تسجيل على نطاق واسع اطقم متعلق بالخلايا العصبية مع مجسات للسيليكون في الجرذ خدر

Neuroscience
 

Summary

وسيتم وصف التسجيلات خارج الخلية من نشاط الخلايا العصبية باستخدام مسابر السيليكون في الفئران تخدير. هذه التقنية تتيح الحصول على معلومات في مناطق متعددة من الدماغ أكثر من 100 خلية عصبية في نفس الوقت. ويوفر المعلومات مع قرار خلية واحدة عن الفرق العصبية المحركة في الدوائر المحلية متعددة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat. J. Vis. Exp. (56), e3282, doi:10.3791/3282 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التسجيلات الكهربية كبيرة الحجم من الفرق العصبية تتيح الفرصة لمعرفة كيف ينظم الدماغ على تشكيلة واسعة من السلوكيات الناتجة عن نشاط الخلايا العصبية في ارتفاعه. أحد الأساليب الأكثر فعالية لمراقبة النشاط المتصاعد من عدد كبير من الخلايا العصبية في دوائر متعددة في وقت واحد العصبية المحلية باستخدام صفائف الكهربائي السيليكون 1-3.

امكانات انتاج عمل تغييرات كبيرة الجهد عبر الغشاء في محيط somata الخلية. ويمكن قياس هذه الإشارات الانتاج من خلال وضع موصل على مقربة من الخلايا العصبية. إذا كان هناك العديد من النشطة (ارتفاعه) الخلايا العصبية في المناطق القريبة من الحافة ، القطب السجلات إشارة المشترك من كل منهم ، حيث من المرجح مساهمة عصبون واحد ل 'المسافة الكهربائية لعملائها. تحقيقات السيليكون هي مثالية لأقطاب تسجيل رصد الخلايا العصبية متعددة بسبب وجود عدد كبير من المواقع تسجيل (+64) والحجم الصغير. Furthermoإعادة ، ويمكن ترتيب عدة مواقع على مسافة ملليمترات ، وبالتالي السماح للتسجيلات المتزامن للنشاط الخلايا العصبية في الطبقات القشرية المختلفة أو في أعمدة متعددة القشرية (الشكل 1). الأهم من ذلك ، على توزيع دقيق هندسيا من المواقع تسجيل يسمح أيضا لتحديد العلاقة المكانية من 4 الخلايا العصبية واحدة معزولة. هنا ، نحن تصف حادة ، على نطاق واسع تسجيل العصبية من القشرة الحسية الجسدية اليسار واليمين في وقت واحد forelimb تخدير الفئران مع تحقيقات السيليكون (الشكل 2).

