ラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング

Biology

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Summary

遅延型過敏症(DTH)はCCR7 -エフェクターメモリーT(TEM)リンパ球によって媒介炎症反応です。ここでは、抗原特異的なTEM細胞を活性化Lewisラットで養子DTHを誘導し、炎症反応を監視する方法を示します。

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Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats. J. Vis. Exp. (8), e325, doi:10.3791/325 (2007).

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Abstract

遅延型過敏症(DTH)は、免疫系がプライミングされているに対して、抗原の注射の部位に侵入CCR7 -エフェクターメモリーTリンパ球によって媒介炎症反応です。炎症反応は、抗原投与の部位の発赤や腫れが特徴です。それは、免疫抑制剤のin vivo有効性の判断に便利なモデルです。皮膚DTHは、抗原特異的Tリンパ球の養子移入によってまたは抗原、および特定の皮膚領域での炎症反応を誘導する抗原とその後の皮課題と能動免疫のいずれかによって誘導することができる。 DTH反応は、例えばオボアルブミン、ツベルクリン、破傷風トキソイド、またはキーホールリンペットヘモシアニンのために、種々の抗原に誘導することができる。そのような反応もMBP、多発性硬化症(1)のための動物モデルによる実験的自己免疫性脳脊髄炎誘発のラットに塩基性タンパク質(MBP)をミエリンに、例えば、自己抗原に対して誘導することができる。ここでは、ルイスラットにおける養子DTH反応を誘導する方法を示します。我々はまずin vitroでの卵白アルブミン特異的T細胞を刺激し、ナイーブなラットにこれらの活性化細胞の腹腔内に注入します。他の耳のウィルは、生理食塩水を受信しながら細胞は2日間、生体内で平衡させた後、我々は、片方の耳の耳介のオボアルブミンをラットに挑戦する。炎症反応は、3から72時間後に表示されますし、耳の厚さは、DTH重症度の指標として測定されます。

Protocol

1。卵白アルブミン特異的Tリンパ球の刺激

安静時の卵白アルブミン特異的T細胞が抗原提示細胞(APC)のような照射ルイスラットの胸腺細胞(30 Gy)をの存在下でオボアルブミンで刺激され、刺激のミディアムで(DMEM +ペン/連鎖球菌/ L -グラット+ NEAA + RPMIのビタミンで準備+ 2ME +ラット血清+オボアルブミン、最終濃度は、材料のリストに記載。)

ラット血清の準備

  1. 我々は胸腺ドナーとして犠牲にラットから血清を取る。
  2. ラットではハロタンの吸入により深く麻酔し、できるだけ多くの血液を10 mLシリンジとラットはすぐに死を確保するために断頭されてから23 G 1"針を、使用して心臓の灌流(ラットあたり5〜10 ml)で描画されます。
  3. 血液は37℃で10分間凝固されている° Cは、氷上で10分間続きます。
  4. 血栓を除去し、残留液がスピンしている。
  5. 血清は-20℃で滅菌濾過し、保存され、収集され

抗原提示細胞の調製

  1. 滅菌器を使用して首を切らラットの胸腺を取り出し、氷上でPBSを含むペニシリンとストレプトマイシン(PBS - PS)、に入れてください。
  2. 血栓や他の​​混入組織からそれをきれいにし、PBS - 10 mlを含む10cmペトリ皿に配置されたセルストレーナー(フィッシャー#08-771-2)に小さな断片で、それをカット、組織培養フードに胸腺を取るPS。
  3. 各ピースは滅菌1 mlのシリンジプランジャの背面を使用してセルストレイナーを通して押されている。氷上で50 mlチューブに、単一の細胞懸濁液を収集する。
  4. PBS - PSの20-40よりmlのセルストレーナーを洗浄します。 1250グラムで、懸濁液を遠心し、氷上でPBS - PSのペレットは、5ミリリットル/胸腺を、懸濁します。
  5. ガンマ照射装置で、この懸濁液(30 Gyを)照射し、直後に50ミリリットルのPBS - PSで2回洗浄する。

    注:最高の胸腺のドナーが古い、若い、成人、ラット、5-7週間です。 10週間までのラットを使用されるが、細胞の数は時間とともに減少することができます。一部の人は男性がより胸腺ドナーであるということを言っているものの、性別は重要ではありません。すべて私たちの動物が同じ部屋に収容されているので、我々は常に女性を使用し、我々は同じ部屋で男性と女性を望んでいない。

刺激

  1. 一度、Tリンパ球を洗浄し、それらを数える。
  2. 抗原提示細胞を数える。
  3. ミックス3 × 10 6卵白アルブミン特異的刺激の培地10mlを含む10cmペトリ皿で150 × 10 6のAPCとT細胞。
  4. 37℃で48時間インキュベート℃に

2。卵白アルブミン特異的Tリンパ球の養子移入

  1. 我々は受信者として使用するラットは7-10週齢の雌です。
  2. Tリンパ球をカウント、彼らは大規模で円形にする必要があります。抗原提示細胞が死んでいるだろう。
  3. Tリンパ球を遠心し、PBSで10 × 10 6細胞/ mlで再懸濁します。
  4. 3ミリリットル注射器と23 G 1"針を使用して1 mlの腹腔内に注入する。

3。耳の中の抗原と課題

  1. 二日養子移入した後、他の耳に1つの耳と生理食塩水(または無関係な抗原)で1 mg / mlの卵白アルブミン溶液(=関連抗原)の20μlを注入する。あなたが炎症反応を高める凝集体を失う可能性があるため、抗原溶液をフィルタリングしない。

    注:ラットが動きを避けるために麻酔する必要があります。あなたが右利きの場合、左手の親指と人差し指、耳の内側にいる人差し指とあなたが直面しているラットの間に耳をホールド。

  2. 27G ½"針を使用して耳の耳介のソリューションを注入する。厳密に同じ場所ですべてのラットを注入してみてください。

4。 DTHの測定

  1. 耳は赤と炎症の兆候としてうねり回転を開始します。バネ付きマイクロメートル(例モデルミツトヨからPK - 0505用)をそれぞれの耳の厚さを測定します。
  2. 各時間点で各耳5-6の測定を行い、平均を計算する。
  3. 最大の腫れは、24および72時間の間に発生しなければなりません。

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Discussion

抗原投与はまた、背中の皮膚(2)で、例えば、他のサイトで行うことができます。我々は、しかし、それは挑戦見つける。としてこのビデオに示すように耳の耳介を、使用して、DTH反応の最も正確な測定が可能になります。

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Acknowledgments

我々は、このプロトコルで使用されているGFP標識、卵白アルブミン特異的T細胞ラインをご提供するためDr。アレキサンダーフリューゲル(マルティンス、ドイツ)を感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO, by Life Technologies 12430-062 500ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 1 mM final, in Stimulation medium
Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine Cambrex/BioWhittaker 17-718R 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium
Non essential amino acids Sigma-Aldrich R7131 NEAA, 1% final, in Stimulation Medium
RPMI vitamins Sigma-Aldrich R7256 1% final, in Stimulation medium
beta-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M6250 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium
Syngeneic rat serum 1% final. See explanation in Protocol.
Ovalbumin Sigma-Aldrich A5503 10 μg/ml final, in Stimulation Medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166-936 (2001).
  2. Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).

Comments

2 Comments

  1. Hi, Thank you very much for your protocols. Do you have any protocol describing the preperation of Ag specific T cell line (or Ag specific primary culture) from a rat?   Thank you very much in advance, Keren

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 11, 2009 - 5:29 PM
  2. Hi Keren, Protocols for generating antigen-specific T cell lines from rats have been published. Basically, you need to immunize the rats with the antigen of interest in emulsion with an adjuvant (Alum, IFA, or CFA) and then collect the draining lymph nodes, isolate the mononuclear cells and stimulate them in vitro with the same antigen. Most cells will die but the antigen-specific cells will grow. Note that you will need to go through several rounds of stimulation in vitro to increase the % of antigen-specific T cells in your culture as some non-specific bystander cells will survive for some time. Here are a few references you may want to look at:     Flügel, A., M. Willem, T. Berkowicz, and H. Wekerle. 1999. Gene transfer into CD4 + T lymphocytes: Green fluorescent protein engineered, encephalitogenic T cells used to illuminate immune responses in the brain. Nature Med. 5:843–847. Ben-Nun, A., Wekerle, H., and I.R. Cohen. 1981. The rapid isolation of clonable antigen-specific T lymphocyte lines capable of mediating autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 11:195-199. For immunization of rats you can look at two of my JoVE videos: Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH) in rats, J. Vis. Exp. 6, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²37&VID=²33. PMCID: PMC²557114. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Vis. Exp. 5, http://www.jove.com/Details.htm?ID=²²4&VID=²14. PMCID: PMC²557091.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    March 17, 2009 - 7:18 PM

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