הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Bioengineering
 

ERRATUM NOTICE

Summary

תהליך מלא של הכנת הדגימה המוח הדמיה חתך סדרתי באמצעות מיקרוסקופ כסכין סריקה, עד ראיה וניתוח של נתונים מתואר. טכניקה זו משמשת כיום לרכוש במוח העכבר נתונים, אך הוא החלים על איברים אחרים, מינים אחרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התקדמות ניכרת תפוקה גבוהה, ברזולוציה גבוהה, שיטות מיקרוסקופיה 3D אפשרו רכישת כמויות גדולות של נתונים neuroanatomical ברזולוציה submicrometer. אחד הכלים הראשון מסוגו, בהפקת המוח כולו בקנה מידה הנתונים הוא מיקרוסקופ כסכין סריקה (KESM) 7, 5, 9, שפותחה ואירוח במעבדה של המחברים. KESM שימש סעיף ו כל דמות העכבר מוחות ברזולוציה submicrometer, חושף את הפרטים המורכבים של רשתות נוירונים (Golgi) 1, 4, 8, רשתות כלי דם (דיו הודו) 1, 4, גוף התא הפצה (Nissl) 3 . השימוש KESM אינו מוגבל העכבר ולא את המוח. יש לנו הדמיה בהצלחה את המוח תמנון 6, ריאות העכבר במוח חולדה. כרגע אנחנו עובדים על כל עוברי דג הזברה. נתונים כאלה יכול מאוד לתרום connectomics מחקר 10; אל microcirculation ומחקר hemodynamic וכן מחקר stereology ידי proviדינג מדויק הקרקע האמת.

במאמר זה נתאר את הצינור, כולל הכנת הדגימה (תיקון, צביעה, והטבעה) תצורה KESM וההתקנה, חתך הדמיה עם KESM, עיבוד תמונה, הכנת נתונים, נתונים להדמיה וניתוח. הדגש יהיה על הכנת הדגימה ויזואליזציה / ניתוח של נתונים שהתקבלו KESM. אנו מצפים פרוטוקול מפורט שהוצג במאמר זה כדי לעזור להרחיב את הגישה KESM ולהגדיל את ניצול שלה.

Protocol

1. הכנת הדגימה: Golgi-Cox

  1. פרוטוקול זה מקרוב אחרי פרוטוקול של Mayerich et al. 7.
  2. עכבר C57BL/6J הוא מורדם באמצעות הרדמה עמוקה נשימתית isoflurane ו ערופה אז.
  3. המוח הוא הסיר והניח לתוך פתרון Golgi-קוקס קיבעון (1% אשלגן כרומטי, dichromate אשלגן 1%, ו כלוריד כספיתי 1% במים deionized).
  4. המוח הוא נשאר פתרון Golgi-קוקס בחושך, בטמפרטורת החדר, במשך 10 עד 16 שבועות.
  5. מוחות הם ושטף במים deionized לילה בחושך.
  6. המוח ושטף הוא שקוע בפתרון 5% אמוניום הידרוקסיד במים deionized במשך 7 עד 10 ימים בחושך בטמפרטורת החדר. הפעם היה הכנה ממושכת כדי להבטיח חדירה של המוח כולו, כך נמהרת שחור היה סיכוי לחלוטין צורה ברקמה.
  7. המוח הוא שטפה שוב בטמפרטורת החדר במים deionized במשך 4 שעות ו t50% ו 70% במקרר (4 ° C), ו - 85%, 95% (3 שינויים), ו -100% (4-5 שינויים) בטמפרטורת החדר: מיובש דרך סדרה מדורגת של אתיל אלכוהול תרנגולת. המוח הוא נשאר פתרון עבור כל 24 שעות.
  8. המוח מיובש הוא לשים אז אצטון (3-4 שינויים, כל יום אחד), ואחריו תערובת araldite-אצטון עם יחס araldite ל-אצטון של 01:02, 01:01, 02:01, ולבסוף araldite 100% (3 שינויים, כל פעם במשך הלילה), במקרר (4 ° C).
  9. לבסוף, במוח המטופל מוטבע araldite 100% מחומם ל 60 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים (ראה פרוטוקול הטבעה של אבוט Sotelo 2).
    אם דגימות המוטבעים LR הלבן ואז דגימות מועברים מפתרון אתנול האחרון 100% באמצעות שלושה שינויים של פתרון הלבן LR, כי הם כל הזמן במקרר למשך הלילה, שהוא הליך סטנדרטי לקראת פילמור. שלושה שינויים נעשים כדי להבטיח חדירה מלאה. הדגימה היא לאתרנגולת הועבר טרי LR הלבן כי הוא polymerized בכלי סגור ב 60 ° C למשך 24 שעות, המהווה את הסכום הנדרש של זמן וטמפרטורה של פילמור תקין.
  10. איור. 1 מראה המוח Golgi-קוקס מוכתם מוטבע Araldite.
  11. הבלוק הדגימה נרפא מותקן אז על טבעת המתכת הדגימה באמצעות אפוקסי, והצדדים של גוש גזוז לפי הצורך (ראה איור. 2).

2. הכנת הדגימה: Nissl

  1. העכבר הוא מורדם באמצעות עמוק קטמין ו xylazine (1.7 מ"ג קטמין / 0.26 xylazine מ"ג לכל 20 גרם משקל גוף) intraperitoneally מוזרק ואז perfused transcardially באמצעות 50 מ"ל של בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (pH 7.4), ואחריו 250 מ"ל של החדר טמפרטורה של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין (pH 7.4). ולבסוף עם 3.0 סמ"ק של דיו הודו חי.
  2. זלוף גוף שלמות עם מלח ו מקבע יש צורך לנקות את הדם ממערכת הלב וכלי הדם כדי לתקן את טי ssues. זלוף בדיו הודו יש צורך לחלוטין למלא את כלי הדם של מערכת הלב וכלי הדם.
  3. המוח וכתוצאה מכך הוא מיובש אז דרך סדרה של ציון אתיל אלכוהול (25% -100%) ו מוטבעים אז פלסטיק araldite בעקבות פרוטוקול של 1.8-1.9 לעיל. אם LR לבן הוא המדיום הטבעה אז פרוטוקול ב 1.10 לעיל אחריו.

4. הכנת הדגימה: מינים גנרי, איברים גנריות

  1. עבור המקרה גנריות, קיבוע ניתן לעשות גם עם paraformaldehyde 10% שנאגרו נייטרלי% פורמלין או 4.
  2. עבור אמצעי אחסון רקמה קטן, דיפוזיה במקום זלוף מומלץ קיבעון ו מכתים. במקרה של אורגניזמים או איברים קטנים, מכתים גם ניתן לעשות בתהליך התייבשות.
  3. פרוטוקול הטבעה זהה לעיל, אם כי פעמים חדירה הפתרון יכול להיות מופחת עבור איברים או אורגניזמים קטנים בהרבה במוח העכבר כולו.
jove_title "> 5. KESM ההתקנה הדמיה

  1. כבה את המשאבה, בתורו על הבמה, להדליק מצלמה, להדליק את הפנס.
  2. תרים סכין אובייקטיבי.
  3. התקנת טבעת הדגימה.
  4. הדגימה מדוד מימד ליצור קובץ תצורה עבור היישום KESM שלב Controller2.
  5. התחל KESM שלב Controller2 ו לאתחל שלב.
  6. סכין תחתון / אובייקטיבי, להפעיל את המשאבה.
  7. פוקוס אובייקטיבי המצלמה, על ידי סיבוב ידית התמקדות הרכבת אופטיים התאמת השדה של המצלמה להציג יחסית קצה הסכין.
  8. לחצו על [עבור] ליזום הדמיה.
  9. ראה תאנים. 3-8. ראה 9, 7 לפרטים טכניים.

6. עיבוד תמונה והכנת נתונים

  1. העתק את סטאק KESM הפעלה מעבד לתוך תיקיית הנתונים תחת התיקיה את קובץ הקונפיגורציה (00,000, 00,001 וכו ').
  2. הפעל את מעבד סטאק KESM להסיר חפץ תאורה לנרמל את עוצמת רקע כלתמונות. חזור על הפעולה עבור כל תיקיות המשנה נתונים.
  3. הכינו אריחים multiscale מהנתונים להגדיר ולהעלות והקים את הקבצים לשרת אטלס KESM המוח האינטרנט.
  4. ראה איור. 9.

7. נתונים להדמיה וניתוח

  1. להדמיה באמצעות אטלס המוח KESM. עבור http://kesm.cs.tamu.edu ובחר אטלס המתאים.
    1. נווט כמו ב-Google Maps.
    2. זום פנימה והחוצה כמו ב-Google Maps.
    3. כדי לעבור אל עומק אחר, בחר כמה עמוק ללכת בכל שלב מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן לחץ על או [+] או [-] כדי להגדיל או להקטין עומק z.
    4. התאם את מספר כיסוי באמצעות התפריט הנפתח.
    5. התאם את המרווח כיסוי באמצעות התפריט הנפתח.
    6. ראה איור. 11.
  2. להדמיה באמצעות MeVisLab.
    1. השקת MeVisLab.
    2. יצירת פרוייקט חדש.
    3. בחודש הבא, מודולים חדשים ניתן ליצור על ידי tyפינג בשם מודול בתיבה פקודה.
    4. יצירת מודול [Compose3Dfrom2DFiles], וללכת אל התיקיה הרצויה. הזן מחרוזת הקובץ לחץ [GetFileList]. ודא את התמונות הנבחרות יכול להתאים בזיכרון. לחץ [Create3D] כדי ליצור נפח.
    5. יצירת מודול [SetWorldMatrix], וכן להגדיר את "סולם" תחת "הופך היסודי" x, y, z לגודל voxel המתאים (0.6, 0.7, 1.0 למטרה 0.45NA 10X). קישור [Compose3Dfrom2DFiles] ל [SetWorldMatrix].
    6. סט מטריקס הופכת תחת "הרכב מטריקס" ל "התעלם", "התעלם", "קדימה".
    7. יצירת מודול [Arithmetic1] וקבע את "פונקציה" על "הפוך (Max-IMG)".
      קישור [SetWorldMatrix] ל [Arithmetic1].
    8. יצירת מודול [View3D] וחבר [Arithmetic1].
    9. ב View3D, בעוד הלחצן הימני של העכבר לחוץ, הזז את העכבר מסביב כדי להתאים את הסף. אתה יכול לחתוך אזורים, נטייה לשנות (להזיז את העכבר בזמן לחצן העכבר השמאלי לחוץ), לשנות את התאורה (renderin נפחגרם או MIP), להפוך on / off רקע, וכו '
    10. ראה איור. 10.

8. נציג תוצאות:

כאן, אנו מציגים המוח כולו נתונים ופרטים. תאנים. 12-15 להראות המוח כולו הודו דיו, Golgi, ונתונים Nissl סטים 1, 4, 3.

איור 1
באיור 1. במוח העכבר קבוע, מוכתם, ומוטבעים

איור 2
באיור 2. Embedded המוח הדגימה עכבר רכוב על טבעת את הדגימה.

איור 3
באיור 3. סכין The Edge סריקת מיקרוסקופ (KESM). תמונה של KESM מוצג עם הרכיבים העיקריים שלה מסומן: (1) במהירות גבוהה קו סריקה המצלמה, (2) המטרה מיקרוסקופ, (3) הרכבה יהלום סכין collimator אור, (4) speטנק cimen (הדמיה טבילה במים), (5) בשלושה צירים דיוק אוויר נושאי הבמה, (6) לבן אור הפנס מיקרוסקופ, (7) משאבת מים (מאחור) להסרת רקמה מחולק, (8) PC שרת לבקרת הבמה רכישת התמונה, (9) בסיס גרניט (10) גשר גרניט.

איור 4
איור 4. עקרונות הדמיה של KESM. המנהל המבצע של KESM מודגם. המטרה ואת סכין מוחזק במקום, בעוד הדגימה מודבקת על הבמה נע מיצוב (חץ עם קו מוצק) ברזולוציה של 20 ננומטר ומהירות הנסיעה של 1-5, ומקבל והשתפשפה סכין יהלום (5 מ"מ רחב עבור המטרה 10X), יצירת קטע דק זורם על הסכין (חץ עם קו מוצק). קו סריקה הדמיה נעשה ליד קצה מאוד של הסכין.

איור 5
איור 5. המצלמה KESM בקרות התמקדות אובייקטיבי.

איור 6
איור 6. הרכבה KESM סכין שולטת.

איור 7
איור 7. ראשוני התמקדות דרך נמל תצפית.

איור 8
איור 8. Controller KESM שלב 2 בקשה (צילום מסך).

איור 9
איור 9. מעבד KESM מחסנית היישומים (צילום מסך).

איור 10
איור 10. היישום MeVisLab (צילום מסך).

איור 11
איור 11 KESM המוח אטלס:. ממשק אינטרנט (צילום מסך).

איור 12
איור 12. KESM המוח כולו נתונים הודו דיו. חזותיים נפח ערימות KESM הנתונים מוצגים עבור ערכת נתונים וסקולרית. (א) מקרוב של הנתונים של כלי הדם. רוחב 100 ~ אממ. (BD) שלוש תצוגות סטנדרטיות של המוח כולו עכבר vasculature (subsampled מתוך נתונים ברזולוציה גבוהה). רוחב ~ 10mm.

איור 13
איור 13. המוח כולו KESM עכבר נתונים Golgi.

איור 14
איור 14. KESM Golgi פרטים נתונים.

איור 15
איור 15. KESM המוח כולו נתונים Nissl. (א) תקריב של Nנתונים issl. אממ ~ 300 3. (BD) שלוש תצוגות סטנדרטיות של המוח נתונים שלם עכבר Nissl (subsampled מתוך נתונים ברזולוציה גבוהה). חתך הראו עבור תצוגה ברורה של מבנים פנימיים.

Discussion

KESM מאפשרת סקר submicrometer ברמה של כמויות גדולות של דגימות ביולוגיות (~ 1 ס"מ 3). סוג זה של נפח הוא מספיק כדי להכיל את כל האיברים בעלי חיים קטנים, כמו המוח, הריאות, הלב, הכליות, ועוד תמונות סרוקות מאיברים אלה יכולים לספק מידע כמותי חסר תקדים על הארגון המבני של איברים אלה, ולאפשר מודלים חישוביים של פונקציונליים שונים היבטים של איברים אלה, כולל דינמיקה מעגל רשת, תכונות חשמליות, נוזלים וזרימה הדינמיקה אוויר, ואת הדינמיקה שרירים.

הכנת הדגימה פרוטוקול שלאחר ניתוח פרוטוקול מפורט במאמר זה צפויים לעזור קבוצות מחקר מחוץ יש גישה קלה יותר KESM לבין הנתונים המתקבלים. הפרוטוקול מבצע KESM יעזור אלה חוקרים חיצוניים כדי להעריך את היתרונות והמגבלות של שיטת הדמיה ייחודית זו.

Disclosures

טוד האפמן הוא עם 3Scan, חברה מסחרית המייצרת ומשווקת טכנולוגיה KESM (פטנט בארה"ב # 6744572).

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, 0079874 #), תוכנית טכנולוגיה מתקדמת טקסס (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), טקסס A & M Research Foundation, הפקולטה למדעי המחשב והנדסה באוניברסיטת טקסס A & M האוניברסיטה, 3Scan. ברצוננו להודות ברנרד Mesa (Micro Star Technologies) להתייעצות ותמיכה טכנית עבור מכשור KESM. החלקים העיקריים של התכנון והיישום של KESM נעשה על ידי ברוס ח מקורמיק, שנפטר בשנת 2007.

References

  1. Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).
  2. Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
  3. Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
  4. Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
  5. Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
  6. Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
  7. Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
  8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
  9. McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
  10. Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  2. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  3. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  4. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  5. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  6. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  7. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  8. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  9. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

to:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
  2. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
  3. The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
  4. After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
  5. The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
  6. After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics