Détection et Genogrouping des norovirus dans les selles des enfants en Taqman en une seule étape de RT-PCR

Medicine

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Summary

Un One-Step RT-PCR pour la détection et l'identification génogroupe des isolats de norovirus dans les selles des enfants, qui utilise des amorces et des sondes TaqMan spécifiques au cadre de lecture ouvert 1 (ORF1)-ORF2 région de jonction, la région la plus conservée du génome de Norovirus est décrit. Un non-commerciale, rentable méthode d'extraction d'ARN est détaillé.

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Apaza, S., Espetia, S., Gilman, R. H., Montenegro, S., Pineda, S., Herhold, F., et al. Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR. J. Vis. Exp. (65), e3232, doi:10.3791/3232 (2012).

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Abstract

Les norovirus (NoV) sont la principale cause des épidémies de gastro-entérite aiguë sporadique dans le monde entier chez les humains de tous âges. Ils sont cause importante d'hospitalisation chez les enfants ayant un impact de santé publique semblable à celle de rotavirus. NoV sont des virus à ARN de grande diversité génétique et il ya un aspect continu de nouvelles souches. Cinq génogroupes sont reconnus; GI et GII avec leurs nombreux génotypes et sous-types étant le plus important pour l'infection humaine. Cependant, le diagnostic de ces deux génotypes reste problématique, ce qui retarde le diagnostic et le traitement. 1, 2, 3

Pour l'extraction d'ARN à partir d'échantillons de selles de la méthode la plus couramment utilisée est le kit RNA viral QIAmp commercial de Qiagen. Ce procédé combine les propriétés de liaison d'une membrane de gel de silice, les tampons qui ARNases contrôle et fournir liaison optimales de l'ARN à la colonne ensemble avec la vitesse de MicroSpin. Cette méthode est simple, rapide et fiable et est carrIed dans quelques étapes qui sont détaillées dans la description fournie par le fabricant.

Norovirus est la deuxième à rotavirus est la cause la plus fréquente de la diarrhée. Diagnostic norovirus devrait être disponible dans toutes les études sur la pathogenèse de la diarrhée ainsi que dans les foyers ou les cas de diarrhée individuels. À l'heure actuelle le diagnostic norovirus mais est limitée à seulement quelques centres en raison de l'absence de méthodes simples de diagnostic. Ce diagnostic et le traitement des retards 1, 2, 3. En outre, en raison des coûts de transport et réglementé de tampons corrosifs à l'intérieur et entre les pays l'utilisation de ces kits manufacturés pose des problèmes logistiques. En conséquence, dans ce protocole, nous décrivons une alternative, économique, en interne la méthode qui est basée sur la bôme d'origine et al. La méthode 4 qui utilise les propriétés d'acides nucléiques de liaison de particules de silice ainsi que les propriétés anti-nucléase de thiocyanate de guanidinium .

et al. 5 est détaillé. Le séquençage du produit de PCR de la PCR conventionnelle permet la différenciation des génotypes appartenant à la GI et GII génogroupes.

Protocol

1. Des échantillons de selles

  1. Des échantillons de selles doivent être congelés afin de préserver l'ARN. Pour faire une suspension à 10% fécale, prenez environ 0,1 g de l'échantillon de selles décongelées et compléter à 1 ml avec du PBS.
  2. Aliquoter dans 200 ul d'éviter les cycles de gel et de dégel. Entreposer les aliquotes à -70 ° C.
  3. Décongeler et centrifuger à 4000 g aliquotes pendant 10 min avant de l'utiliser dans l'extraction.

2. Préparation de particules de silice pour l'extraction avec de la guanidine et de silice

  1. A RT, de suspendre 30 g de dioxyde de silicium et de compléter avec dH 2 O jusqu'à 250 ml.
  2. Après 24 heures de sédimentation, retirer 215 ml du surnageant par aspiration. Ajouter dH 2 O jusqu'à 250 ml, et de suspendre le culot de silice en secouant.
  3. Après encore 24 heures, éliminer le surnageant par aspiration, et ajuster le pH de la suspension de silice à pH 2,0, à l'aide d'acide chlorhydrique (HCl). Aliquoter la suspension de silice dans le verre botbouteilles et l'autoclave.

3. Préparation de L6 tampon pour l'extraction avec de la guanidine et de silice

  1. A RT, préparer L6 tampon en dissolvant 60 g de thiocyanate de guanidinium (GuSCN) et 1,3 g de Triton X-100 dans 50 ml de Tris 0,1 M de chlorhydrate, pH 6,4, et 11 ml d'une EDTA 0,2 M, pH 8,0 solution.

4. Préparation du Tampon L2 pour l'extraction avec de la guanidine et de silice

  1. A RT, préparer un tampon L2 en dissolvant 180 g de thiocyanate de guanidinium (GuSCN) dans 150 ml de 0,1 M Tris chlorhydrate, pH 6,4.

5. Procédure d'extraction

  1. Dans chaque extraction d'un échantillon de selles positif NoV, comme contrôle positif, et l'eau traitée au DEPC, comme contrôle négatif, devraient être inclus.
  2. Dans un tube à centrifuger micro-mélanger le suivant: 1 ml de tampon L6, 20 pl de particules de silice, et ajouter 200 ul de la suspension fécale extrait 10%. Vortexer brièvement et laisser à température ambiante pendant 15 min.
  3. Centrifuger la suspension à 6000 g pendant 10 s et laver le culot avec 1 ml de tampon L2 deux fois, suivi par deux lavages avec de l'éthanol 70% et un temps avec de l'acétone. Sécher le culot dans un bloc de chauffage à sec à 56 ° C pendant 5 min.
  4. Hydrater les ARN dans le culot de silice par addition de 50 pl de RNase dH 2 0. Ajouter 1 ul de RNasin, mélanger en retournant le tube et incuber à 56 ° C pendant 15 min.
  5. Centrifuger pendant 3 min à pleine vitesse, dans une centrifugeuse de table, et de recueillir 40 ul du surnageant contenant l'ARN.
  6. Quantifier les échantillons extraits d'ARN en utilisant Nanodrop 2000 spectrophotomètre (Thermo Scientific). Puis stocker à -70 ° C jusqu'à son utilisation, jusqu'à 6 mois. (Remarque: Une meilleure façon de préserver intacte l'ARN total est de le convertir en ADNc).

6. Extraction alternative utilisant l'ARN commercial QIAamp Viral RNA Kit

Les instructions complètes se trouvent dans le livret provided avec le kit QIAGEN. En bref, la procédure est comme suit:

  1. Ul 560 Pipet de tampon AVL contenant les ARN porteur dans un tube de 1,5 ml, et ajouter 140 ul de la suspension de selles de 10%. Mix par impulsions vortex pendant 15 secondes. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  2. Ajouter 560 ul d'éthanol (96-100%) pour l'échantillon et mélanger par impulsions vortex pendant 15 secondes, puis centrifuger brièvement.
  3. Appliquer 630 uL de cette solution à une colonne spin placé dans un tube de 2 mL de collecte. Centrifuger 1 min à 6000 g, puis placez la colonne de spin dans un tube de 2 ml propre.
  4. Laver la colonne contenant de l'ARN liés avec 500 uL de tampon AW1 et centrifuger à 6000 g pendant 1 min. Lieu colonne dans un endroit propre tube collecteur de 2 ml.
  5. Laver la colonne avec 500 ul de tampon AW2 et centrifuger à pleine vitesse (20.000 g ou 14 000 tpm) pendant 3 min.
  6. Colonne spin Placer dans un propre de 1,5 ml de micro-tube à centrifuger, ajouter 40 ul eau traitée au DEPC et éluer l'ARN à pleine vitesse. Répéter l'opération surCE pour un final 80 ul d'ARN élues.
  7. Quantifier les échantillons extraits d'ARN en utilisant Nanodrop 2000 spectrophotomètre (Thermo Scientific). Puis stocker à -70 ° C jusqu'à son utilisation, jusqu'à 6 mois. (Remarque: Une meilleure façon de préserver intacte l'ARN total est de le convertir en ADNc).

7. Détection des norovirus dans l'ARN extrait par une étape en temps réel RT-PCR avec des sondes TaqMan spécifiques

Instrument StepOnePlus PCR en temps réel des systèmes (Applied Biosystems).

Méthodologie

  1. Essuyer et nettoyer toutes les surfaces de travail, les pipettes et des centrifugeuses avec de la RNase, pour supprimer toute contamination éventuelle RNase.
  2. Déposer le GI et GII NoV de dépistage master mix selon le tableau 1. Primaires et sondes Taqman sont énumérés dans le tableau 2.
  3. Aliquote de 10 pl de mélange maître approprié à chaque tube de réaction.
  4. Ajouter 5 ul de l'échantillon non dilué inconnueARN, eau traitée au DEPC comme contrôle négatif, ou IG, respectivement GII contrôle positif ARN, les puits de réaction correspondantes. Tous les échantillons doivent être analysés en double. Les contrôles positifs et les normes de concentration de 300 ug / uL et 500 ug / uL respectivement ont été fournis par National Calicivirus Laboratoire de contrôle des maladies (CDC).
  5. Centrifuger la plaque de réaction à 6.000 g pendant 10 sec.
  6. Dans l'expérience les propriétés de l'écran; définir et sélectionner un type d'expérience pour la course. Assurez-vous que les réactifs TaqMan sont affichés comme le type de réactifs, et que lecture pré-PCR et l'amplification sont sélectionnés.
  7. Exécuter 15 réactions ul en utilisant le profil thermique dans le Tableau 3.
  8. Analyser les résultats.

8. Génotypage des NoV GI et GII aide conventionnelle RT-PCR et séquençage

(Il n'est pas mentionné dans cette vidéo car il s'agit d'une méthode commune et largement utilisé.)

Instrument. Applied Biosystems StepOne et StepOnePlus Systèmes Temps réel PCR avec le modèle Quantitec.

Méthodologie

  1. Avant le génotypage, le génogroupe (GI ou GII) des échantillons sont déterminés par la projection de RT-PCR décrite ci-dessus. GI NoV ARN doit être amplifié avec le mélange GI maître génotypage et le GII NoV ARN avec le mélange GII génotypage maître.
  2. Déposer le GI et GII NoV génotypage master mix conformément au tableau 4. Primaires GI SKF / SKR et G2 SKF / SKR sont énumérés dans le tableau 5.
  3. Aliquoter 45 ul du mélange maître approprié de tubes de 0,2 mL de réaction.
  4. Ajouter 5 pi de eau traitée au DEPC à chaque tube contrôle négatif, et 5 pi de présélection, NoV (GI et / ou GII) à ARN positif du tube de réaction correspondante.
  5. Exécuter 50 réactions ul en utilisant le profil thermique dans le Tableau 6.
  6. Envoyer produits PCR CONTAINing au moins 100 ng / pi de la région amplifiée de capside Macrogen Société pour la purification et le séquençage. (9700 Grande Sénèque autoroute. Rockville, MD 20850 et 10 $ par échantillon par séquençage).

9. Les résultats représentatifs

Figure 1
La figure 1 montre des résultats représentatifs de la Taqman One-Step RT-PCR lorsqu'il est utilisé à l'ARN de dosage extraites à partir d'échantillons de selles d'enfants diarrhéiques. Le cycle seuil (Ct) pour un échantillon positif a été fixé à inférieur ou égal à 37 pour Ct et Ct IG 39 pour GII. Le CT-valeurs pour les contrôles positifs ont été trouvés à moins de 27 et 18 de la jonction ORF1-ORF2 pour GI et GII, respectivement. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2

Mix Master Final Conc Volume (pi)
H 2 0 PCR 2,875
Quantitect RT-PCR Master Mix 1x 6,250
RT Mix 1x 0,125
50 uM Cog R amorce 1 uM 0,250
50 uM d'amorce F Cog 1uM 0,250
10 sonde Anneau uM 1 uM 0.125/0.250 *
10,00

* 0,250 ul de chaque sonde a été utilisée pour le test GI, tandis que 0.125 pi de chaque sonde a été utilisée pour les tests GII.

Tableau 1. Qiagen Quantitect master mix pour le dépistage GI et GII (Trujillo et al., 2006) 7.

Nom Geno-groupe Utiliser Séquence (5 'à 3')
Cog 1R IG Apprêt CTT AGA CCG CAT CAT CAT TYA C
Cog 1F IG Apprêt CGY TGG ATG CGN ATS CAT AG
Cog 2R GII Apprêt TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
Cog 2F GII Apprêt CAR GAR BCN ATG ATS AGR TGG ATG AG
Bague 1A IG Sonde FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1
1B Anneau IG Sonde FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1
Ring2-TP GII Sonde FAM-TGG GGC GAT GAG CCG AAT CT-BHQ-1

Tableau 2. Primer et des oligonucléotides sondes utilisées en temps réel RT-PCR quantitative pour génogroupes I, II (Kageyama et al.,2003) 8.

Étape Temp (° C) Temps (min)
1 50 30:00 synthèse de l'ADNc
2 95 15:00 Activation HotStart Taq polymérase
3 95 00:15
60 01:00 Cycles 45X

Table3. Le profil thermique pour une étape Taqman en temps réel RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7.

Mix Master Final Conc Volume (pi)
H 2 0 PCR 29,50
5X Qiagen RT-PCR Buffer 1x 10,00
10 mM dNTP Mix 0,4 mM 2,00
Mélange enzyme 2,00
40 U / uL RNAsin 20 U / uL 0,50
10 SKF uM 0,1 uM 0,50
10 SKR uM 0,1 uM 0,50
45,00

Tableau 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix pour le génotypage GI et GII.

Nom Geno-groupe Utiliser Séquence (5 'à 3')
G1SKF IG Apprêt 5'-CTG CCC GAA ATS GTA AAT GA - 3
G1SKR IG Apprêt 5'-ACC ACC ACC CAR TTR TAC A - '3
G2SKF GII Apprêt 5'-CNT GGG GCG AGG ATC GCA A - 3
G2SKR GII Apprêt 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3

Primaires Tableau 5. Utilisées pour l'amplification de la région C de la région de la capside (Kojima et al., 2002) 5.

Étape Temp (° C) Temps (min)
1 60 30:00 synthèse de l'ADNc
2 96 15:00 Activation HotStart Taq polymérase
3 94 00:030
52 01:00 Cycles 40X
72 00:30
4 72 10:00 Recuit

Tableau 6. Profil thermique pour Taqman One-Step RT-PCR.

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Discussion

Utilisation de l'économique dans la maison-méthode pour isoler l'acide nucléique à partir d'échantillons de selles, on obtient des résultats égaux avec le commercial QIAmp virale ARN kit de Qiagen, et avec le TaqMan RT-PCR développée dans notre laboratoire, nous permet de détecter un large éventail de NoV génotypes appartenant à la GI et GII génogroupe. Une publication récente du protocole de la région C ont signalé des taux de génotypage de 78% 6. Depuis la diversité des souches de NoV contemporains n'a cessé d'augmenter au cours des années précédentes, le taux de réussite dépendra des décalages d'amorces dans la région C pour les échantillons testés. Le test est utile pour diagnostic de routine, car elle élimine la transformation des produits de post-amplification, ce qui raccourcit le temps de rotation 7. Outre le diagnostic, ce protocole peut également être utilisé pour clarifier l'épidémiologie des infections NoV, étant ainsi utile pour le contrôle de la santé publique de cette maladie.

Lorsque vous exécutez le dépistage RT-PCR, contrôle négatif (NC) pour les réactions amorces / sondes ne doit pas présenter des courbes de croissance de fluorescence qui traversent la ligne de seuil. Si un faux positif se produit avec un ou plusieurs des réactions NC du jeu d'amorces / sonde, contamination de l'échantillon peut avoir eu lieu, et dans tous ces cas, tout le parcours a été invalidé et répété avec un respect plus strict des lignes directrices.

Réaction croisée pour le dépistage par RT-PCR a été testée à l'aide de la GI et GII normes positives fournies par les CDC. Aucune réaction croisée n'a été observée entre les amorces et les sondes gastro-intestinaux avec GII ARN et vice-versa. La reproductibilité de l'examen par RT-PCR a été élevé comme les valeurs Ct, où même pour des tirages répétés avec l'ARN à partir des contrôles positifs. ARN à partir d'échantillons de selles des enfants qui avaient été trouvés positifs pour les norovirus et avait les valeurs Ct entre 20 et 33, où la suite amplifié par la RT-PCR conventionnelle et envoyé pour le génotypage. Cinq échantillons positifs avec les valeurs Ct entre 35 et 38 n'ont pas été envoyés pour séquentielleCing que la charge virale où jugée trop faible pour l'amplification ultérieure à l'aide de la RT-PCR conventionnelle.

Actuellement, la disponibilité du diagnostic norovirus est limitée parce que les méthodes ne sont pas en mesure d'être mis en œuvre dans les laboratoires locaux avec seulement un équipement de base. Ce diagnostic et le traitement des retards dans les cas de diarrhée individuels ou en foyers. La méthode kit est fiable et rapide mais nécessite une quantité importante de temps et de ressources pour le transport de matériaux dans les pays. Le coût est de trois fois celle de notre méthode. Nous avons montré une méthode auxiliaire à l'aide facilement disponibles dans le pays des réactifs pour la détection des norovirus qui est tout aussi simple, rapide, et fiable. Cette méthode rentable contourne le recours à des matériaux achetés à l'étranger, les problèmes de réglementations internationales et intra-nationale sur le transport qui, à terme mener à un diagnostic accessible et un traitement rapide de l'une des causes les plus courantes de gastro-entérite virale dans le children.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Centre National Laboratory Calicivirus for Disease Control and Prevention (CDC) pour le don de la nature quelques points positifs standards et de contrôle pour NoV, et les laboratoires de l'École de santé publique de Johns Hopkins pour fournir des réactifs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate Sigma-Adrich G9277
Tris HCL Sigma-Aldrich T5941
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Silica Sigma-Aldrich S5631
Triton X 100 VWR 14530
Diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) Qiagen 52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) Qiagen 204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) Qiagen 210212
Rnase Inhibitor 2000 units A. Biosystems N808-0119 2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes Ambion AM12450
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550-100

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References

  1. Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
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  3. Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
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  5. Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
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  7. Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
  8. Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).

Comments

1 Comment

  1. thanks a lot

    Reply
    Posted by: mohamed h.
    May 4, 2015 - 5:20 PM

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