Protocol

1. التحضير لعملية جراحية

  1. تخدير الفئران مع نوع المناسبة وجرعة من المسكنات. هنا نستخدم يوريتان (1.5 جم / كجم ، سيغما الدريخ شركة ، وسانت لويس ، MO) -- سوف أعد حل 20 ٪ من 20 غراما من تمييع يوريتان في 100 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أي حيوان تتلقى 7.5 مل / كغم من يوريتان حل intraperitonealy (IP). بسبب منحنى الجرعة والاستجابة لها ، يتم تقسيم الجرعة الإجمالية إلى أربعة يوريتان في التطبيقات ، مفصولة كل 30 دقيقة تقريبا. قبل التطبيقات الأولين من يوريتان ، مع تخدير الحيوان isoflurane تديرها بتركيز 3-4 ٪ (الأوكسجين في 2 لتر في الدقيقة الواحدة) ، وحافظت على 2 ٪ (الأكسجين تصل إلى 2 لتر في الدقيقة) لمنع الحيوانات من وشدد الحصول عن طريق الحقن. أثناء الجراحة ، يمكن استخدام إدارة إضافية من isofluorane (تركيز 2 ٪ لمدة 2 دقيقة) إذا لزم الأمر.
  2. حلق الفراء على طول موقع الشق (الجانب الظهري للرأس) لضمانوالفراء وسوف لن تلوث الجرح والتي يمكن تطهير منطقة كافية حول موقع شق.
  3. تحضير موقع الجراحة باستخدام اليود antiseptically العضوي أو الكلورهيكسيدين الصابون والمطهرات (الايثانول).
  4. إعداد تحقيقات السيليكون (NeuroNexus تكنولوجيز ، آن آربر ، MI). ويمكن تطهيرها باستخدام مسابر الايثانول 70 ٪ تليها الشطف بالماء المقطر. إذا لزم الأمر ، يمكن رسمها تحقيقات مع علامة فلوري أعد antiseptically (على سبيل المثال أنا الصبغ ، Invitrogen شركاه) ، لتكشف في وقت لاحق موقف لجنة التحقيق في التحليل النسيجي. للقيام بذلك نستخدم فرشاة الدهان الصغيرة والناعمة جدا واللمس بدقة الجزء الخلفي من السيليكون التحقيق مع الصبغة. وينبغي دائما أن يتم هذا الإجراء خلال المجهر للتأكد من عدم التحقيق التلف أو منحنية. الاختيار دائما للتأكد من أن الصبغة لا يحظر أي من القنوات. يمكن أن يكون أي صبغة المتبقية الأيسر على تحقيق إزالتها في وقت لاحق مع الكحول ، تليها الشطف بالماء.
  5. السيليكون electrodوفاق الرعاية : ونظرا لصغر حجمها ، السيليكون تحقيقات حساسة للغاية وعرضة للكسر حتى عند استخدامه مع رعاية كبيرة. وبالتالي ، فإننا نوصي رصد المخاطر المحتملة في كل الأوقات ، مثل : (ط) حافظ على تحقيقات في خانة معينة بشكل مناسب ، (ب) منع تحطمها أو إسقاط تحقيقات عند التعامل معها ، (ج) تأكد من أن يتم إصلاح جيدا المتلاعبين التجسيمي لمنع أي حوادث ، (د) عند التسجيل ، والأنسجة المحيطة و / أو الدم يمكن أن نعلق على التحقيقات. ولذلك ، فمن المهم أيضا أن نكون حذرين عند إزالة التحقيقات بعد التسجيل. باستخدام تدفق مستمر من محلول ملحي أو برنامج تلفزيوني ينصح بشدة ، (ت) نظيفة دائما تحقيقات بعد التسجيل. لتنظيف التحقيقات ، فمن المستحسن أن يغرق منهم في نظافة الأنزيمية السائل (بوسطن ، بوش ولومب) لبضع دقائق. شطف دائما تحقيقات مع الماء المقطر وإعادتها إلى مربع تفانيهم. في تجربتنا ، والرعاية الكافية للتحقيقات السيليكون يضمنالتسجيلات ذات نوعية جيدة لأكثر من 10 تجربة. إذا كانت قناة "يحصل صاخبة' أثناء الاستخدام ، ينبغي استبعادها من تحليلات لاحقة. لقد وجدنا أن عبر الحديث بين القنوات هو الحد الأدنى ، ولذلك فإن القناة الصاخبة عادة تأثير قليل جدا على الإشارات في القنوات الأخرى.

2. عملية جراحية

  1. تطبيق مرهم العين على سطح العين قبل أي تلاعب الجراحة.
  2. إدارة ديكساميتازون 5 ملغ / مل تحت الجلد للحد من التهاب الدماغ.
  3. إصلاح الإطار الحيوانية في جميع أنحاء التجسيمي جراحة.
  4. إدارة يدوكائين 2 ٪ مع حمض الهيدروكلوريك ادرينالين (2-4 مغ / كغ المخفف لمحلول 0.5 ٪) تحت الجلد في موقع شق قبل أن يتم إجراء شق للحد من المخاطر المحتملة من نزيف الجرح ولتخدير موضعي.
  5. جعل شق 2 سم عن طريق خط الوسط فروة الرأس والجلد تهجير أفقيا لفضح سطح الجمجمة.
  6. مسح فروة الرأس من اللفافة الظهرية بالتسليخ الكليل والسيطرةالنزيف بواسطة microcautery أو باستخدام الشمع العظام.
  7. جعل حفر ثقوب اثنين إلى نعلق مسامير صغيرة في العظم القذالي من الجمجمة لأسس ومرجعية الحيوانية. يجب أن تكون الإشارة المسمار في اتصال مع الجافية. من أجل الحد من الضجيج الكهربائي خلال التسجيلات ، فمن المستحسن أن تبقي مسامير الرطب في جميع الأوقات. للقيام بذلك ، يمكن بناء الجدار الصغيرة المحيطة الاكريليك المسامير أو يمكن تغطية مسامير مع آغار.
  8. جعل مم 1-2 حج القحف في الإحداثيات المقابلة لمنطقة القشرية و / أو تحت القشرية (ق) من القروض 5. استخدام الهواء المضغوط لإزالة الغبار العظم حسب الحاجة خلال حج القحف (حفر حفرة). منع الجمجمة الاحماء من الحفر عن طريق تطبيق قطرات من برنامج تلفزيوني. جعل حج القحف الثاني إذا هناك حاجة لادخال لجنة التحقيق الثانية. في هذا الفيديو ، ونحن نقدم لتسجيل اثنين من المناطق القشرية في وقت واحد ، وعليه فإن صنع هدفين craniotomies.
  9. بناء حاجز صغير من راتنج الأكريليك (على سبيل المثال : لانج الأسنانالصناعة التحويلية ، شركة ، شركة ، Wheeting ، IL) المحيطة craniotomies اثنين في أجل الحفاظ على برنامج تلفزيوني على رأس الجافية المكشوفة ، ومنعها من الجفاف. تطبيق برنامج تلفزيوني باستمرار خلال التجربة بأكملها.
  10. فتح هذه المسألة من كلا craniotomies الجافية. ويمكن استخدام اثنين من الإبر (30 ½ قياس) محني على نصائح (تشكيل هوك) ، لهذا التلاعب.
  11. إرفاق موصل للتحقيقات السيليكون إلى manipulatiors التجسيمي. وترد وصلات إلى القطب من أجل الحصول على السيقان من تحقيقات موازية تماما لتتلاعب التجسيمي. هذا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على التسجيلات مستقرة وتجنب الضرر التحقيق.
  12. ربط المسمار اشارة الى المرجع السيليكون دبوس التحقيق. للحد من الضوضاء الكهربائية مسامير الأرض يجب أن تكون متصلا : ط) في الميدان من سد العجز التحقيق ؛ الثاني) الأرض الشاسيه من جهاز تسجيل ، والثالث) الإطار التجسيمي.
  13. مكان غيض من تحقيقات السيليكون فقط في اتصال مع الحنون.
  14. أعرض ببطء عشرتحقيقات السيليكون الإلكترونية وتأكد من أنه يمكن إدراج السيقان للتحقيقات السيليكون (الشكل 1 و 2) في الدماغ من دون مقاومة أو الانحناء.
  15. انخفاض بعناية حتى تصل التحقيقات المطلوبة منطقة التسجيل. إذا لزم الأمر ، إضافة قطرات من برنامج تلفزيوني على رأس craniotomies لتجنب جفاف الأنسجة.
  16. يجب فقط لأن التخدير يوريتان تستعمل لإجراءات المحطة ، هو الموت الرحيم للحيوان عن طريق حقن الملكية الفكرية على الأقل من الصوديوم 200mg/kg بنتوباربيتال المخفف لتركيز ما لا يزيد عن 60 ملغ / مل. ويتبع ذلك عن طريق قطع الرأس من الحيوان.

3. ممثل النتائج :

موضحة التسجيلات ممثل امكانات الحقل المحلية والنشاط المتصاعد في الشكل 3A. بعد أداء ارتفاع الفرز (التمييز النابعة من المسامير الخلايا العصبية المختلفة ؛ الشكل 3B ، C ، 6 ، 7 ، 8) السيليكون تسجيلات التحقيق توفير القدرة على التحقيق في نشاط الخلايا العصبية في السكان المعنيين ، وأنااونج الأخرى ، والعمليات التالية : الذاكرة واتخاذ القرارات 9 ، 10 اللدونة ، التحفيز الترميز 11 ، 12 النشاط العفوي والآثار من مختلف انواع المخدرات 13.

الشكل 1
الشكل 1. تم تركيب ألف مثال لتحقيق السيليكون مع ساق واحد على المونتاج بناؤها من الخلايا العصبية (المجاملة ساكاتا S. 14). باء مثال على التحقيق مع تكوين tetrode في كل من السيقان 8. جيم تخطيطي لل فأر في الجمجمة. المربعات الخضراء تمثل مدى حج القحف على القشرة الحسية الجسدية اليمين واليسار.

الشكل 2
الشكل 2. مثال على التجربة مع تحقيقات السيليكون إدراجها في قشرة الفص الجبهي والحصين. قطرات من برنامج تلفزيوني تغطية حج القحف لحماية ر يتعرضالعين من الجفاف. وسيتم ربط اثنين من المسامير الموجودة على أرض الواقع والمخيخ إلى مرجع ، على التوالي.

الشكل 3
الشكل 3. ألف صورة تظهر 500ms من تسجيل الكهربية ممثل الميدانية المحتملة المحلي (LFP) من أحد tetrode (ملاحظة : يتم رسم الجهد سلبية حتى على تنسيق). ويبين إدراج -- أ الموجي من ارتفاع باء ثنائي الأبعاد آراء الكتل وحدة في الفضاء ميزة من 1 tetrode. ويمثل كل مجموعة من المسامير وحدة واحدة (الخلايا العصبية). جيم ارتفاع متوسط ​​الطول الموجي من وحدات ممثل (لون مشفرة) في كل موقع من المواقع من تسجيل four tetrode واحد. D. الموجي الطاقة (المرتبطة السعة) من المسامير المسجلة على مر الزمن . لاحظ قيم ثابتة نسبيا الطاقة لكل وحدة ، وهذا يشير إلى وجود تسجيل مستقر خلال مدة الفترة المعروضة.

Discussion

هذه الورقة يوضح كيفية استخدام صفائف الكهربائي السيليكون لسجل من عدد كبير من الخلايا العصبية (> 100) في مناطق متعددة في وقت واحد القشرية. من أجل أن تكون ناجحة في جراحة وتسجيل ، ينبغي النظر في المسائل التالية :

