الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تأخر فرط نوع (DTH) هو رد فعل التهابية بوساطة الخلايا الليمفاوية الذاكرة CCR7 - المستجيب (تيم) تي. نحن هنا لشرح كيفية تنشيط خلايا محددة مستضد TEM ، لحث DTH بالتبني في الفئران لويس ومراقبة الاستجابة للالتهابات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats. J. Vis. Exp. (8), e325, doi:10.3791/325 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تأخر فرط نوع (DTH) هو رد فعل التهابية بوساطة CCR7 - المستجيب الخلايا اللمفية تي الذاكرة التي اختراق موقع من حقن ضد مستضد التي كانت تستعد للنظام المناعي. ويتسم رد فعل التهابية بواسطة احمرار وتورم في موقع التحدي مستضدي. ذلك هو نموذج مناسب لتحديد فعالية في الجسم الحي للمناعة. يمكن أن يتسبب DTH الجلدي إما عن طريق نقل بالتبني من الخلايا الليمفاوية T مستضد محددة أو عن طريق التحصين النشط مع مستضد ، وتحديا لاحقة مع الأدمة للمستضد للحث على رد فعل التهابية في منطقة الجلد معين. يمكن أن يتسبب ردود DTH لمستضدات مختلفة ، على سبيل المثال ovalbumin ، التوبركولين ، التيتانوس ، أو ثقب المفتاح هيموسيانين اللزيق. ويمكن أيضا أن يتسبب مثل هذه التفاعلات ضد مستضد ذاتي ، على سبيل المثال لبروتين النخاعين الأساسي (MBP) في الفئران التي يسببها التهاب الدماغ و النخاع مع التجريبية الذاتية مع MBP ، نموذج حيواني لمرض التصلب المتعدد (1). نحن هنا لشرح كيفية تحفيز رد فعل بالتبني DTH في الفئران لويس. فإننا سوف تحفز الخلايا التائية first ovalbumin محددة في المختبر ، وحقن هذه الخلايا intraperitoneally تفعيلها للفئران ساذجة. بعد السماح للخلايا للتوازن في الجسم الحي لمدة 2 يوم ، فإننا سوف تحد من الفئران مع ovalbumin في الصيوان للأذن واحدة ، في حين أن الأذن الأخرى فيل تلقي المالحة. سيكون رد فعل التهابية تكون مرئية 3-72 ساعات في وقت لاحق ، وسيتم قياس سماكة الأذن كمؤشر لشدة DTH.

Protocol

1. تحفيز الخلايا اللمفية تي ovalbumin محددة

يتم تحفيز يستريح ovalbumin محددة مع الخلايا التائية ovalbumin في حضور المشع thymocytes الفئران لويس (30 غراي) وخلايا مولدة تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) ، في تحفيز متوسطة (في تحضير الفيتامينات DMEM + + NEAA RPMI + قلم / بكتيريا / L - تخمة وأشار + + 2ME الجرذ المصل + Ovalbumin ، في تركيزات النهائي في قائمة المواد.)

إعداد مصل الجرذان

  1. نأخذ مصل من الفئران نضحي الجهات المانحة الغدة الصعترية.
  2. يتم تخدير الفئران عن طريق الاستنشاق بعمق هالوثان والكثير من الدماء كما هو ممكن رسمها التروية القلبية (50-10 مل في الفئران) باستخدام محاقن 10 مل و 23 G 1 "الإبر ، ويتم بعد ذلك مقطوعة الرأس على الفور لضمان الفئران الموت.
  3. ولا يسمح على تجلط الدم لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية تليها 10 دقيقة على الجليد.
  4. تتم إزالة الجلطة ونسج السائل المتبقي.
  5. يتم جمع المصل ، العقيمة التي تمت تصفيتها وتخزينها في -20 درجة مئوية.

التحضير لتقديم خلايا مولدة

  1. تأخذ الغدة الصعترية من الفئران باستخدام أدوات معقمة مقطوعة الرأس ووضعه في برنامج تلفزيوني يتضمن البنسلين والستربتوميسين (PBS - PS) ، على الجليد.
  2. أخذ أنسجة الغدة الصعترية إلى غطاء محرك السيارة والثقافة ، وتنظيفه من جلطات الدم وغيرها من الأنسجة الملوثة وقطع عليه في قطع صغيرة في مصفاة الخلية (فيشر # 08-771-2) توضع في طبق بتري 10 سم تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني. PS.
  3. الضغط على كل قطعة من خلال مصفاة الخلية باستخدام الجزء الخلفي من المحاقن المعقمة الغواص 1 مل. جمع تعليق خلية واحدة في أنبوب 50 مل على الجليد.
  4. شطف مصفاة مع خلية مل أكثر من 20-40 PBS - PS. تعليق العمل في أجهزة الطرد المركزي و1250g resuspend لبيليه في برنامج تلفزيوني - PS ، 5 ​​مل / الغدة الصعترية ، على الجليد.
  5. أشرق هذا التعليق (30 غراي) في irradiator غاما ويغسل فورا مرتين مع 50 مل PBS - PS.

    ملاحظة : إن أفضل المانحين الغدة الصعترية هي الفئران الشباب البالغين ، 5-7 أسابيع من العمر. ويمكن استخدام الفئران تصل إلى 10 أسابيع ولكن عدد الخلايا النقصان مع مرور الوقت. الجنس ليس مهما على الرغم من أن بعض الناس يقولون ان الذكور هم افضل المانحين التوتة. نحن دائما استخدام الإناث لأن لدينا يضم جميع الحيوانات في نفس الغرفة ، ونحن لا نريد من الذكور والإناث في نفس الغرفة.

تنبيه

  1. غسل الخلايا اللمفية تي مرة واحدة والاعتماد عليها.
  2. عدد الخلايا مستضد تقديم.
  3. مزيج 3 × 10 6 ovalbumin محددة خلايا T مع 150 × 6 10 ناقلة جنود مصفحة في طبق بتري 10 سم تحتوي على 10 مل من المتوسط ​​التحفيز.
  4. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.

2. بالتبني نقل الخلايا اللمفية تي ovalbumin محددة

  1. الفئران التي نستخدمها كمتلقين من الإناث 7-10 أسابيع من العمر.
  2. عد الخلايا اللمفية تي ، ينبغي أن تكون كبيرة ومستديرة. والخلايا مستضد تقديم يكون ميتا.
  3. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا اللمفية تي وresuspend لهم في 10 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
  4. 1 حقن intraperitoneally مل باستخدام محاقن 3 مل و 23 G 1 الإبر ".

3. التحدي مع المستضد في الأذن

  1. بعد يومين من نقل بالتبني ، وضخ 20 ميكرولتر من حل ovalbumin 1 ملغ / مل (= المستضدات ذات الصلة) في أذن واحدة والمياه المالحة (أو مستضد غير ذي صلة) في الأذن الأخرى. لا تصفية الحل مستضد كما كنت قد يفقد المجاميع التي تعزز رد فعل للالتهابات.

    ملاحظة : يجب تخدير الفئران لتجنب الحركات. إذا كنت اليد اليمنى ، وعقد في الأذن اليسرى بين الإبهام والسبابة ، والسبابة يجري داخل الأذن والفئران باتجاهك.

  2. حقن محلول في الصيوان للأذن باستخدام 27G ½ "الإبر ، حاول أن حقن الفئران كافة بالضبط في نفس المكان.

4. قياس DTH

  1. وسوف تبدأ الأذن تحول الحمراء وتنتفخ كعلامة على الالتهاب. قياس سماكة كل أذن مع ميكرومتر بنابض (على سبيل المثال نموذج PK - 0505 من شركة ميتيو تويو).
  2. أخذ القياسات 5-6 لكل الأذن عند كل نقطة من الوقت وحساب متوسط.
  3. ينبغي أن يحدث تورم القصوى بين 24 و 72 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن أيضا التحدي مستضدي أن يؤديها في مواقع أخرى ، على سبيل المثال في جلد الظهر (2). ومع ذلك نجد أن التحدي. استخدام الصيوان للأذن ، كما هو مبين في هذا الفيديو ، ويسمح لقياس أكثر دقة للتفاعل DTH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الدكتور الكسندر Flugel (Martinsried والمانيا) لتزويدنا GFP المسمى ، ovalbumin محددة خط الخلايا التائية المستخدمة في هذا البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12430-062 500ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine Cambrex/BioWhittaker 17-718R 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids Sigma-Aldrich R7131 NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins Sigma-Aldrich R7256 1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum 1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5503 10 μg/ml final, in Stimulation Medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166-936 (2001).
  2. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).

Comments

2 Comments

  1. Hi, Thank you very much for your protocols. Do you have any protocol describing the preperation of Ag specific T cell line (or Ag specific primary culture) from a rat?   Thank you very much in advance, Keren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 11, 2009 - 5:29 PM
  2. Hi Keren, Protocols for generating antigen-specific T cell lines from rats have been published. Basically, you need to immunize the rats with the antigen of interest in emulsion with an adjuvant (Alum, IFA, or CFA) and then collect the draining lymph nodes, isolate the mononuclear cells and stimulate them in vitro with the same antigen. Most cells will die but the antigen-specific cells will grow. Note that you will need to go through several rounds of stimulation in vitro to increase the % of antigen-specific T cells in your culture as some non-specific bystander cells will survive for some time. Here are a few references you may want to look at:     Flügel, A., M. Willem, T. Berkowicz, and H. Wekerle. 1999. Gene transfer into CD4 + T lymphocytes: Green fluorescent protein engineered, encephalitogenic T cells used to illuminate immune responses in the brain. Nature Med. 5:843–847. Ben-Nun, A., Wekerle, H., and I.R. Cohen. 1981. The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 11:195-199. For immunization of rats you can look at two of my JoVE videos: Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH) in rats, J. Vis. Exp. 6, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²37&VID=²33. PMCID: PMC²557114. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Vis. Exp. 5, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²²4&VID=²14. PMCID: PMC²557091.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    March 17, 2009 - 7:18 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics