Изображений адгезии лейкоцитов к эндотелия сосудов при высоких внутрипросветного давления

Immunology and Infection
 

Summary

Это метод для визуализации адгезии лейкоцитов к эндотелию в заготовленных под давлением. Техника позволяет изучать сосудистой адгезии при сдвиге потоков с различными внутрипросветного давления до 200 мм рт.ст. Таким образом имитировать-ING патофизиологических условиях высокого кровяного давления.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Michell, D. L., Andrews, K. L., Woollard, K. J., Chin-Dusting, J. P. Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure. J. Vis. Exp. (54), e3221, doi:10.3791/3221 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Изоляция сонных артерий

  1. Euthanase10 неделя Sprague Dawley крыс с помощью CO 2 / O 2 удушья.
  2. Акцизный левой и правой общей сонной артерии с аорты и сердца обеспечения минимального растяжения сосудов.
  3. В ледяном холодном буфера Кребса отдельных сонных артерий от аорты и сердца и выполнять близкие рассечение.
  4. Имейте в изолированных сосудов Кребса на льду перед монтажом.

Приблизительный время = 45 минут

2. Грунтовка судно камеры

  1. В проксимальных и дистальных разъемы судно камеры заподлицо Кребса буфера поддерживаться при физиологических рН вливая карбогена газа (95% O 2, 5% СО 2) в буфере при 37 ° C.
  2. Обеспечить труб и канюли сбрасываются полностью и приведены в соответствие.
  3. Флеш Кребса буфера через P1 (проксимальный) и P2 (дистальный) преобразователей. Закрыть краны, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в преобразователями.
  4. Подключение датчиков к соответствующим разъемам и снова заподлицо более Кребса буфера гарантируя, что ни пузырьков воздуха. Закрыть краны на камеру.

Приблизительный время = 15 минут

3. Давления в камере судна

  1. Включите оборудование под давлением: давление серворуль, датчик давления, перистальтического насоса (рис. 1).
  2. С перистальтического насоса от давления и давления сервопривода на автоматических буфера запустить Кребса через трубы на 20 мм рт.ст. (наберите в 1), гарантируя, что ни пузырьков воздуха.
  3. Подключите трубку к закрытым датчик P2. Давление станет стабильным.
  4. Открытый P2 нажмите, чтобы судно камеры, чтобы избавиться от любых пузыри затем закрыть.
  5. Заполните ванну с буфером Кребса (5 - 7 мл).

Приблизительный время = 10 минут

4. Монтаж судно

  1. Под микроскопом рассекает место черные галстуки полиэстера на каждый канюли (рис. 2).
  2. Перемещение канюли и канюли держателей друг от друга и горе ¼ судна (дуга аорты конца) на P1 канюли. Обеспечить, чтобы не разорвать сосуд.
  3. Использование шприц с буфером Кребса мягко флеш избыток крови из сосуда через P1 преобразователя. Близко от Р1 к камере.
  4. Безопасность судна P1 канюли с полиэфирной галстук.
  5. Перемещение канюли / канюли держателей ближе для монтажа на P2 канюли.
  6. Горы дистального конца сосуда (~ ¼ длины) на дистальных канюли. Крепится с помощью полиэфирной галстук.

Приблизительный время = 20 минут

5. Поддержания давления судно

  1. Отрегулируйте канюли держателей чтобы убедиться в отсутствии согнуть или растянуть в сосуде.
  2. С P1 и P2 закрыта для камеры переключатель давления сервопривода с автоматического на ручной. Проверьте давление сервопривода нет постоянного уменьшения давления в течение 10 секунд. Если есть, то утечка происходит и соединения и датчики должны быть закреплены в месте.
  3. Отрегулируйте давление сервопривода в автоматический затем открыть Р2 к камере. Под микроскопом наблюдать судно расширяются, когда кран открыт для камеры.
  4. Переключатель давления сервопривода в ручной режим. Снова проверка для постоянного снижения давления в течение 10 секунд. Если есть утечка, то система не является жесткой и давление там, вероятно, будет отверстие в сосуде.
  5. Вернитесь к автоматической открытой Р1 к камере. На ручной настройки убедитесь, что давление остается стабильным.
  6. Если нет утечки, на ручную набрать увеличение параметра 2 (40 мм рт.ст.).
  7. Настройка автоматической и наблюдать судно под микроскопом. Если необходимо, отрегулируйте держатель канюли чтобы убедиться в отсутствии изгиба vessel.Check на предмет утечек на ручную настройку.
  8. Повторите действия 5,6 - 5,7 увеличение набора на 3 (60 мм рт.ст.), 4 (80 мм рт.ст.) и так далее, пока желаемое давление достигнуто.

Приблизительный время = 15 - 30 минут

6. Инкубация давлением судно

  1. Подключите заданной температуры контроллер до 37 ° C.
  2. Со вторым перистальтического насоса заливать Кребса буфера (1 мл / мин) в ванну камере судна.
  3. Подключите аспиратор в камеру обеспечения только верхний слой баню удаляют.
  4. Инкубируйте давлением судна при 37 ° С в течение 1 часа с давлением задан автоматически.
  5. Проверьте давление не протекает (переход на ручное) периодически.
  6. Влияние различных фармакологических вмешательств можно наблюдать, просто добавляя соединения к ванне во время инкубации.

Приблизительный время = 1 час

7. Перфузии под давлением сосуд с цельной крови

  1. Во время инкубации получить не менее 7,5 мл цельной крови человека / судно внутреннего плавания, собранных в 40 U гепарина / мл крови. Инкубируйте в 50 мл сокола при температуре 37 ° C.
  2. За 10 минут до конца тон инкубации этикетке крови VybrantDil (1:1000) в течение 10 минут при температуре 37 ° С в темноте.
  3. Через 10 минут сбора крови в шприце стирать все пузырьки и приложите на шприцевой насос с тепловой куртке установлена ​​на уровне 37 ° C.
  4. Близко от P1 датчик на камеру / судно внутреннего плавания и соединить шприц и сточных труб.
  5. Чистка крови в 1000 мкл / мин через отходов трубы, чтобы удалить пузырьки.
  6. Открытое Р1 к камере. Давление серво будет регулироваться автоматически для поддержания требуемого давления.
  7. Заливать кровью при 100 мкл / мин.
  8. Использование флуоресцентного микроскопа связан с цифровой камерой запись двух областях перфузии судно в течение 15 секунд на 1, 3, 5, 7,5 и 10 минут.
  9. Сообщение перфузии эндотелиальных целостности и функции могут быть оценены с помощью фармакологических методов, таких как myograph и выражения молекул адгезии можно определить по иммуногистохимии для дальнейшей проверки воспалительной реакции.

Приблизительный время = 15 минут

8. Представитель Результаты:

Схема установки камеры давления показана на рисунке 1. С цифровой камерой соединен с флуоресцентным микроскопом результаты могут быть визуализированы мгновенно через живые записи видео. Представитель изображения видео показано на рисунке 3, где лейкоцитов считается приверженцем эндотелия, если они оставались неподвижными в течение 10 секунд. С видео-записи на непрерывном цикле придерживался клетки может быть расценено как средняя на поле. Хотя и низкой (рис. 3А) и высокой (рис. 3В) давление вызовет некоторое количество адгезии существенное увеличение адгезии лейкоцитов в высших внутрипросветного давления видел, и это также продемонстрировало количественно (рис. 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. Под давлением естественных бывший судно камеры схеме. Канюлированные судна подключены к проксимальным (P1) датчика и дистального (Р2) преобразователи, что позволяет кровяное давление, чтобы манипулировать внутри судна. Перфузии через датчик P1 и давление поддерживается с помощью P2 преобразователя.

Рисунок 2
Рисунок 2. Cannuala со связями. Черного связей полиэстера прилагаются к каждому канюли.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель видеоизображения. Динамическое клеточной адгезии (красная стрелка) при флуоресценции при 80 мм рт.ст. () и 120 мм рт.ст. (В) после 10 минут перфузии.

Рисунок 4
Рисунок 4. Адгезии лейкоцитов в Sprague Dawley сонных артерий через 1 час инкубации при низкой (80 мм рт.ст.) и высокого давления (120 мм рт.ст.). *** Р <0,001, как проанализированы 2-полосная повторных измерений ANOVA использованием Бонферрони постфактум тест.

Discussion

Это модифицированный метод изучения адгезии лейкоцитов к эндотелию в интактных изолированных кровеносных сосудов под давлением условиях в реальном времени. Перфузии судна камеры только позволяет быстро проверки провоспалительных штаммов больших мышей и крыс судов. Включение давление манипуляции обеспечивает динамическое взаимодействие ячейки, которые должны соблюдаться от низких до очень высоких внутрипросветного давления, тем самым лучше имитировать ING-физиологических и патофизиологических условиях. Диаметр суда также может быть измерена с помощью достаточного клеточной визуализации программы и, следовательно, сдвигового течения и скорость может быть определена и, следовательно, манипулировать.

С его возможностями myograph, фармакологических вмешательств помещен в ванну добавить новое измерение в экспериментальных условиях возможно с этой модели позволяют исследовать механистического и сигнальных путей. Хотя эндотелиальные сохранения не могут быть подтверждены в ходе манипуляции давления, реакции на АХ и PE может быть проведена после перфузии 9.

Следует отметить, что эта установка демонстрирует последствия внутрипросветного давления на клетки к межклеточных взаимодействий не эффект пульсирующего потока крови, ни систолического и диастолического давления. Кроме того, в то время как резкие изменения давления на адгезии лейкоцитов наблюдалось, эта установка может быть также использована, чтобы смотреть на хроническое воздействие давления (т.е. увеличение времени инкубации и использовании модели хронического животных давления). Sprague Dawley общей сонной артерии, продемонстрированный в этом созданы, но и другие штаммы и виды могут быть использованы с соответствующей корректировки размера канюли. В самом деле, важно отметить, что возраст и вес животных влияет на размер судна и, таким образом, что создали должно быть индивидуальным для каждого судна. Закрыть и тщательного вскрытия соединительной ткани может улучшить визуализацию лейкоцитов безмерно.

Disclosures

Протокол исследования был одобрен Альфред медицинских исследований и образования участковых животных Комитет по этике и Альфред больнице Комитета по этике.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано частично OIS викторианской правительством программы, национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии программ и проектов, грантов (ССПМ Чин-Удаление пыли) и аспирантов стипендии (D Мичелл).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Carl Zeiss, Inc. SteREO Discovery V.20
PHD 2000 Syringe Pump Harvard Apparatus 70-2016
Digital Camera and Controller Hamamatsu Corp. C4742-95
Fluorescence Illumination System Lumen Dynamics X-Cite 120
Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH/1/SH
Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS - 200
Perfusion Pressure Monitor Living Systems Instrumentation PM - 4
2 x Pressure Transducer Living Systems Instrumentation PT - F
Temperature Controller Living Systems Instrumentation TC-01
Peristaltic Pump Instech Laboratories, Inc P720
VybrantDil cell-labelling solution Invitrogen V-22885 Use 1:1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
  2. Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
  3. Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
  4. Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
  5. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  6. Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
  7. Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
  8. Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
  9. Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
  10. Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
  11. Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics