고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링

Biology

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Summary

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T (TEM) lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기서 우리는, 항원 특정 TEM 세포를 활성화 루이스 쥐에서 입양 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

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Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats. J. Vis. Exp. (8), e325, doi:10.3791/325 (2007).

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Abstract

지연 유형 과민성 (DTH)은 면역 시스템이 준비하는되어있는 대한 항원의 주사의 사이트를 침투 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 염증 반응은 antigenic 도전의 사이트의 빨갛게과 팽창이 특징입니다. 그것은 면역 억제제의 생체내 효능에 결정하는 편리한 모델입니다. 피부 DTH는 항원에 특정한 T의 lymphocytes의 입양 전송 또는 항원, 그리고 주어진 피부 영역에서 염증 반응을 유발하는 항원과 이후의 intradermal 도전과 적극적인 예방 접종을 통해 유도된 수 있습니다. DTH 반응이 예제 ovalbumin, 투베르쿨린,​​ 파상풍 toxoid, 또​​는 열쇠의 림펫 hemocyanin에 대한 다양한 항원을 유도하실 수 있습니다. 이러한 반응도 MBP 여러 경화증 (1) 동물 모델 실험 면역 encephalomyelitis 유도와 쥐의 기본 단백질 (MBP)을 myelin 예를 들어, autoantigen에 대한 유발 수 있습니다. 여기 루이스 쥐에서 입양 DTH 반응을 유도하는 방법을 보여줍니다. 우리가 먼저 체외에서 ovalbumin 특정 T 세포를 자극하고 순진한 쥐 이러한 활성 셀 intraperitoneally를 삽입합니다. 다른 귀 윌은 생리 수신하는 동안 세포가 2 일간 생체내에서 평형 수있게되면, 우리는 귀 한쪽의 날개에 ovalbumin와 쥐에 도전합니다. 염증 반응이 3~72시간 나중에 표시되며, 귀 두께는 DTH 심각의 표시로 측정됩니다.

Protocol

1. ovalbumin 특정 T의 lymphocytes의 자극

휴식 ovalbumin 특정 T 세포는 자극을 매체 항원 제시 세포 (APCs)로 조사 루이스 랫 thymocytes (30 쥐), (DMEM + 펜 / Strep / L - GLUT + NEAA + RPMI의 비타민 준비의 존재에 ovalbumin로 자극된 상태네 + 2ME + 랫 세럼 + Ovalbumin, 최종 농도에서는 자료 목록에 언급했다.)

쥐 혈청 준비

  1. 우리는 thymus 기증자로 희생 쥐의 혈청을.
  2. 쥐들이 할로탄 흡입에 의해 깊이 anesthetized하고 가능한 한 많은 혈액으로 10 ML 주사기와 쥐 즉시 죽음을 보장하기 위해 목이있는 후 23 G 1 "바늘을 사용하여 심장 재관류 (쥐 당 50-10 ML)에 의해 그려진 것입니다.
  3. 혈액은 37 10 분 응고 수 있습니다 ° C 얼음이 10 분 뒤에.
  4. 응고를 제거하고 남은 액체 돌다가 있습니다.
  5. 혈청은 -20 ° C.에서 수집된 살균 - 여과 및 저장

항원 제시 세포의 준비

  1. 멸균 악기를 사용하여 참수 암흑의 thymus를 타고 얼음 PBS가 들어 페니실린과 스트렙토 마이신 (PBS - PS)에 놓으십시오.
  2. 조직 문화 후드에 thymus을 가지고, 혈전 및 기타 오염 조직에서 청소하고 10 ML 포함된 10cm 배양 접시에 놓인 셀 스트레이너 (피셔 # 08-771-2) PBS를로 작은 조각으로 잘라 PS.
  3. 각 조각은 살균 한 ML 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 셀 스트레이너를 통해 누르면됩니다. 얼음에 50 ML 튜브에 단일 세포 현탁액를 수집합니다.
  4. PBS - PS의 20-40보다 ML과 셀 스트레이너 린스. 1,250g에서 현탁액을 원심 얼음에 PBS - PS의 펠렛, 5 ML / thymus을 resuspend.
  5. 감마 irradiator이 중지 (30 쥐)을 비추다 즉시 50 ML PBS - PS와 함께 두 번 씻는다.

    참고 : 가장 좋은 thymus 기증자 나이 젊은 성인 쥐, 5-7주 있습니다. 최대 10 주 쥐를 사용하지만 세포의 숫자는 시간이 감소됩니다. 어떤 사람들은 남성보다 thymus 기증자는 것을 말하고 있지만 성별은 중요하지 않습니다. 모든 동물이 같은 방에 보관되어 있기 때문에 우리는 항상 여자를 사용하고 우리가 같은 방에있는 남성과 여성을 싶지 않아요.

자극

  1. 일단 T lymphocytes 씻으십시오 그들을 계산합니다.
  2. 항원 제시 세포를 계산합니다.
  3. 믹스 3 X 10 6 ovalbumin 특정 자극을 매체 10 ML을 포함 10cm 배양 접시에있는 150 X 10 6 APCs와 T 세포.
  4. 37 48 시간 동안 품어 ° C.

2. ovalbumin 특정 T의 lymphocytes의 입양 전송

  1. 우리가 수신자로 사용 쥐들이 70-10주 오래된 암컷입니다.
  2. T lymphocytes 세어, 그들은 크고 둥근해야합니다. 항원 제시 세포는 죽게 될 것입니다.
  3. T lymphocytes을 원심 분리기 10 X 10 6 세포 / PBS에 ML에서 그들을 resuspend.
  4. 3 ML 주사기 23 G 1 "바늘을 사용하여 한 ML의 intraperitoneally을 주사.

3. 귀에 항원과 도전

  1. 이틀 입양 전송 후, 다른 귀 한 귀로와 생리 (또는없는 항원)에 1 MG / ML ovalbumin 솔루션 (= 관련 항원) 20 μl를 주입. 당신이 염증 반응을 강화 합산을 잃을 수 있으므로 항원 솔루션을 필터링하지 마십시오.

    참고 : 쥐나는 움직임을 피하기 위해 anesthetized해야합니다. 당신이 오른손잡이 경우, 왼쪽 엄지와 검지, 귀 안쪽되는 검지 손가락과 직면하고있는 쥐를 사이의 귀를 잡아.

  2. 27G ½ "바늘을 사용하여 귀의 날개에있는 솔루션을 주사. 같은 장소에서 정확하게 모든 쥐를 삽입하는보십시오.

4. DTH 측정

  1. 귀는 빨간색과 염증의 징조로서 훌륭한 회전을 시작합니다. 용수철 마이크로 미터 (예 : 모델 Mitutoyo에서 PK - 0505)을 각 (内耳)의 두께를 측정합니다.
  2. 각 시간 시점에서 각각의 귀에 대해 5-6 측정하고 평균을 계산합니다.
  3. 최대 붓기 24 72 시간 사이에 발생한다.

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Discussion

antigenic의 도전도 다시 (2) 피부에 예를 들어, 다른 사이트에서 수행할 수 있습니다. 우리는 그러나 그 도전 찾으십시오. 본 동영상에 표시된 귀의 날개를 사용하면 DTH 반응의 가장 정확한 측정을 위해 수 있습니다.

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Acknowledgments

우리는이 프로토콜에서 사용되는 GFP - 라벨, ovalbumin 특정 T 세포 라인으로 우리를 제공할 박사 알렉산더 Flugel을 (Martinsried, 독일) 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12430-062 500ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine Cambrex/BioWhittaker 17-718R 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids Sigma-Aldrich R7131 NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins Sigma-Aldrich R7256 1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum 1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5503 10 μg/ml final, in Stimulation Medium.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166-936 (2001).
  2. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).

Comments

2 Comments

  1. Hi, Thank you very much for your protocols. Do you have any protocol describing the preperation of Ag specific T cell line (or Ag specific primary culture) from a rat?   Thank you very much in advance, Keren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 11, 2009 - 5:29 PM
  2. Hi Keren, Protocols for generating antigen-specific T cell lines from rats have been published. Basically, you need to immunize the rats with the antigen of interest in emulsion with an adjuvant (Alum, IFA, or CFA) and then collect the draining lymph nodes, isolate the mononuclear cells and stimulate them in vitro with the same antigen. Most cells will die but the antigen-specific cells will grow. Note that you will need to go through several rounds of stimulation in vitro to increase the % of antigen-specific T cells in your culture as some non-specific bystander cells will survive for some time. Here are a few references you may want to look at:     Flügel, A., M. Willem, T. Berkowicz, and H. Wekerle. 1999. Gene transfer into CD4 + T lymphocytes: Green fluorescent protein engineered, encephalitogenic T cells used to illuminate immune responses in the brain. Nature Med. 5:843–847. Ben-Nun, A., Wekerle, H., and I.R. Cohen. 1981. The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 11:195-199. For immunization of rats you can look at two of my JoVE videos: Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH) in rats, J. Vis. Exp. 6, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²37&VID=²33. PMCID: PMC²557114. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Vis. Exp. 5, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²²4&VID=²14. PMCID: PMC²557091.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    March 17, 2009 - 7:18 PM

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