenograftlarının içinde daha uzun bir süre 42 gün süreyle inkübe gerekebilir.
  2. Forseps ve makas kullanılarak künt diseksiyonu fare kanadını tümör xenograft Hasat. PBS içinde tümör dokusu bırakın.

4b. Fibroblast xenograft diseksiyonu

  1. Fibroblast xenograft 42 gün post-implantasyon (Şekil 1Bb) barındıran fare Euthanise.
  2. Forseps ve makas kullanılarak subkutan fibroblast xenograft parçalara ayır. Fibroblastik doku PBS içine yerleştirin * Not küçük bir saydam bir doku olarak görünen bir fibroblast xenograft, cilt altında bulmak zor olabilir .

5. Xenografts primer kültürlerinde hücrelerin hazırlanması

  1. Tümör (~ 0.5 gram) veya fibroblastik doku (~ 0,1 gram) incelemek için steril bir biyogüvenlik kabini kullanın. D 15 cm kültür üstüne eksize dokuların transferi1 ml PBS ish. Dokuların steril Jilet kullanarak küçük doku parçaları (<1.5 mm 3) Kıyma. * Not fibroblast xenograft az 0.1 gram ağırlığında ise, birkaç ek fibroblast xenografts toplamak ve izolasyonu için hücre sayısını artırmak için bunları karıştırın.
  2. Doku parçaları içeren bir hücre disosiasyon tampon (0.5 gram doku başına 10 ml) ve maksimum hızda 1 dakika vorteks 15 ml konik boru içine aktarın.
  3. 3 saat hücre süspansiyonu 37 ° ° C'de sürekli yavaş ajitasyon.

6. Kültür puromycin dayanıklı hücrelerin izolasyonu

  1. 250 X g de 5 dakika süreyle tümör veya fibroblast xenograft ya ayrışmış hücre süspansiyonu santrifüj ve PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 250 X g. az 5 dakika için tekrar Santrifüj % 10 FCS-DMEM ortaya çıkan hücre pelletini tekrar 37 puromycin varlığı (1 mcg / ml), 15 cm'lik petri Kültür hücreleri ° Cve% 5 karbondioksit kirlenmesine neden olan herhangi bir karsinom hücreleri ve / veya fare stromal hücreleri ortadan kaldırmak için. Konfluent (2-4 hafta) kadar hücreleri yayma. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta kullanarak. * Not çıkan puro R hücreleri, belirlenen 42 günlük exp-CAF1 (Şekil 1BA) veya kontrol fibroblast-1 hücreleri (Şekil 1Bb), ölümsüz ve GFP için olumlu. Bu, bu hücrelerin, P2.3-6 açıklandığı gibi 10T1 / 2 hücreleri kullanarak aktif virüsler üretir kontrol edilmesi tavsiye edilir.

7a. Kültür exp CaF2 hücrelerin izolasyonu

CAFs aktive miyofibroblastik fenotip daha da artırmak için, MCF-7-ras hücreleri ile 42 gün exp CAF1 hücreleri karıştırmak ve subkutan 200 gün ek süre için çıplak bir farenin içine onları tekrar enjekte. Puromycin (1 mcg / ml) varlığında% 10 FCS-DMEM ile 15 cm'lik petri tek bir hücre süspansiyonu ve kültür hücreleri içine tümör xenograft inceleyin ve ayrıştırmaları gibi P6 belirtilen.1. Konfluent kadar (8-10 gün) hücreleri yayma. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta kullanarak. Çıkan puro R hücreleri, 242 günlük exp-CaF2 hücreleri (Şekil 1BA) olarak adlandırılır .

7b. Kültür-2 fibroblast hücreleri kontrolü çıkarımı

Exp-CaF2 hücrelerine karşı kontrol fibroblastlar oluşturmak için, 200 gün için ayrıca çıplak bir fare içine subkutan karsinom hücreleri olmadan tek başına 42 gün kontrol fibroblast-1 hücreleri enjekte. Inceleyin ve P6.1 belirtildiği gibi puromycin (1 mcg / ml) varlığında% 10 FCS-DMEM ile 15 cm'lik petri tek bir hücre süspansiyonu ve kültür hücreleri içine fibroblastik doku ayrıştırmaları. Konfluent (3-4 hafta) kadar hücreleri yayma. Hücreleri Mağaza -80 ° C donma orta kullanarak. Çıkan puro R hücreleri kontrol fibroblast-2 hücreleri (Şekil 1Bb) olarak adlandırılır.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Denetim fibroblast-2 ve exp-CaF2 cells, meme tümörü xenografts çıkarılan, insan belirten, insana özgü vimentin, prolil-4-hidroksilaz kollajen 1A, fibronektin, S100A4 ve fibroblast yüzey proteini (Şekil 2A) 11 mezenkimal belirteçler de dahil olmak üzere, güçlü bir pozitif boyanan bu hücrelerin köken ve mezenkimal doğa. Buna karşın, sitokeratin, epitel hücreleri için bir belirteç, bu GFP + fibroblastlar (Şekil 2B) lekeli değildi. Bu bulgular, bu nedenle çıkarılan exp CaF2 ve kontrol-2 fibroblast hücreleri başlangıçta fare xenografts girmiş ebeveyn insan meme fibroblastlar kökenli olduğunu göstermektedir.

Önemlisi, daha yüksek bir oranda exp-CaF2 hücreleri α-SMA ve her ikisi de 42 günlük exp-CAF1 ve kontrol (Şekil-2 fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında miyofibroblastlar belirteçleri ekstraselüler matriks glikoprotein tenaskin-C 5, pozitif boyanan 2C, D) 11. Bu veriler, bu yerleşik insan meme fibr gösteriroblastlar giderek tümör xenografts içinde CAF miyofibroblastlar dönüşmeye.

Şekil 1
Şekil 1 şematik insan meme fibroblastlar izolasyonu. A) azalma mammoplasty doku steril Jilet (P1.2) kullanarak 15 ml konik tüp (P1.3) içine kıyılmış ve transfer edildi. Küçük doku parçaları sindirilir ve hücre disosiasyon tamponu (P1.4) (P1.5-7), in vitro kültür için hazırlanmıştır. Izole birincil insan meme fibroblastlar, hem hTERT ve GFP ifade retroviral pMIG (MSCV-IRES-GFP) vektörü, ölümsüzleştirmek için kullanılmaya başlandı ve ortaya çıkan GFP pozitif hücreler flow sitometri (P2.1) kullanılarak sıralanır. Bir puromycin direnç geninin kodlama retroviral pBabe-puro vektör daha sonra bu hücrelerin içine tanıtıldı. Puromycin tedavi üzerine, GFP etiketli (GFP +) puromycin-dirençli (R) Puro, immortalised insan meme fibroblastlar (P2.2) izole edildi.

Ba) oluşturmak için exp-CAFs, GFP + puro R ölümsüzleştirdi insan meme fibroblastlar subkutan immünyetmezligi çıplak bir fare (P3a) içine MCF-7-ras meme kanseri hücreleri coinjected. Tümör xenograft 42 gün sonra (implantasyon P4A) rezeke ve tek bir hücre süspansiyonu (P5) içine ayrışmış oldu. Bu hücreler daha sonra, herhangi bir kirlenmesine karsinom hücreleri ve fare stromal hücreler (P6) ortadan kaldırmak için puromycin varlığında in vitro kültüre edildi. Çıkan puromycin dayanıklı hücrelerin deneysel olarak üretilen CAF1 (exp-CAF1) hücreleri olarak adlandırılmıştır. 42 gün implantasyon sonrası rezeke Bu hücreler, MCF-7-ras hücreleri ile bir kez daha karışık ve subkutan (P7a) önce bir ev sahibi fare içine implante. Ortaya çıkan tümör, sonra disseke ayrışmış ve puromycin varlığı içinde kültür, ek süre için 200 gün büyümeye izin verildi. Izolepuromycin-dayanıklı hücrelerin exp-CaF2 hücreleri (242 gün) olarak adlandırılır.

Bb) exp-CAFs karşı kontrol hücreleri izole etmek için, GFP + puro R MCF-7-ras hücreleri (P3b) olmadan insan meme fibroblastlar subkutan saf kültürlerin olarak çıplak bir farenin içine enjekte edildi ölümsüzleştirdi. Disseke fibroblastik doku implantasyon sonrası (P4b), 42 gün, kontrol fibroblast-1 hücreleri olarak adlandırılan tek hücreli süspansiyonlar (P5) ve puromycin dayanıklı hücreleri, ayrışmış, daha önce açıklandığı gibi (P6) izole edildi. Bu fibroblastlar 200 gün (p7b) için ek MCF-7-ras hücreleri olmadan bir kez daha çıplak bir farenin içine subkutan implante edildi. Fibroblastik doku ayrışmış, disseke ve puromycin varlığı içinde kültür edildi. Izole puromycin dirençli hücreleri kontrol fibroblast-2 hücreleri (242 gün) olarak adlandırılır.

Şekil 2
Şekil 2 (B) kontrast, pan-sitokeratin, epitel hücreleri için bir belirteç GFP (yeşil) ifade exp-CaF2 hücreleri tespit değildir. Hücre çekirdekleri 4'-6 Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (mavi) ile boyandı. Ölçek bar, 50 mikron (Kojima ve ark anılacaktır. 11)

(C) α-SMA (kırmızı) veya tenaskin-C (TN-C), (kırmızı) karşı antikorlar kullanarak exp-CaF2 hücreleri ve kontrol-2 fibroblast hücreleri (kontrol f.) İmmünofloresan. Hücre çekirdeklerinin DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçeği bar, 50 mikron exp-CaF2 hücreleri (D) 48% 1 ise, α-SMA için olumlu leke42 günlük exp-CAF1% 4 ve% 2,5 'i kontrol fibroblast-2 hücre popülasyonlarının α-SMA için olumlu. (Kojima et al.11 sevk)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CAFs bu hücre tipi kendi içinde bir meydan okuma karakterizasyonu hale arasından CAF-spesifik belirteçler ve heterojenlik eksikliği görülmektedir. In vitro olarak incelenmesi CAFs, ayrıca bu hücrelerin senesce ve uzun bir süre için kültüre prolifere ek bir komplikasyon engel olmuştur. Retroviral hTERT cDNA inşa kullanarak birincil CAFs doğrudan ölümsüzleştirmek için önceki girişimi başarısız oldu. Bu nedenle, bu hücrelerin tümör arttırıcı özellikleri daha fazla araştırmak için, bir coimplantation tümör xenograft modeli kullanarak insan meme fibroblastlar ölümsüzleştirilmiştir CAFs oluşturmak için bir yöntem geliştirdi. Azalma mammoplasty doku çıkarılan İlköğretim insan meme fibroblastlar, meme kanseri hücreleri farelere enjekte edilmeden önce ölümsüzleştirdi. Insan fibroblastlar sonra ortaya çıkan tümör xenografts (bkz. Şekil 1BA Ayrıntılar için) izole edildi. Önemli olan, insan meme fibroblastlar giderek etümör tümör progresyonu sırasında miyofibroblastik CAFs teşvik içine söz konusu olduğunda. Veya 70-gün-exp-CAF1 hücreleri ve kontrol fibroblast-2 hücreleri 11 - Andolsun ki biz, 242 gün-exp-CaF2 hücreleri bir 42 ile karşılaştırıldığında çok daha büyük miyofibroblastik yeteneği teşvik tümör olduğunu gözlemlemiştir. Böyle bir tümör teşvik miyofibroblastik ayrıca, meme kanserli hastalarda hazırlanan CAFs gözlenen exp-CaF2 hücreleri, yeteneği, TGF-β ve SDF-1 sitokinler 11 aracılığı ile otokrin sinyalizasyon döngüler kurulmasına bağlıdır . Karsinom hücreleri ve fibroblastlar, aracılık bizim xenograft modeli 11 CAFs fenotipleri arasında gen transferi veya hücre füzyon ne. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler xenograft kaynaklı exp-CAFs insan meme karsinom içinde mevcut CAFs eğitimi için yararlı bir araç olarak hizmet ettiğini düşündürmektedir. Açıklanan deney protokolünde de insan karsinomları diğer tür kaynaklanan çeşitli CAFs izole etmek için uzatılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Dr Robert A. Weinberg (Whitehead Biyomedikal Araştırma, Cambridge Enstitüsü) Biz, bu iş ve bu yazının kritik düzenleme için Sayın Kieran Mellody (Manchester Üniversitesi, Manchester) cömert destek ve denetim için teşekkür ederim. Bu proje Research UK (CR-UK) hibe sayısı C147/A6058 (AO) tarafından desteklenen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 61965-026
Fetal calf serum GIBCO, by Life Technologies 10270
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-1G
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272
Vimentin (V9) antibody Novocastra Laboratories

NCL-L-

VIM-V9
Tenascin C (BC-8) antibody

a gift from
Dr. Luciano

Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) antibody Sigma-Aldrich C6198

Prolyl-4-hydroxylase

Dako M0877
(5B5) antibody
Collagen type1 1A antibody Sigma-Aldrich HPA011795
Pan-cytokeratin antibody Sigma-Aldrich C5992
Fibronectin antibody BD Biosciences 610077

S100A4/FSP-1 (fibroblast-

specific protein-1) antibody
Dako A5114

Fibroblast surface protein

(clone 1B10) antibody
Abcam ab11333
MSCV-IRES-GFP construct Request to the the authors
pBabe-puro construct

Purchase

from Addgene
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
DAPI Sigma-Aldrich D9564
15 ml conical tube Corning 430766
Nude mouse Taconic NCRNU-F Female NCr nude
C3H/10T1/2 cells ATCC CCL-226

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence? Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
  2. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
  3. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  4. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
  5. De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
  6. Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
  7. Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
  8. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
  9. Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
  10. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
  11. Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
  12. Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).

Comments

1 Comment

  1. Can I immortalize the primary fibroblasts with pBaba-hygro-hTERT plasmid directly? Should I make viral particles or direct transfection in the fibroblasts will work? If direct transfection, what reagent is suitable for primary fibroblasts? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 2:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics