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采用TaqMan从儿童凳诺如病毒的检测和Genogrouping一步法RT-PCR技术

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Summary

一个一步法RT-PCR方法检测检测和孩子的大便,,利用引物和的TaqMan探针的开放阅读框(ORF1基因)的病毒ORF2交界地区,对诺沃克类病毒基因组中最保守的地区是特定genogroup诺沃克病毒分离鉴定描述。详述一个非商业化,具有成本效益的RNA提取方法。

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Apaza, S., Espetia, S., Gilman, R. H., Montenegro, S., Pineda, S., Herhold, F., Pomari, R., Kosek, M., Vu, N., Saito, M. Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR. J. Vis. Exp. (65), e3232, doi:10.3791/3232 (2012).

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Abstract

诺如病毒(NoVs)是在全球所有年龄的人散发性急性胃肠炎暴发的首要原因。他们是在与公共健康的影响类似于轮状病毒的儿童住院的重要原因。 NoVs RNA病毒的伟大的遗传多样性,并有不断涌现的新菌株。五genogroups是与他们的许多基因型和亚型的人类感染的最重要的认可; GI和GII。然而,这两个品种的诊断仍然是个问题,延误诊断和治疗。1,2,3

最常用的方法是从粪便标本中提取的RNA病毒RNA的QIAmp Qiagen公司的商业套件。这种方法结合硅胶膜结合特性,缓冲区控制核糖核酸酶和列提供最佳的RNA结合到一起的microspin速度。这种方法简单,快速和可靠的,是卡尔灭蝇灯,一个由制造商提供的说明中详述的几个步骤。

诺沃克病毒是仅次于轮状病毒腹泻的最常见的原因。诺沃克病毒感染的诊断应该是在腹泻的发病机制研究,以及在疫情或个别腹泻病例。但诺罗病毒的诊断,目前的限制,只是由于缺乏简单的诊断方法的几个中心。这延误诊断和治疗1,2,3。此外,由于国家内部和国家之间的成本和监管运输腐蚀性缓冲区使用这些生产工具包构成的后勤问题。因此,在这个协议中,我们描述的替代,经济,内部方法,这是基于对原有的繁荣等。方法4二氧化硅粒子的核酸结合特性一起使用异硫氰酸胍的抗核酸的性质。

。5高度可变的N-末端壳详细介绍。从常规PCR测序的PCR产物,使属于GI和GII的genogroups基因型分化。

Protocol

1。粪便样本

  1. 粪便标本应存放冷冻保存的RNA。使10%的粪便暂停,解冻的粪便样本约0.1克和完成1毫升的PBS。
  2. 取200μL,以避免反复冻融。储存在-70°C等分
  3. 解冻,并在提取前10分钟离心4000克的等分。

2。二氧化硅粒子的制备与胍和二氧化硅的提取

  1. 在室温下,暂停30 g和二氧化硅与DH 2 O完成250毫升。
  2. 经过24小时的沉淀,去除吸入215毫升上清。新增卫生署2 250毫升,暂停摇动二氧化硅颗粒。
  3. 24小时后,取出吸上清,调整的二氧化硅悬浮液的pH值,pH值2.0,使用盐酸(HCl)。二氧化硅悬浮液分装在玻璃BOTtles和釜。

3。与胍和二氧化硅的提取制备的L6缓冲区

  1. 在室温下,准备由溶解在0.1米的Tris盐酸,pH值6.4,0.2 M EDTA,pH值8.0的解决方案和11毫升50毫升60克异硫氰酸胍(GuSCN)和1.3Ğ的Triton X-100的L6缓冲区。

4。与胍和二氧化硅的提取制备的L2缓冲

  1. 在室温下,准备180克(GuSCN)的异硫氰酸胍溶解在150毫升0.1米三盐酸盐,pH值6.4的L2缓冲。

5。提取工艺

  1. 十一月阳性的粪便样品在每个提取,作为阳性对照,DEPC处理水,作为阴性对照,应列入。
  2. 在微型离心管中混合以下; 1毫升缓冲L6,20μL二氧化硅微粒,添加200μL10%的粪便提取物悬浮。涡短暂离开在室温为15英里N。
  3. 离心6000克暂停10秒,并用L2缓冲1毫升的沉淀两次,由两个清洗用70%乙醇与丙酮和一个时间。在56°C间加热块干燥5分钟沉淀。
  4. 水合二氧化硅颗粒的RNA加入50μL无RNase的DH 2 0。 15分钟,加入1μL,RNasin,混合反相管孵育56°C间。
  5. 离心3全速分钟,在台式离心机,并收集40μL含有RNA的上清液。
  6. 使用的NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific的)量化提取的RNA样品。然后存放于-70℃直至使用,长达6个月。 ( 注:一个更好的方式来保存完整总RNA转换成cDNA)。

6。替代的提取,使用商业RNA采用QIAamp病毒RNA试剂盒

发现在这本小册子省充分说明与凯杰套件ided。简要过程如下:

  1. 缓冲区的AVL吸取560μL,含1.5 mL管载体的RNA,加入140μL10%的粪便暂停。脉冲涡旋混合15秒。在室温下孵育10分钟。
  2. 为15秒加560μL乙醇(96-100%)和脉冲涡旋混合样品,然后短暂离心。
  3. 适用于630μL解决自旋列放置在一个2 ml收集管。离心1分钟6000克;然后放入一个干净的2 mL试管离心柱。
  4. 洗列,含500μL的Buffer AW1,离心1分钟6000Ğ结合的RNA。在一个干净的2 ml收集管的地方列。
  5. 500μL缓冲AW2和离心机全速(20000克或14000转)3分钟,洗净列。
  6. 放置在一个干净的1.5 ml的微离心管中离心柱,添加40μLDEPC处理过的水洗脱全速的RNA。重复上最终80μL洗脱RNA的CE。
  7. 使用的NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific的)量化提取的RNA样品。然后存放于-70℃直至使用,长达6个月。 ( 注:一个更好的方式来保存完整总RNA转换成cDNA)。

7。一步与特定的TaqMan探针实时定量RT-PCR技术检测诺沃克病毒中提取的RNA

仪器StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems公司)。

方法论

  1. 擦拭和清洁用RNase所有工作表面,移液器,离心机,以消除任何潜在的RNase污染。
  2. 吸取11月GI和GII筛选主混合根据表1。引物和TaqMan探针列于表2。
  3. 适当的高手组合到每个反应管分装10μL。
  4. 加入5μL稀释的未知样品作为阴性对照的RNA,DEPC处理过的水,或胃肠道分别GII的阳性对照RNA,相应的反应井。所有样品应运行一式两份。阳性对照和标准浓度为300微克/μL和500微克/微升,分别由国家杯状病毒实验室疾病控制和预防中心(CDC)提供。
  5. 持续10秒离心6000克的反应板。
  6. 在实验中的属性屏幕;定义和选择运行实验的类型。确保TaqMan试剂的试剂类型,读,预PCR扩增被选中显示。
  7. 运行15μL的反应,在表3中使用的热剖面。
  8. 分析结果。

8。十一月GI和GII使用常规RT-PCR和测序的基因分型

(它没有提到这部影片,因为它是一种常见和广泛使用的方法。)

仪器。应用生物系统公司StepOne扩增和StepOnePlus实时PCR系统与Quantitec模板。

方法论

  1. 基因分型,前genogroup(GI或GII)的样品RT-PCR方法上面介绍的筛选确定。胃肠月RNA有胃肠基因分型的主结构和全球信息基础设施与全球信息基础设施的基因分型预混月的RNA扩增。
  2. 吸取11月GI和GII基因分型主混合根据表4。引物胃肠SKF / SKR和G2 SKF / SKR型列于表5。
  3. 分装45μL适当的主组合,以0.2 ml反应管。
  4. 加入5μLDEPC处理过的水,每个阴性对照管和5μL预先筛选,NOV(GI和/或GII)的相应的反应管中的积极RNA。
  5. 运行50μL的反应,在表6中使用的热剖面。
  6. 发送PCR产物contai宁至少100毫微克/μL,扩增衣壳地区Macrogen公司纯化及测序。 (9700塞内卡大高速公路洛克维尔,MD 20850,每测序样品10元)。

9。代表结果

图1
图1显示的TaqMan一步法RT-PCR技术用于检测RNA的腹泻儿童的粪便样本中提取的具有代表性的结果。循环阈值(CT)为阳性样本被设定在小于或GI和CT 39 GII的平等的CT 37。被发现为阳性对照的Ct值小于27和18,分别为GI和GII的ORF1的ORF2交界。 点击这里查看大图

图2
图2

预混 终浓度 量(μl)
H 2 0聚合酶链反应 2.875
quantitect RT-PCR扩增预混 1X 6.250
逆转录混合 1X 0.125
50μM的齿轮ŕ底漆 1 mM 0.250
50微米齿轮F底漆 1μM的 0.250
10微米环探头 1 mM 0.125/0.250 *
10.00

* 0.250μL每个探头用于胃肠道测试,而0.125μL每个探头GII的测试。

表1。Qiagen公司Quantitect主筛选GI和GII的组合(特鲁希略 ,2006)7。

名称 基因型组 使用 序列(5'至3')
COG 1R 胃肠道底漆铁通AGA公司总部大楼猫猫猫TYAÇ
COG 1F 胃肠道底漆 CGY TGG ATG的慢性肾小球肾炎的TTY的CAT GA
COG 2R 全球信息基础设施底漆 TCG的ACG的CCA大老山隧道氯乙酸交委会ACA
COG 2F 全球信息基础设施底漆车噶尔BCN ATG的TTY的地带TGG ATG的公司
环1A 胃肠道探测器 FAM-AGA TYG海巡署个TCY建GTC CA-BHQ-1
环1B 胃肠道探测器 FAM-AGA TCG的千代田大老山隧道建GTC CA-BHQ-1
ring2-TP 全球信息基础设施探测器票价调整机制的TGG聚糖GGC GAT的政府总部大楼亚洲空运中心的CT-BHQ-1

表2。genogroups我,二(荫山等。用于实时定量RT-PCR的引物和探针寡核苷酸2003)8。

步骤 温度(℃) 时间(分钟)
1 50 30:00 cDNA合成
2 95 15:00 热启动的Taq聚合酶活化
3 95 00:15
60 01:00 45X周期

3。热剖面一步TaqMan实时RT-PCR技术(特鲁希略 ,2006)7。

预混 终浓度 量(μl)
H 2 0聚合酶链反应 29.50
5X Qiagen公司的RT-PCR缓冲液 1X 10.00
10毫米dNTP混合液 0.4毫米 2.00
酶混合物 2.00
40U /μL,RNAsin 20 U /μL的 0.50
10μM的SKF公司 0.1微米 0.50
10μM的SKR型 0.1微米 0.50
45.00

表4。Qiagen公司的一步法RT-PCR主混合基因型GI和GII。

名称 基因型组 使用 序列(5'至3')
G1SKF 胃肠道底漆 5'-CTG的CCC认证棉酚的TTY多伦多亚洲空运中心的GA - 3
G1SKR 胃肠道底漆 5'-CCA ACC汽车文建TTR的交谘会的一个 - '3
G2SKF 全球信息基础设施底漆 5'-CNT GGG AGG的图文影像集团航管贲门癌一个 - 3
G2SKR全球信息基础设施底漆 5'-CCR的CCN的GCA的TRH的CCR的TTR的TA的CAT-3

表5。引物用于扩增地区衣壳地区℃(小岛,2002年) 。5。

步骤 温度(℃) 时间(分钟)
1 60 30:00 cDNA合成
2 96 15:00 热启动的Taq聚合酶活化
3 94 0时03分0
52 01:00 40X周期
72 00:30
4 72 10:00 退火

表6。热的TaqMan一步法RT-PCR技术的个人资料。

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Discussion

我们使用内部方法从粪便标本中分离核酸的经济,商业QIAmp病毒RNA试剂盒Qiagen公司获得平等的结果,并连同荧光定量RT-PCR技术在我们的实验室开发的,我们可以检测到了11月的广泛属于GI和GII的genogroup的基因型。最近出版的C区协议的基因分型率78%6。往年由于当代十一月株的多样性已在增加,成功率将取决于被测试的样品中地区ç引物的错配。常规诊断法是有用的,因为它消除了放大后的产品加工,从而缩短解决时间7之交。除了诊断,这个协议也可以被用于澄清十一月感染的流行病学,从而有助于本病的公共卫生控制。

当运行的筛选RT-聚合酶链反应,阴性对照组(NC)引物/探针组的反应不应该表现出荧光增长曲线跨越的门槛线。如果与一个或多个引物/探针组的数控反应发生假阳性,样品污染可能发生,在这种情况下,整体而言是无效的,并严格遵守的准则重复。

交叉反应的筛选,RT-PCR方法进行疾病预防控制中心提供的GI和GII的阳性标准。之间无交叉反应,观察胃肠道的引物和探针与GII的RNA,反之亦然。 RT-PCR技术筛选重复性的CT值高的地方重复运行与RNA阳性对照相似。 RNA从儿童的粪便样本被发现呈阳性月,CT值在20和33,其中随后由传统的RT-PCR技术扩增和基因分型发送。五阳性标本与CT-35和38之间的值不为sequen发送庆安作为病毒载量,在后续使用常规RT-PCR技术扩增太低。

目前,诺罗病毒诊断的可用性是有限的,因为这些方法是不是只有基本的设备能够在当地的实验室实施。这延误诊断和治疗,在个别腹泻病例或暴发。该试剂盒的方法是可靠和快速的,还需要时间和资源的运送材料到国家的重大金额。成本是我们的方法的三倍。我们已经表明随时可用的11月,是同样简单,快速和可靠的检测试剂在国内使用的辅助方法。这种成本效益的方法绕过对材料的依赖国外购买的,其运输的国际和国家内部的规定,这最终将导致一个可访问的诊断和一个快速治疗最常见的病毒性肠胃炎的原因,在CH的问题ildren。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

笔者想感谢月的标准和控制阳性礼物的国家杯状病毒实验室为疾病控制和预防中心(CDC),并提供试剂在约翰霍普金斯大学公共卫生学院的实验室。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate Sigma-Adrich G9277
Tris HCL Sigma-Aldrich T5941
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Silica Sigma-Aldrich S5631
Triton X 100 VWR 14530
Diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich D-5758
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) Qiagen 52906
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) Qiagen 204443
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) Qiagen 210212
Rnase Inhibitor 2000 units A. Biosystems N808-0119 2000 unids/vial
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes Ambion AM12450
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550-100

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References

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Comments

1 Comment

  1. thanks a lot

    Reply
    Posted by: mohamed h.
    May 4, 2015 - 5:20 PM

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