लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव कार्डिएक व्यापारियों और cardiomyocytes के कुशल व्युत्पत्ति

Biology
 

Summary

हम pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं छोटे अणु है, जो मानव हृदय के लिए हृदय की मरम्मत progenitors और कार्यात्मक cardiomyocytes की एक बड़ी आपूर्ति की व्युत्पत्ति के लिए सक्षम बनाता है के साथ परिभाषित शर्तों के तहत बनाए रखा से सीधे cardioblasts के शामिल होने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है.

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Parsons, X. H., Teng, Y. D., Parsons, J. F., Snyder, E. Y., Smotrich, D. B., Moore, D. A. Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction. J. Vis. Exp. (57), e3274, doi:10.3791/3274 (2011).

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Abstract

Protocol

1. समाधान और मीडिया तैयारी

  1. जिलेटिन कोटिंग समाधान: 0.1% (w / v) DDH 2 हे, autoclaved में जिलेटिन 4 बजे और स्टोर डिग्री सेल्सियस
  2. Matrigel कोटिंग समाधान. स्टॉक समाधान: 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात, 10 मिलीलीटर ठंडा DMEM या DMEM/F12 जोड़ने के लिए, अच्छा मिश्रण है और विभाज्य 1 सी. / मिलीलीटर निष्फल टिशू कल्चर हुड के नीचे, ट्यूब -20 में दुकान ° धीमी गति से पिघलना Matrigel (10 मिलीलीटर) कार्य समाधान: धीमी गति से पिघलना 4 में 1 मिलीलीटर Matrigel विभाज्य ° सी 1-2 के लिए घंटे, 14 DMEM या DMEM/F12 ठंडा मिलीलीटर को हस्तांतरण और निष्फल टिशू कल्चर हुड के नीचे अच्छी तरह से कोटिंग से पहले तुरंत मिश्रण.
  3. मानव laminin कोटिंग समाधान: पतला 1 मिलीलीटर मानव laminin समाधान (0.5 मिलीग्राम / Tris में मिलीलीटर NaCl buffered -80 में दुकान ° सी, 1-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीमी गति से पिघलना) के साथ ठंडा DMEM या करने के लिए DMEM/F12 12.5 मिलीलीटर काम कर रहे (40 μg / एमएल) समाधान कोटिंग पहले निष्फल टिशू कल्चर हुड के नीचे तुरंत.
  4. वृद्धि कारक शेयर (500 1000x) समाधान: 10 μg में वृद्धि कारक भंगनिष्फल बफर में मिलीग्राम / (0.5% BSA, 1.0 मिमी डीटीटी, 10% ग्लिसरॉल, 1XPBS) और 50-100 / μl ट्यूब aliquots के रूप में -80 में दुकान ° सी.
  5. HESC मीडिया: DMEM/F12 या KO DMEM (80%), को सीरम प्रतिस्थापन (20%), एल alanyl एल GLN या एल GLN (2 मिमी), सदस्य nonessential अमीनो एसिड (MNAA, 1X), और β-(100 सुक्ष्ममापी) Mercaptoethanol, फ़िल्टर और 4 बजे दुकान ° सी, 20 एनजी / एमएल bFGF के साथ उपयोग करने से पहले पूरक. या परिभाषित घटकों के साथ "को सीरम प्रतिस्थापन" की जगह: DMEM/F12 या KO DMEM (100%), एल alanyl एल GLN या एल GLN (2 मिमी), MNAA (1X), सदस्य आवश्यक अमीनो एसिड (MEAA ) 1X, और (100 सुक्ष्ममापी) β-Mercaptoethanol, फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस, bFGF (20 एनजी / एमएल) के साथ पूरक, मानव इंसुलिन (20 μg / एमएल), ascorbic एसिड (50 μg / एमएल), मानव activin (50 एनजी / एमएल), मानव / albumin Albumax (10 मिलीग्राम / एमएल), और मानव transferrin (8 μg / एमएल) उपयोग करने से पहले.
  6. HESC हृदय भेदभाव मीडिया: DMEM/F12 (90%), परिभाषित FBS (10%) और एल alanyl - एल GLN या एल GLN (2 मिमी).
  7. मीडिया युक्त (गुटनिरपेक्ष आंदोलन) nicotinamide: जोड़ने के एनHESC मीडिया या 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता, फ़िल्टर 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस और तैयारी के 2 हफ्तों के भीतर का उपयोग करें. HESC हृदय भेदभाव मीडिया के लिए AM

2. प्लेट कोटिंग

  1. कोट प्लेटों के साथ जिलेटिन: ऐड मिलीग्राम / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें जिलेटिन समाधान की और 2.5 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर 37 में रातोंरात सेते हैं.
  2. Laminin के साथ कोट प्लेटों: ठंड प्लेटें जिलेटिन में लिपटे और जिलेटिन हटायें, 2.5 मिलीलीटर जोड़ने / अच्छी तरह से Matrigel या मानव laminin कोटिंग का काम कर रहे पूर्व ठंडा समाधान 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 6 अच्छी तरह प्लेटें और सेते gelatinized.

3. Passaging और सीडिंग निर्धारित शर्तों के तहत undifferentiated hESCs

  1. अनुमति दें hESC कालोनियों 5-7 दिनों पुराना हो जाना, और विदारक माइक्रोस्कोप (पूर्व गर्म 37 मंच विदारक डिग्री सेल्सियस) निष्फल हुड विदारक नीचे hESC संस्कृति की थाली ले.
  2. HESC कालोनियों को विभाजित किया जा चयन करें. आकृति विज्ञान, इन कालोनियों 75>% undifferentiated hESCs (एस.एम.सभी कॉम्पैक्ट) कोशिकाओं, विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे परिभाषित बढ़त के साथ आमतौर पर थोड़ा अपारदर्शी (कोशिकाओं, सफेद नुकीला - अप नहीं स्पष्ट - विभेदित कोशिकाओं). ध्यान से चयनित कालोनियों की रूपरेखा और विभेदित fibroblast कॉलोनी आसपास परत हैं और सभी विभेदित भागों को हटा दें (यदि किसी भी P2 बाँझ विंदुक टिप के किनारे के साथ) या कॉलोनी के खींच लिया गिलास केशिका.
  3. Aspirating द्वारा पुराने अस्थायी अलग विभेदित कोशिकाओं से युक्त मीडिया निकालें. HESC bFGF () के बिना एक बार मीडिया के साथ धोएं. 3 मिलीलीटर जोड़ें / अच्छी तरह से ताजा hESC 20 एनजी / मिलीलीटर bFGF युक्त मीडिया.
  4. Undifferentiated hESC कालोनियों छोटे - छोटे टुकड़ों में काटें, और बाँझ विंदुक टिप या खींच केशिका गिलास के साथ अलग.
  5. पूल अलग कॉलोनी टुकड़ों को एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ युक्त मीडिया. 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 20 एनजी / एमएल bFGF और पूल hESC साथ युक्त मीडिया के साथ एक बार थाली धो.
  6. Matrigel या लेपित ताजा प्लेटों से मानव laminin समाधान महाप्राण (व्यंजन). अशेष भाजक 4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से जईएससी मीडिया 6 अच्छी तरह से एक थाली कॉलोनी टुकड़ों से युक्त. धीरे इनक्यूबेटर मिलाते हुए बिना प्लेट और हस्तांतरण कॉलोनी टुकड़े बीज 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में परेशान बिना रातोंरात की अनुमति .

4. Nicotinamide के साथ निर्धारित संस्कृति प्रणाली के तहत hESCs के कार्डिएक प्रेरण

  1. बोने के बाद 3 दिन में, प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से पुराने मीडिया के सबसे को हटा दें और पर्याप्त मीडिया छोड़ hESC कालोनियों जलमग्न हो (अनुमति hESCs बाहर शुष्क करने के लिए कभी नहीं) की अनुमति. 4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से ताजा hESC मीडिया युक्त 20 एनजी / मिलीलीटर bFGF और 10 मिमी nicotinamide (गुटनिरपेक्ष आंदोलन) के साथ बदलें.
  2. ताजा hESC 20 एनजी / एमएल bFGF और 10 मिमी गुटनिरपेक्ष आंदोलन हर दूसरे दिन युक्त मीडिया के साथ पुराने मीडिया को बदलें, और हृदय प्रेरित hESC कालोनियों दिन 8-10 बढ़ने की अनुमति. गुटनिरपेक्ष आंदोलन को उजागर करने पर कॉलोनी के भीतर सभी कोशिकाओं बड़े विभेदित कोशिकाओं है कि गुणा करने के लिए जारी रहेगा आकारिकी परिवर्तन से गुजरना होगा. कालोनियों के आकार में, और दिन 8-10 से वृद्धि, एक जाएगाघ कोशिकाओं कालोनियों के कुछ क्षेत्रों में ढेर शुरू हो जाएगा.

5. सस्पेंशन संस्कृति में सतत कार्डिएक भेदभाव

  1. HESC संस्कृति निष्फल हुड विदारक नीचे खुर्दबीन (पूर्व गर्म 37 मंच विदारक डिग्री सेल्सियस) विदारक की थाली ले लो. ध्यान कालोनियों रूपरेखा और P2 बाँझ विंदुक टिप की बढ़त के साथ fibroblast कॉलोनी आसपास परत (विभेदित कोशिकाओं कॉलोनी के बाहर माइग्रेट) को हटाने या गिलास केशिका खींच लिया.
  2. Aspirating द्वारा पुराने अस्थायी अलग fibroblast कोशिकाओं से युक्त मीडिया निकालें. HESC bFGF () के बिना एक बार मीडिया के साथ धोएं. 3 मिलीग्राम / अच्छी तरह से ताजा hESC मीडिया (bFGF बिना) जोड़ें.
  3. छोटे - छोटे टुकड़ों में हृदय प्रेरित hESC कालोनियों काटें, और बाँझ विंदुक टिप या खींच केशिका गिलास के साथ अलग.
  4. पूल अलग कॉलोनी टुकड़ों को एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ युक्त मीडिया. 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से hESC मीडिया (bFGF के बिना) और साथ पूल के साथ एक बार थाली धो.
  5. अशेष भाजक 4 मीटरएल / सीरम मुक्त hESC एक 6 अच्छी तरह ultralow लगाव और 37 में एक थाली सेते कॉलोनी टुकड़े युक्त मीडिया डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अस्थायी सेलुलर समूहों (cardioblasts) 4-5 दिनों के लिए फार्म करने के लिए अनुमति देने के लिए humidified.

6. चिपकने वाला संस्कृति में cardiomyocyte Phenotype परिपक्वता बैरंग

  1. पूल अस्थायी cardioblasts एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ युक्त मीडिया. 5 मिनट के लिए 1400 rpm पर अपकेंद्रित्र. पुराने आप कर सकते हैं के रूप में ज्यादा के रूप में मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और ताजा hESC हृदय भेदभाव मीडिया से युक्त 10 मिमी गुटनिरपेक्ष आंदोलन के बराबर राशि जोड़ें.
  2. विंदुक और नीचे 4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें अस्थायी cardioblasts और विभाज्य मिश्रण. 37 एक प्लेटें स्थानांतरण ° C humidified इनक्यूबेटर cardioblasts रातोंरात संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  3. HESC हृदय भेदभाव 10 मिमी गुटनिरपेक्ष आंदोलन हर दूसरे दिन युक्त मीडिया बदलें.
  4. 8 दिन, hESC गुटनिरपेक्ष आंदोलन के बिना हृदय भेदभाव मीडिया के साथ की जगह है, और hESC हृदय भेदभाव मीडिया ई की जगह जारीबहुत दूसरे दिन. बैरंग cardiomyocytes गुटनिरपेक्ष आंदोलन की वापसी के बाद लगातार खेती के बारे में 1-2 सप्ताह में दिखाई देते हैं और समय के साथ संख्या में वृद्धि शुरू होगा, और पर 3 महीने के लिए मजबूत और लयबद्ध संकुचन को बनाए रखने सकता है.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

Nicotinamide गुटनिरपेक्ष आंदोलन () परिभाषित संस्कृति प्रणाली में संक्रमण को बनाए रखा pluripotency से विशेष रूप से एक cardiomesodermal phenotype (छवि 2B) hESCs को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त प्रदान की गई है. गुटनिरपेक्ष आंदोलन के लिए undifferentiated hESCs के जोखिम पर, कॉलोनी के भीतर सभी कोशिकाओं बड़े विभेदित कोशिकाओं को आकारिकी परिवर्तन है कि Oct-4 की अभिव्यक्ति को विनियमित करने और हृदय विशिष्ट प्रतिलेखन कारक (CSX) Nkx2.5 और α-व्यक्त करने के लिए शुरू से गुजरना होगा actinin, एक cardiomesoderm phenotype (छवि 2B) के साथ संगत . ये विभेदित कोशिकाओं गुणा करने के लिए जारी रखने और कालोनियों के आकार में वृद्धि होगी. तीव्रता Nkx2.5 की वृद्धिआमतौर पर कालोनियों के क्षेत्रों में जहां कोशिकाओं को ढेर (छवि 2B) शुरू में मनाया. बाद अलग, गुटनिरपेक्ष आंदोलन के इलाज hESCs निलंबन संस्कृति में अस्थायी सेलुलर समूहों (cardioblasts) के रूप में हृदय भेदभाव प्रक्रिया को जारी रखने के लिए. Cardioblasts देते हैं और 1 सप्ताह के लिए गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ इलाज जारी रखने की अनुमति के बाद, पिटाई cardiomyocytes गुटनिरपेक्ष आंदोलन की वापसी के बाद लगातार खेती के बारे में 1-2 सप्ताह में दक्षता में भारी वृद्धि के साथ सहज बहु - वंश की भेदभाव की तुलना के रूप में दिखाई शुरू हो जाएगा एक ही समय अवधि (छवि 2C) पर उपचार के बिना hESCs . पिटाई cardiomyocyte समूहों के भीतर कक्ष cardiomyocytes की विशेषता Nkx2.5 और α-actinin (छवि 2C) सहित मार्करों व्यक्त करेंगे. पिटाई cardiomyocytes के संकुचन बिजली प्रोफाइल द्वारा पुष्टि की गई मजबूत, लयबद्ध, अच्छी तरह से समन्वित, और अच्छी तरह से entrained नियमित रूप से पी की याद ताजा आवेगों के साथ,क्यूआर - टी परिसरों नैदानिक ​​electrocardiograms में शरीर की सतह इलेक्ट्रोड से देखा (छवि 2C, वीडियो भी देखें). cardiomyocytes पर 3 महीने के लिए अपने मजबूत सिकुड़ना बनाए रखने सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. विशेष कार्यात्मक कोशिकाओं की दिशा में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए छोटे अणु - प्रेरण दृष्टिकोण बनाम परंपरागत दृष्टिकोण के समस्त योजनाओं. (ए) पारंपरिक सहज रोगाणु परत भेदभाव के माध्यम से मानव pluripotent स्टेम सेल के बहु - वंश झुकाव का उपयोग दृष्टिकोण का एक योजनाबद्ध. (बी) अच्छी तरह से नियंत्रित मानव pluripotent स्टेम सेल के कुशल विशेष रूप से छोटे अणुओं के सरल प्रावधान के द्वारा एक विशेष नैदानिक ​​प्रासंगिक वंश प्रेरण का एक योजनाबद्ध.

चित्रा 2
चित्रा 2Nicotinamide. परिभाषित और cardiomyocytes पिटाई की दिशा में प्रगति के तहत हृदय वंश pluripotency के प्रत्यक्ष विनिर्देश लाती है. (ए) योजनाबद्ध निर्देशित hESCs के हृदय भेदभाव के प्रोटोकॉल समय रेखा के चित्रण. (बी) undifferentiated hESCs परिभाषित संस्कृति प्रणाली के तहत nicotinamide (गुटनिरपेक्ष आंदोलन) के लिए जोखिम होने पर बड़ी विभेदित अक्टूबर 4 कॉलोनी के भीतर (लाल) नकारात्मक कोशिकाओं को उभरने लगे, के रूप में नकली इलाज नियंत्रण के रूप में (DMSO) hESCs की तुलना में. गुटनिरपेक्ष आंदोलन - प्रेरित अक्तूबर-4-नकारात्मक कोशिकाओं Nkx2.5 व्यक्त (हरा) और α-actinin (लाल), जल्दी हृदय भेदभाव के साथ अनुरूप करने के लिए शुरू किया. Nkx2.5 की उत्तरोत्तर वृद्धि हुई तीव्रता आम तौर पर कॉलोनी के क्षेत्रों में जहां कोशिकाओं को ढेर शुरू में मनाया गया. सभी कोशिकाओं को उनके नाभिक के DAPI धुंधला (नीला) द्वारा संकेत कर रहे हैं. (सी) गुटनिरपेक्ष आंदोलन प्रेरित हृदय प्रतिबद्ध hESCs दक्षता में भारी वृद्धि के साथ पिटाई cardiomyocytes झुकेंगे, के रूप में सेलुलर clus द्वारा मूल्यांकनमंत्रियों है कि लयबद्ध संकुचन (electrophysiological प्रोफ़ाइल और वीडियो देखें), और Nkx2.5 (हरा) और α-actinin (लाल) के लिए immunopositive प्रदर्शित. बड़े पिटाई cardiomyocyte प्रतिनिधि समूहों और हृदय की मांसपेशियों करार प्रतिनिधि के उच्च शक्ति के चित्र के चरण छवियाँ (भी इसी वीडियो देखें) दिखाए जाते हैं. तीर बड़े पिटाई cardiomyocyte electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया क्लस्टर संकेत मिलता है. पिटाई cardiomyocytes electrophysiological प्रोफ़ाइल नियमित रूप से, entrained, लयबद्ध नैदानिक ​​electrocardiograms में देखा पी क्यूआर टी परिसरों की याद ताजा आवेगों से पता चलता है. : स्केल सलाखों 0.1 मिमी.

वीडियो: गुटनिरपेक्ष आंदोलन प्रेरित hESCs से विभेदित cardiomyocytes करार. में 1 और वीडियो 2 दिखाने के प्रतिनिधि बड़ी cardiomyocyte समूहों के बारे में 1 और 3 महीने में अनुलग्नक के बाद 3 वीडियो और 4 दिखाने उच्च शक्ति पर हृदय की मांसपेशियों को करार प्रतिनिधि पिटाई. 5 वीडियो एक typica से पता चलता हैएल छोटे पिटाई cardiomyocyte क्लस्टर अनायास नियंत्रण के रूप में गुटनिरपेक्ष आंदोलन उपचार के बिना hESCs से विभेदित.

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Discussion

दोनों विकासात्मक अध्ययन और नैदानिक ​​अनुवाद के लिए प्रमुख चुनौतियों में से किया गया है कि कैसे एक वांछित phenotype pluripotent मानव स्टेम कोशिकाओं के व्यापक भेदभाव संभावित चैनल के लिए कुशलतापूर्वक और जाहिर है. हालांकि ऐसी कोशिकाओं इन विट्रो में अनायास सभी रोगाणु परतों की कोशिकाओं में एक बहु - वंश कुल मंच के माध्यम से जा रहा द्वारा अंतर कर सकते हैं, hESC व्युत्पन्न अनायास बहु - वंश (embryoid निकायों) समुच्चय, केवल कक्षों की एक बहुत छोटा अंश (<2%) 13-15 cardiomyocytes (छवि 1A) में अंतर. निम्नलिखित immunoselection, cardiomyocytes की समृद्ध आबादी जैविक पेसमेकर समारोह के रूप में 13 पशु मॉडल के दिल में इंजेक्शन के बाद एक क्षतिग्रस्त मायोकार्डियम के समारोह यंत्रवत् और इलेक्ट्रॉनिक बचाव करने में सक्षम थे. कृंतक infarcted मॉडल में, engrafted व्युत्पन्न है - hESC हृदय progenies के लिए जीवित है और 12 सप्ताह के लिए परिपक्व करने में सक्षम थे, और आंशिक रूप से remuscularघायल दिल ize और सिकुड़ा 14,15 समारोह में सुधार . हालांकि, pluripotent कोशिकाओं की बहु वंश भेदभाव और tumorigenicity निम्नलिखित प्रत्यारोपण के उच्च जोखिम के माध्यम से मानव हृदय प्रतिबद्ध कोशिकाओं पैदा करने में अक्षमता आगे नैदानिक ​​अनुवाद रुकावट है. रणनीतियों का विकास एक हृदय phenotype pluripotent hESCs की व्यापक भेदभाव की क्षमता विशेष रूप से और जाहिर चैनल हृदय क्षेत्र में hESC जीव विज्ञान की शक्ति का दोहन करने के लिए महत्वपूर्ण है. आदेश में एक विशेष वंश मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के समान रूपांतरण प्राप्त करने के लिए, हम एक परिभाषित संस्कृति undifferentiated hESCs के प्रसार insuring एक विशेष नैदानिक ​​प्रासंगिक वंश के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से नियंत्रित pluripotent hESCs के कुशल शामिल होने के लिए शर्तों की पहचान करने में सक्षम प्रणाली कार्यरत छोटे अणुओं के सरल प्रावधान (चित्र 1 बी) के द्वारा . हमने पाया कि nicotinamide प्रेरित पी से सीधे हृदय वंश प्रतिबद्धतापरिभाषित संस्कृति के तहत luripotent hESCs है कि आगे के लिए उच्च दक्षता (छवि 2) के साथ पिटाई cardiomyocytes प्रगति. Nkx2.5 एक evolutionally संरक्षित homeobox प्रतिलेखन कारक सामान्य हृदय के विकास और जीन परिवर्तन के लिए अपरिहार्य है मानव जन्मजात हृदय रोग (CHD), मानव जन्म 16 सबसे आम दोष के साथ जुड़े हैं . Nkx2.5 की अभिव्यक्ति दिल अग्रदूत साबित कोशिकाओं के लिए सभी अब तक की जांच की रीढ़ में जल्द से जल्द मार्कर है और उचित हृदय दो भागों में विभाजित और गठन / विद्युत प्रवाहकत्त्व 16 प्रणाली की परिपक्वता के लिए आवश्यक है. रीढ़ में, और जल्दी Nkx2.5 अभिव्यक्ति की शुरुआत पैटर्न लगभग समय और जल्दी embryogenesis में हृदय विनिर्देशन के क्षेत्र के साथ मेल खाना, और Nkx2.5 जीन 16 दिल में विकास के माध्यम से व्यक्त किया जा रहा है. हमारे hESC मॉडल में गुटनिरपेक्ष आंदोलन हृदय विशेष transcri की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने के द्वारा pluripotent hESCs से हृदय प्रत्यक्ष प्रेरण ट्रिगर दिखाईption एक प्रक्रिया है कि मानव भ्रूण कार्डियोजेनेसिस में pluripotent आद्यबहिर्जनस्तर से cardiomesoderm के विनिर्देशन का अनुकरण सकता है में कारक Nkx2.5. भविष्य के अध्ययन के विकल्प के रूप में मानव हृदय के विकास में आनुवंशिक और epigenetic नियंत्रण अणुओं, प्रकट होगा जो छोटे अणु की मध्यस्थता प्रत्यक्ष और hESC pluripotent भाग्य के नियंत्रण मॉडुलन के लिए मार्ग प्रशस्त जब पुनर्योजी उपचार के लिए नैदानिक ​​प्रासंगिक प्रजातियों पाने सकता है. गुटनिरपेक्ष आंदोलन उपचार के बिना, <2% hESCs 12-15 cardiomyocytes की धड़कन में सहज भेदभाव से गुजरना होगा. गुटनिरपेक्ष आंदोलन के उपचार के साथ, हम 95>% भ्रूण हृदय एक प्रक्रिया है कि मानव भ्रूण दिल विकास 12 का अनुकरण सकता है में एक संस्कृति को परिभाषित के तहत बनाए रखा hESCs से व्यापारियों और> 50% पिटाई cardiomyocytes उत्पन्न करने में सक्षम किया गया है. हाल ही में, जाना जाता भाग्य हृदय निर्धारण जीन <0.5 17%, 18 के एक कम क्षमता के साथ प्रसवोत्तर पिटाई cardiomyocytes में माउस fibroblasts transdifferentiate इस्तेमाल किया गया है </> समर्थन. हालांकि, reprogrammed दैहिक कोशिकाओं ऐतिहासिक असामान्य जीन अभिव्यक्ति और बिगड़ा चिकित्सीय उपयोगिता 19-21 के साथ त्वरित senescence के साथ संबद्ध किया गया है है. अंत में, हम यहाँ स्थापित प्रोटोकॉल pluripotent भीतर सेल (ICM) जन या मानव 4,5 ब्लास्टोसिस्ट की आद्यबहिर्जनस्तर से प्राप्त hESCs के लिए सीमित है, पशु उत्पन्न ESCs, पहले morula से व्युत्पन्न ESCs सहित अन्य pluripotent कोशिकाओं, के लिए लागू नहीं हो सकता (आठ सेल) चरण 22 भ्रूण, और कृत्रिम reprogrammed कोशिकाओं 23.

Disclosures

लेखकों को प्रतिस्पर्धा हितों घोषणा. XHP Xcelthera के संस्थापक है. XHP और EYS hESCs के लिए संबंधित बौद्धिक गुण है.

Acknowledgments

XHP से एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान (NIHK01AG024496) और Eunice कैनेडी बाल स्वास्थ्य और मानव विकास की श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट (NIHR21HD056530) स्वास्थ्य (NIH) के अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Matrigel BD Biosciences 356231 Growth factor reduced
Human laminin Sigma-Aldrich L6274
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
DMEM/F12 Invitrogen 10565042
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Knock-out serum replacement Invitrogen 10828028
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM amino acids solution(MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-Mercapt–thanol Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human transferrin Sigma-Aldrich T8158
Human bFGF PeproTech Inc AF-100-18B
Human insulin Invitrogen 12585014
Human activin A PeproTech Inc 120-14E
Defined FBS Hyclone SH30073-03
6-well ultralow attachment plate Corning 3471
6-well plate Corning 3516

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References

  1. Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
  2. Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
  3. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
  4. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
  5. J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282-1145 (1998).
  6. Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
  7. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
  8. Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
  9. Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
  10. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  11. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
  12. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
  13. Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  14. Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  15. Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
  16. Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
  17. Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  18. Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
  19. Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
  20. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  21. Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
  22. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
  23. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).

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    ²00²,I left Biocarta to work at ITRI Research Institute at Taiwan,
    Early Oct My mother pass away at San Diego, End of Oct,
    I participated running exercise at ITRI, I fall down, I saw my
    mother, She told me " It is not the time for you to come here,
    go back!" I also saw my brother in law, two uncles, and
    grandma! Few days later, I was moved to major hospital at Taipei!
    One night, I waked up, and knell down against the window,
    my wife ask me "What you doing?" I told her , I saw Jesse!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2011 - 11:43 AM

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