Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Bioengineering
 

ERRATUM NOTICE

Summary

Het volledige proces van de hersenen prepareren op de seriële snijden beeldvorming met behulp van de Knife-Edge Scanning Microscope, om data visualisatie en analyse wordt beschreven. Deze techniek wordt momenteel gebruikt om de hersenen van muizen gegevens te verwerven, maar het is van toepassing op andere organen, andere soorten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Choe, Y., Mayerich, D., Kwon, J., Miller, D. E., Sung, C., Chung, J. R., Huffman, T., Keyser, J., Abbott, L. C. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. J. Vis. Exp. (58), e3248, doi:10.3791/3248 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Grote vooruitgang in high-throughput, hoge resolutie, 3D-microscopie technieken in staat hebben gesteld de aankoop van grote hoeveelheden gegevens op neuroanatomische submicrometer resolutie. Een van de eerste dergelijke instrumenten produceren de hersenen als geheel schaal data is het Knife-Edge Scanning Microscoop (KESM) 7, 5, 9, ontwikkeld en gehost in de auteurs 'lab. KESM is gebruikt om sectie en het imago hele muis hersenen op submicrometer resolutie, waaruit de ingewikkelde details van de neuronale netwerken (Golgi) 1, 4, 8, vasculaire netwerken (Oost-Indische inkt) 1, 4 en cellichaam distributie (Nissl) 3 . Het gebruik van KESM is niet beperkt tot de muis, noch de hersenen. We hebben met succes belicht de octopus hersenen 6, muis longen en hersenen van de rat. We zijn momenteel bezig met hele zebravis embryo's. Gegevens als deze kunnen veel bijdragen aan connectomics onderzoek 10, om de microcirculatie en hemodynamische onderzoek, en om stereology onderzoek door de bepalingenDing een exacte grond-waarheid.

In dit artikel beschrijven we de pijplijn, waaronder prepareren (vaststelling, vlekken, en inbedding), KESM configuratie en installatie, snijden en beeldvorming met de KESM, beeldverwerking, data voorbereiding, en data-visualisatie en analyse. De nadruk zal liggen op prepareren en visualisatie / analyse van de verkregen KESM gegevens. We verwachten dat het gedetailleerd protocol in dit artikel om te helpen de toegang tot KESM en verhoging van het gebruik ervan te verbreden.

Protocol

1. Prepareren: Golgi-Cox

  1. Dit protocol sluit nauw aan bij het ​​protocol van Mayerich et al.. 7.
  2. De C57BL/6J muis is diep verdoofd met isofluraan inhalatie-anesthesie en vervolgens onthoofd.
  3. De hersenen is verwijderd en geplaatst in een Golgi-Cox fixatie-oplossing (1% kalium chromaat, 1% kaliumdichromaat, en 1% kwikchloride in gedeïoniseerd water).
  4. De hersenen zijn nog in de Golgi-Cox-oplossing in het donker, bij kamertemperatuur, voor 10 tot 16 weken.
  5. De hersenen zijn gespoeld in gedemineraliseerd water 's nachts in het donker.
  6. De hersenen gespoeld wordt ondergedompeld in een 5% ammoniumhydroxideoplossing in gedeïoniseerd water voor 7 tot 10 dagen in het donker bij kamertemperatuur. Deze lange voorbereidingstijd was om infiltratie van de hele hersenen zorgen, zodat de zwarte neerslag een kans om geheel vormen in het weefsel had.
  7. De hersenen zijn weer gespoeld in gedemineraliseerd water bij kamertemperatuur gedurende 4 uur en tkip gedehydrateerd door middel van een gegradeerde reeks van ethyl alcohol: 50% en 70% in de koelkast (4 ° C), en 85%, 95% (3 veranderingen), en 100% (4 tot 5 veranderingen) in de kamertemperatuur. De hersenen zijn nog in elke oplossing voor 24 uur.
  8. De gedroogde hersenen wordt vervolgens in aceton (3 tot 4 veranderingen, elk voor een dag), gevolgd door een Araldite-aceton-mengsel met Araldite-to-aceton-verhouding van 1:2, 1:1, 2:1, en tenslotte in 100% Araldite (3 verandert, elke keer 's nachts), in de koelkast (4 ° C).
  9. Tenslotte wordt de behandelde hersenen zijn ingebed in 100% Araldite en verwarmd tot 60 ° C gedurende 3 dagen (cf. inbedding protocol in de Abbott en Sotelo 2).
    Indien monsters zijn ingebed in LR White dan de specimens worden overgedragen van de laatste 100% ethanol-oplossing door middel van drie veranderingen van LR White oplossing die elk bewaard nacht in de koelkast, dat is een standaard procedure, voorafgaand aan polymerisatie. Drie wijzigingen zijn doen om de volledige infiltratie te verzekeren. Het monster is tkip overgezet op vers LR White, dat is gepolymeriseerd in een ongeopende verpakking bij 60 ° C gedurende 24 uur, dat is de benodigde hoeveelheid tijd en temperatuur voor een goede polymerisatie.
  10. Fig. 1 toont een Golgi-Cox-lood hersenen ingebed in Araldite.
  11. De uitgeharde monster blok is vervolgens gemonteerd op de metalen ring met behulp van epoxy monster, en de zijkanten van het blok gesneden als nodig is (zie Fig. 2).

2. Prepareren: Nissl

  1. De muis is diep verdoofd met behulp van ketamine en xylazine (1,7 mg ketamine / 0,26 mg xylazine per 20 gram lichaamsgewicht) intraperitoneaal geïnjecteerd en vervolgens doorbloed transcardially met behulp van 50 ml van de ruimtetemperatuur fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), gevolgd door 250 ml room temperatuur 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7,4). en ten slotte met 3,0 cc van onverdunde Oost-Indische inkt.
  2. Hele lichaam perfusie met zoutoplossing en fixatief is nodig om het bloed uit het cardiovasculaire systeem en voor de ti vast PUNTEN. Perfusie met Oost-Indische inkt is nodig om volledig te vullen het vaatstelsel van het cardiovasculaire systeem.
  3. De resulterende hersenen wordt vervolgens gedehydrateerd door een reeks van gesorteerde ethyl alcohol (25% -100%) en vervolgens ingebed in Araldite plastic na het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Als LR wit is de inbedding medium dan het protocol in 1.10 hierboven is gevolgd.

4. Prepareren: Generic soorten, generieke organen

  1. Voor de generieke geval is, kan fixatie worden gedaan met ofwel 10% neutraal gebufferde formaline of 4% paraformaldehyde.
  2. Voor kleine hoeveelheden weefsel, is diffusie plaats van de perfusie aanbevolen voor fixatie en kleuring. In het geval van kleine organismen of organen, kunnen vlekken ook worden gedaan tijdens het droogproces.
  3. De inbedding protocol is hetzelfde als hierboven, maar de tijden voor oplossing infiltratie kan worden verminderd voor organen of organismen die veel kleiner zijn dan hele hersenen van muizen.
jove_title "> 5. KESM setup en imaging

  1. Zet de pomp, zet op het podium, zet de camera, zet verlichting.
  2. Verhogen mes en objectief.
  3. Installeer exemplaar ring.
  4. Meten monster dimensie en maakt een configuratiebestand voor de KESM Stage Controller2 toepassing.
  5. Start KESM Stage Controller2 en initialiseren podium.
  6. Onderste mes / doelstelling, zet pomp.
  7. Focus objectief en de camera, door te draaien aan de focus knop op de optische trein en het aanpassen van de camera's gezichtsveld van ten opzichte van het mes rand.
  8. Druk op [Start] om beeldvorming te starten.
  9. Zie Fig. 3-8. Zie 9, 7 voor technische details.

6. Beeldverwerking en data voorbereiding

  1. Kopieer de KESM Stack Processor executable in de map Data onder het configuratiebestand map (00000, 00001, etc.).
  2. Voer de KESM Stack Processor tot verlichting artefact te verwijderen en de achtergrond intensiteit normaliseren in allebeelden. Herhaal dit voor alle gegevens submappen.
  3. Bereid meerschalige tegels uit de dataset en uploaden en het opzetten van de bestanden in de KESM Brain Atlas webserver.
  4. Zie Fig. 9.

7. Data visualisatie en analyse

  1. Visualisatie met behulp van de KESM Brain Atlas. Ga naar http://kesm.cs.tamu.edu en selecteer de gewenste atlas.
    1. Navigeren zoals bij Google maps.
    2. In-en uitzoomen als in Google maps.
    3. Als u naar een andere diepte, kiest u hoe diep je moet gaan op elke stap van het pull-down menu en klik vervolgens op beide [+] of [-] te verhogen of te verlagen z diepte.
    4. Stel de overlay nummer met behulp van het pull-down menu.
    5. Stel de overlay interval met behulp van het pull-down menu.
    6. Zie Fig. 11.
  2. Visualisatie met behulp van MeVisLab.
    1. De lancering MeVisLab.
    2. Maak een nieuw project.
    3. In de volgende, kunnen nieuwe modules worden creëren door Typing in de module naam in de opdracht vak.
    4. Maak een module [Compose3Dfrom2DFiles], en ga naar de gewenste map. Geef bestand string in en klik op in [GetFileList]. Zorg ervoor dat de geselecteerde beelden kunnen passen in het geheugen. Klik op [Create3D] om volume te creëren.
    5. Maak een module [SetWorldMatrix], en zet de "Scale" onder "Elementary transformaties" x, y, z om de juiste voxel grootte (0,6, 0,7, 1,0 voor een 10x 0.45NA doelstelling). Link [Compose3Dfrom2DFiles] op [SetWorldMatrix].
    6. Stel Matrix en transformeert onder "Matrix Composition" naar "Negeren", "Negeer", "Forward".
    7. Maak een module [Arithmetic1] en stel de "Function" naar "Invert (Max-IMG)".
      Link [SetWorldMatrix] op [Arithmetic1].
    8. Maak een module [View3D] en sluit [Arithmetic1].
    9. In View3D, terwijl de rechter muisknop wordt ingedrukt, bewegen met de muis om de drempel aan te passen. U kunt bijsnijden regio's, wijzigen van de oriëntatie (beweeg muis terwijl de linker muisknop wordt ingedrukt), wijzigt u verlichting (volume rendering of MIP), aan / uit achtergrond, enz.
    10. Zie Fig. 10.

8. Representatieve resultaten:

Hier presenteren we whole-brain gegevens en details. Vijgen. 12-15 tonen de hersenen als geheel India Ink, Golgi, en Nissl datasets 1, 4, 3.

Figuur 1
Figuur 1. Vast, gekleurd, en embedded hersenen van muizen

Figuur 2
Figuur 2. Embedded hersenen van muizen exemplaar gemonteerd op het monster ring.

Figuur 3
Figuur 3. The Knife Edge Scanning Microscoop (KESM). Een foto van de KESM wordt getoond met de belangrijkste componenten gemerkt: (1) hogesnelheidslijn-scan camera, (2) microscoop doelstelling, (3) diamant mes montage en licht collimator, (4) SPEcimen tank (voor onderdompeling in water beeldvorming), (5) drie-assige nauwkeurige air-dragende fase (6) wit-licht microscoop verlichting, (7) water pomp (in de rug) voor de verwijdering van de doorsnede weefsel, (8) PC-server voor podium-controle en beeld acquisitie, (9) granieten basis, en (10) graniet brug.

Figuur 4
Figuur 4. Imaging principes van de KESM. Het principe van de werking van KESM wordt geïllustreerd. Het doel en het mes is op zijn plaats gehouden, terwijl het monster aangebracht op de positionering podium beweegt (pijl met vaste lijn) op de resolutie van 20 nm en rijsnelheid van 1-5, en krijgt schraapte tegen de diamant mes (5 mm breed voor het 10X objectief), het genereren van een dunne gedeelte stroomt over het mes (pijl met vaste lijn). Line-scan beeldvorming wordt gedaan bij het uiterste puntje van het mes.

Figuur 5
Figuur 5. KESM camera en objectief scherpstellen controles.

Figuur 6
Figuur 6. KESM mes montage en controles.

Figuur 7
Figuur 7. Initial richten via de observatie-poort.

Figuur 8
Figuur 8. KESM Stage Controller 2 applicatie (screenshot).

Figuur 9
Figuur 9. KESM stack processor applicatie (screenshot).

Figuur 10
Figuur 10. MeVisLab applicatie (screenshot).

Figuur 11
Figuur 11 KESM Brain Atlas:. Web-interface (screenshot).

Figuur 12
Figuur 12. KESM de hersenen als geheel Oost-Indische inkt gegevens. Volume visualisaties van KESM gegevens stapels worden weergegeven voor de vasculaire data in te stellen. (A) Close-up van de vasculaire data. Breedte ~ 100 um. (Bd) Drie standaard uitzicht van de hele hersenen van muizen vasculatuur (subsampled van hoge-resolutie gegevens). Breedte ~ 10mm.

Figuur 13
Figuur 13. KESM whole-brain muis Golgi gegevens.

Figuur 14
Figuur 14. KESM Golgi data details.

Figuur 15
Figuur 15. KESM whole-brain Nissl data. (A) Close-up van de Nissl gegevens. ~ 300 um 3. (Bd) Drie standaard uitzicht van de hele hersenen van muizen Nissl gegevens (subsampled van hoge-resolutie gegevens). Doorsnede getoond voor een duidelijk beeld van de interne structuren.

Discussion

De KESM zorgt voor een submicrometer-level overzicht van grote hoeveelheden biologisch monster (~ 1 cm 3). Dit soort volume is voldoende om hele kleine dierlijke organen, zoals hersenen, longen, hart, nieren houden, etc. gescande beelden van dergelijke organen kunnen ongekende kwantitatieve informatie over de structurele organisatie van deze organen te bieden, en maken computationele modellering van verschillende functionele aspecten van deze organen, inclusief circuit en netwerk dynamiek, elektrische eigenschappen, vocht en luchtstroom dynamiek, en gespierd dynamiek.

Het prepareren protocol en post-analyse protocol beschreven in dit artikel wordt verwacht dat zij buiten research groepen te helpen om gemakkelijker toegang tot de KESM en de daaruit voortvloeiende gegevens. De KESM operatie protocol zal helpen deze externe onderzoekers om de voordelen en beperkingen van deze unieke beeldvormingmodaliteit waarderen.

Disclosures

Todd Huffman is met 3Scan, een commercieel bedrijf dat produceert en verkoopt de KESM Technology (US patent # 6744572).

Acknowledgments

Dit project werd gefinancierd door NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), de Texas Advanced Technology Program (ATP-# 000512 tot 0.146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A & M Research Foundation, Department of Computer Science and Engineering aan de Texas A & M University, en 3Scan. We willen graag Bernard Mesa (Micro Star Technologies) bedanken voor technisch advies en ondersteuning voor KESM instrumentatie. Grote delen van het ontwerp en de uitvoering van de KESM werd gedaan door Bruce H. McCormick, die stierf in 2007.

References

  1. Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).
  2. Abbott, L. C., Sotelo, C. Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices. Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).
  3. Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).
  4. Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures. Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).
  5. Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications. Ravi Rao, A., Cecchi, G. Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).
  6. Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope. BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).
  7. Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).
  8. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM. Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).
  9. McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).
  10. Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. The human connectome: A structural description of the human brain. PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy
Posted by JoVE Editors on 04/07/2013. Citeable Link.

A correction was made to Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. The Nissl staining protocol was modified from:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  2. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  3. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  4. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  5. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  6. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.
  7. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of room temperature 10% neutral buffered formalin (pH 7.4). and finally with 3.0 cc of undiluted India ink.
  8. Whole body perfusion with saline and fixative is necessary to clear the blood from the cardiovascular system and to fix the tissues. Perfusion with India ink is necessary to completely fill the vasculature of the cardiovascular system.
  9. The resulting brain is then dehydrated through a series of graded ethyl alcohols (25%{}-100%) and then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

to:

2. Specimen preparation: Nissl

  1. This protocol closely follows the protocol of Mayerich et al.7
  2. The mouse is deeply anaesthetized using ketamine and xylazine injected intraperitoneally and then perfused transcardially using 50 mL of room temperature phosphate-buffered saline (pH 7.4), followed by 250 mL of cold 4% phosphate-buffered paraformaldehyde (pH 7.4).
  3. The mouse is then perfused with 100 mL of a solution of 0.1% thionin dye in deionized water, and the body placed in the refrigerator (4 °C) for 24 hours.
  4. After 24 hours, the brain is removed from the calvaria and placed in a fresh solution of 0.1% thionin and left at 4 °C for 7 days. The lengthy duration of this procedure was to ensure full infiltration of thionin into the en bloc preparation.
  5. The brain is then destained and dehydrated through a graded series of ethanols starting with 50% ethanol and water and increasing to 100% ethanol over a time period of 6 weeks. The ethanol changes from 50% to 70% are stored in the refrigerator (4 °C) and all changes of ethanol above 70% are stored at room temperature.
  6. After three changes of acetone (2-4 days in each solution at room temperature), the brain is then embedded in araldite plastic following the protocol in 1.8-1.9 above. If LR white is the embedding medium then the protocol in 1.10 above is followed.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics