Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Published 7/22/2012
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Medicine

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Summary

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

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Apaza, S., Espetia, S., Gilman, R. H., Montenegro, S., Pineda, S., Herhold, F., et al. Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR. J. Vis. Exp. (65), e3232, doi:10.3791/3232 (2012).

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Abstract

Os norovírus (NoVs) são a principal causa de surtos de gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo em seres humanos de todas as idades. Eles são importante causa de hospitalizações em crianças com impacto na saúde pública semelhante à de Rotavirus. NoVs são vírus de RNA de grande diversidade genética e há uma aparência contínua de novas estirpes. Cinco genogrupos são reconhecidos; GI e GII com seus genótipos e subtipos muitos sendo o mais importante para a infecção humana. No entanto, o diagnóstico de dois genótipos continua a ser problemática, retardando o diagnóstico e tratamento. 1, 2, 3

Para extração de RNA a partir de amostras de fezes, o método mais comumente usado é o QIAmp kit RNA Viral comercial da Qiagen. Este método combina as propriedades de ligação de uma membrana de gel de sílica, buffers que as RNases de controlo e proporcionam ligação óptimas de ARN para a coluna, juntamente com a velocidade de MicroSpin. Este método é simples, rápido e confiável e é carrIED em alguns passos que são detalhados na descrição fornecida pelo fabricante.

O norovírus é apenas a segunda rotavírus como a causa mais comum de diarréia. Diagnóstico norovírus devem estar disponíveis em todos os estudos sobre a patogênese da diarréia, bem como em surtos ou casos de diarréia individuais. Actualmente no entanto diagnóstico norovírus é restrita a poucos centros devido à falta de métodos simples de diagnóstico. Este diagnóstico e tratamento atrasos 1, 2, 3. Além disso, devido aos custos de transporte e regulamentado de buffers corrosivos dentro e entre países o uso desses kits manufaturados coloca problemas logísticos. Como resultado, neste protocolo descrevemos uma alternativa, económica, método in-house que se baseia na lança inicial et al. Método 4 que utiliza as propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica, juntamente com as propriedades anti-nuclease de tiocianato de guanidínio .

et ai. 5 é detalhado. A sequenciação do produto de PCR a partir do PCR convencional permite a diferenciação de genótipos pertencentes ao GI e genogrupos GII.

Protocol

1. As amostras de fezes

  1. As amostras de fezes devem ser armazenadas congeladas a preservar o RNA. Para fazer uma suspensão a 10% fecal, tomar aproximadamente 0,1 g de amostra de fezes descongeladas e completar a 1 ml com PBS.
  2. Alíquota em 200 ul para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Armazenar as alíquotas a -70 ° C.
  3. Descongelar e centrifugar alíquotas a 4.000 g durante 10 min antes da utilização na extracção.

2. Preparação de partículas de sílica para extracção com guanidina e Sílica

  1. À temperatura ambiente, suspender 30 g de dióxido de silício e completar com dH2O até 250 mL.
  2. Após 24 horas de sedimentação, remover 215 ml do sobrenadante por sucção. Adicionar de dH2O até 250 mL, e suspender o sedimento de sílica por agitação.
  3. Após mais 24 horas, remover o sobrenadante por sucção, e ajustar o pH da suspensão de sílica para pH 2,0, utilizando ácido clorídrico (HCl). Alíquota da suspensão de sílica em bot vidroTLEs e autoclave.

3. Preparação de L6 tampão para extração com Guanidina e Sílica

  1. À temperatura ambiente, preparar L6 tampão por dissolução de 60 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) e 1,3 g de Triton X-100 em 50 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4, e 11 mL de uma 0,2 M EDTA, a solução de pH 8,0.

4. Preparação do Tampão de L2 para extração com Guanidina e Sílica

  1. À temperatura ambiente, preparar tampão L2 por dissolução de 180 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) em 150 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4.

5. Processo de Extracção

  1. Em cada uma extracção NoV amostra de fezes positiva, como controlo positivo, e água tratada com DEPC, como controle negativo, deve ser incluída.
  2. Num tubo de centrífuga de micro-misturar o seguinte; 1 mL de tampão de L6, 20 uL de partículas de sílica, e adicionar 200 uL da suspensão de extracto de 10% fecal. Vortex brevemente e deixe à temperatura ambiente por 15 min.
  3. Centrifugar a suspensão a 6000 g durante 10 s e lavar o sedimento com 1 ml de tampão de L2 duas vezes, seguido por duas lavagens com etanol a 70% e uma vez com acetona. Seca-se o sedimento em um bloco de aquecimento a 56 ° C durante 5 min.
  4. Hidrato o RNA no pelete de sílica através da adição de 50 uL de RNase dH 2 0. Adicionar 1 mL de RNasin, mistura invertendo o tubo e incubar a 56 ° C durante 15 min.
  5. Centrifugar durante 3 min a toda a velocidade, numa centrífuga de mesa, e recolher 40 uL do sobrenadante contendo o RNA.
  6. Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA).

6. Extração alternativa Usando o Comercial RNA Viral RNA QIAamp Kit

As instruções completas são encontradas na prov livretoided com o kit QIAGEN. Resumidamente, o procedimento é como se segue:

  1. Pipete 560 de Tampão AVL contendo o RNA transportador para um tubo de 1,5 mL, e adicionar 140 uL da suspensão de fezes de 10%. Mix por pulso vórtex para 15 seg. Incubar a RT durante 10 min.
  2. Adicionar 560 uL de etanol (96-100%) para a amostra e misturar por pulso vórtex durante 15 segundos, depois brevemente centrifugar.
  3. Aplicar 630 uL desta solução a uma coluna de spin colocado num tubo de recolha de 2 mL. Centrifugar durante 1 min a 6.000 g; então colocar a coluna de spin em um tubo limpo mL 2.
  4. Lavar a coluna contendo RNA ligados com 500 uL de tampão de AW1 e centrifugar a 6000 g durante 1 min. Coloque em uma coluna de tubo de coleta limpo 2 mL.
  5. Lavar a coluna com 500 uL de tampão e centrifuga-se AW2 a toda a velocidade (20.000 g ou 14.000 rpm) durante 3 min.
  6. Coluna de spin em lugar de 1,5 mL tubo limpo micro centrífuga, adicionar 40 água tratada com DEPC-tratada uL e eluir o RNA à velocidade máxima. Repita emce para um uL 80 final de ARN eluídas.
  7. Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA).

7. Detecção de norovírus no RNA extraídos por um passo de tempo real de RT-PCR com sondas específicas TaqMan

Instrumento StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).

Metodologia

  1. Limpe e Limpe todas as superfícies de trabalho, pipetas, centrífugas e com RNase AFASTADO para eliminar qualquer contaminação RNase potencial.
  2. Pipetar o GI e GII NoV triagem mestre mistura de acordo com a Tabela 1. Sondas Primers e Taqman estão listados na Tabela 2.
  3. Alíquota de 10 uL de master mix adequado a cada tubo de reação.
  4. Adicionar 5 uL de amostra desconhecida não diluídoRNA, água tratada com DEPC-tratada como controle negativo, ou GI respectivamente GII controlo positivo de RNA, aos poços de reacção correspondentes. Todas as amostras devem ser executados em duplicata. Os controlos positivos e padrões com concentração de 300 ug / uL e 500 ug / uL, respectivamente, foram fornecidas pelo Laboratório Nacional Calicivirus Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC).
  5. Centrifugar a placa de reacção em 6000 g durante 10 seg.
  6. Na tela de propriedades do experimento; definir e selecionar um tipo de experimento para a execução. Assegure-se os reagentes TaqMan são apresentados como o tipo de reagentes, e que leitura pré-PCR e amplificação são seleccionados.
  7. Executar 15 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 3.
  8. Analisar os resultados.

8. Genotipagem de NoV GI e GII Usando RT-PCR convencional e Sequenciamento

(Não é mencionado no vídeo, já que é um método comum e amplamente utilizado.)

Instrumento. Applied Biosystems StepOne e Sistemas de Tempo StepOnePlus reais PCR com o modelo Quantitec.

Metodologia

  1. Antes de genotipagem, o genogrupo (GI ou GII) das amostras são determinados pelo rastreio de RT-PCR acima descrito. GI NoV RNA tem de ser amplificada com a mistura mestre genotipagem GI e GII NoV o RNA com a mistura GII mestre genotipagem.
  2. Pipetar o GI e GII NoV genotipagem mestre mistura conforme a Tabela 4. Primers GI SKF / SKR e G2 SKF / SKR estão listados na Tabela 5.
  3. UL alíquota 45 da mistura principal apropriado para tubos de reacção de 0,2 mL.
  4. Adicionar 5 uL de DEPC tratada com água a cada tubo de controlo negativo, e 5 uL de um pré-filtrada, Nov (GI e / ou GII) RNA positivas para o tubo de reacção correspondente.
  5. Correr 50 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 6.
  6. Enviar produtos de PCR containing, pelo menos, 100 ng / uL da região da cápside amplificado para Macrogen Companhia para a purificação e sequenciação. (9700 Grande Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 e US $ 10 por amostra por seqüenciamento).

9. Os resultados representativos

A Figura 1
A Figura 1 mostra resultados representativos do Taqman Um passo-RT-PCR, quando usada para RNA de ensaio extraídos a partir de amostras de fezes de crianças diarréicas. O ciclo threshold (Ct) para uma amostra positiva foi fixado em menor ou igual a 37 Ct para GI e GII 39 para Ct. O CT-valores para os controles positivos foram encontrados para ser inferior a 27 e 18 da junção ORF1-ORF2 para GI e GII, respectivamente. Clique aqui para ver maior figura .

A Figura 2
A Figura 2

Mix Master Concentração final Volume (uL)
H 2 0 PCR 2,875
Quantitect RT-PCR Master Mix 1x 6,250
RT Mix 1x 0,125
50 mM Cog cartilha R 1 uM 0,250
50 primers F mM Cog 1mM 0,250
10 sonda Anel mM 1 uM 0.125/0.250 *
10,00

* UL 0,250 de cada sonda foi utilizada para o teste GI, enquanto 0,125 L de cada sonda foi utilizada para o teste GII.

Tabela 1. Qiagen Quantitect master mix para triagem GI e GII (Trujillo et al., 2006) 7.

Nome Geno-grupo Usar Sequência (5 'para 3')
Cog 1R GI Cartilha CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
Cog 1F GI Cartilha CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA
Cog 2R GII Cartilha TCG ACG TCT CCA TCA TTC ACA
Cog 2F GII Cartilha CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
Anel 1A GI Probe FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
1B Anel GI Probe FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1
Ring2-TP GII Probe FAM-TGG GGC GAG GAT CGC AAT CT-BHQ-1

Tabela 2. Primer e oligonucleótidos sonda utilizada em tempo real RT-PCR quantitativo para genogrupos I, II (Kageyama et al.,2003) 8.

Passo Temp (° C) Tempo (min)
1 50 30:00 síntese de cDNA
2 95 15:00 HotStart activação polimerase Taq
3 95 00:15
60 01:00 Ciclos 45x

Tabela3. Perfil térmico para uma etapa Taqman em tempo real RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7.

Mix Master Concentração final Volume (uL)
H 2 0 PCR 29,50
5X Qiagen RT-PCR Tampão 1x 10,00
10 mM mistura de dNTP 0,4 mM 2,00
Mix enzima 2,00
40 RNasin U / uL 20 U / uL 0,50
10 uM SKF 0,1 mM 0,50
10 SKR mM 0,1 mM 0,50
45,00

Tabela 4. Qiagen One-Step RT-PCR master mix para genotipagem GI e GII.

Nome Geno-grupo Usar Sequência (5 'para 3')
G1SKF GI Cartilha 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3
G1SKR GI Cartilha 5'-CCA CAR ACC CCA TTR TAC A - '3
G2SKF GII Cartilha 5'-GGG CNT AGG GCG ATC GCA A - 3
G2SKR GII Cartilha 5'-GCA CCR CCN TRH CCR TTR TA CAT-3

Primers Tabela 5. Utilizados para a amplificação da região C da Região da Cápside (Kojima et ai., 2002). 5

Passo Temp (° C) Tempo (min)
1 60 30:00 síntese de cDNA
2 96 15:00 HotStart activação polimerase Taq
3 94 00:030
52 01:00 Ciclos 40X
72 00:30
4 72 10:00 Recozimento

Tabela 6. Perfil térmico para Taqman One-Step RT-PCR.

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Discussion

Usando o económico in-house método para isolar o ácido nucleico a partir de amostras de fezes, obtém-se resultados iguais como com o comercial QIAmp de RNA viral kit de Qiagen, e em conjunto com o TaqMan RT-PCR desenvolvido no nosso laboratório que pode detectar uma ampla gama de NoV genótipos pertencentes ao GI e GII genogrupo. Uma publicação recente da região C protocolo relataram taxas de genotipagem de 78% 6. Uma vez que a diversidade das cepas contemporâneas Nov tem vindo a aumentar nos anos anteriores, a taxa de sucesso vai depender dos desencontros de primers na região C para as amostras sendo testadas. O ensaio é útil para diagnóstico de rotina, pois elimina pós-amplificação de processamento do produto, encurtando assim o tempo de volta em torno do 7. Para além de diagnóstico, este protocolo pode também ser usado para o esclarecimento da epidemiologia de infecções Nov, sendo assim úteis para o controle de saúde pública da doença.

Ao executar o exame RT-PCR, negativos de controle (NC) reações de primers / sonda conjuntos não deve apresentar curvas de crescimento de fluorescência que cruzam a linha limite. Se um falso positivo ocorre com uma ou mais das reacções o conjunto de iniciadores / sonda NF, a contaminação da amostra pode ter ocorrido, e em todos os casos, a execução todo foi invalidado e repetido com a aderência mais rigorosa com as orientações.

Atravessar reacção para o rastreio de RT-PCR foi testada usando o GI e padrões positivos GII fornecido por CDC. Nenhuma reacção cruzada foi observada entre os primers e sondas GI com GII RNA e vice-versa. A reprodutibilidade do rastreio de RT-PCR foi elevada como CT-valores onde semelhante para execuções repetidas com RNA a partir dos controlos positivos. RNA a partir de amostras de fezes crianças que tinham sido encontrados positivo para NoV e tinha Ct-valores entre 20 e 33 onde subsequentemente amplificado pela RT-PCR convencional e enviada para a genotipagem. Cinco amostras positivas com Ct de valores entre 35 e 38 não foram enviados para seqüencialcing como a carga virai onde encontrado para ser demasiado baixo para a amplificação subsequente utilizando o RT-PCR convencional.

Actualmente, a disponibilidade de diagnóstico norovírus é limitada porque os métodos não são capazes de ser implementado em laboratórios locais com apenas equipamento básico. Este diagnóstico atrasos e tratamento nos casos de diarréia individuais ou em surtos. O método kit é confiável e rápido ainda requer uma quantidade significativa de tempo e recursos para o transporte de materiais para os países. O custo é três vezes maior do que o nosso método. Temos mostrado um método auxiliar usando prontamente disponíveis no país e os reagentes para a detecção de NoV que é igualmente simples, rápido e confiável. Este método custo-benefício ignora dependência de materiais adquiridos no exterior, os problemas de regulamentos internacionais e intra-nacional sobre o transporte que finalmente vai levar a um diagnóstico acessível e tratamento rápido de uma das causas mais comuns de gastroenterites virais em children.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao Centro Laboratório Nacional Calicivirus for Disease Control and Prevention (CDC) para a dom espécie de alguns aspectos positivos padrão e controle de Nov, e Laboratórios da Escola de Saúde Pública da Universidade Johns Hopkins para a prestação dos reagentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate Sigma-Adrich G9277
Tris HCL Sigma-Aldrich T5941
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Silica Sigma-Aldrich S5631
Triton X 100 VWR 14530
Diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) Qiagen 52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) Qiagen 204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) Qiagen 210212
Rnase Inhibitor 2000 units A. Biosystems N808-0119 2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes Ambion AM12450
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550-100

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References

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  7. Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
  8. Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).

Comments

1 Comment

  1. thanks a lot

    Reply
    Posted by: mohamed h.
    May 4, 2015 - 5:20 PM

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