  1. مقدمة للتحقيقات إلى المنطقة المرغوبة : عند إدراج تحقيقات في أنسجة المخ ، فمن الممكن أن يسبب ضررا كبيرا. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تدني نوعية الوحدات المسجلة. لتجنب هذه المشكلة ونحن نوصي بما يلي : (ط) وضع التحقيقات في زاوية درجة معينة (وأوصت لاستخدام زاوية 10 درجة). من خلال ذلك ، يمكن تقليل الاضرار التي تلحق شجيري من الخلايا العصبية المسجلة ، (ب) بعد أن يتم إدخال المجسات في أنسجة المخ ، وخفضت في البداية انهم بمعدل أسرع (بحوالي 50 إلى 100 ميكرون في 10-30 ثانية) حتى يحصلوا على أقرب إلى المنطقة المرغوبة للتسجيل. عندما تحقيقات ما يزيد عن 200 ميكرون من المنطقة المستهدفة ، ويتم ضبط الموقف ببطء أكثر (تقريباimately 10 ميكرون كل دقيقة 2 أو 3).
  2. استقرار التسجيلات : عندما تحقيقات في المنطقة المعينة ويتم الكشف عن نشاط واسع (طفرات متميزة في معظم القنوات) ، فمن المستحسن أن تنتظر حوالي 30 دقيقة قبل بدء التسجيل. هذا سيسمح لتحقيق الاستقرار في أنسجة الدماغ ميكانيكيا بعد الإدراج تحقيقات وضمان تسجيل أكثر استقرارا.
  3. نبض الدماغ : في بعض الأحيان من الممكن أن نرى نبض الدماغ التي يمكن أن تقلل بشكل كبير من جودة التسجيل. ويمكن لحج القحف الصغيرة (مساحة كافية فقط لتتناسب مع لجنة التحقيق) الحد من نبض الدماغ في منطقة التسجيل. إذا لزم الأمر ، يمكن بثقب صهريج ماجنا. هذا يقلل من ضغط السائل النخاعي ويقلل التورم ونبض.
  4. السيليكون التحقيق التكوين : تحقيقات السيليكون يمكن أن يكون لها مجموعة متنوعة من الأشكال والتكوينات موقع التسجيل. على سبيل المثال ، يمكن أن تختلف في عدد السيقان ، وطول وسمك السيقان ، وفيترتيب المواقع تسجيل (مثل التكوين مقابل tetrode الخطية ، انظر : www.neuronexustech.com). اختيار التحقيق المستخدمة مع تكوين محدد يعتمد على مسألة علمية تحتاج إلى إجابة. على سبيل المثال ، إذا كان الهدف من ذلك هو لتسجيل السكان من الخلايا العصبية في مواقع متعددة في طبقة واحدة محددة (كما وردت في هذه التسجيلات) ، فإن أفضل خيار هو استخدام التحقيق مع ثمانية من السيقان وتكوين tetrode. وهذا يسمح للتسجيلات واحدة من وحدات متعددة في كل tetrode وأخذ عينات من ثمانية مواقع عبر فترة 1.4mm. في مثال آخر ، اذا كان شخص ما أود أن الدراسة التوليدات النشاط عبر الطبقات القشرية ، فإن أفضل خيار هو استخدام التحقيق مع أحد عرقوب مع مواقع موزعة بانتظام على طول تسجيل عرقوب الذي يسمح بأن التسجيل في الطبقات القشرية متعددة في وقت واحد 14.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل وNSERC AHFMR. الكتاب مريم أشكر Alaverdashvili وأماندا Mauthe قدورة ، للتعليق على المخطوطة ويامازاكي Hiroe للمساعدة على التحضير لعملية جراحية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma-Aldrich
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Isoflurane Benson Medical Instruments 02241315
Silicon probes NeuroNexus Technologies A 4 X 2 - Tet - 5mm - 150 - 200 – 312
Dye I (DiIC18(3)) Invitrogen 617830
Dexamethasone 5 Vétoquinol 0A0640B
Eye ointment Vétoquinol 005165414
Lidocaine HCl 2% with Epinephrine Bimeda-MTC 00141984
Stereotaxic Frame Kopf Instruments 1430-B
Electrode manipulator and holder Kopf Instruments 960
Rat ear-bars Kopf Instruments 1955
Rat adaptor Kopf Instruments 920
Anaesthesia mask Kopf Instruments 906
Scalpel Roboz Surgical Instruments Co. RS-9843
Scalpel blades Paragon 0086
Micro dissecting scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5910
Screws Gould Pasteners Limited 14084701
Hemostatic forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-7130 RS-7211
30½ gauge needles BD Biosciences 305115
Micromotor control Foredom HP4-917
Dissecting forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5237
Bone wax Lukens M263500
Compressed air bottle Falcon BD 50-10521C
Enzymatic cleaner Bausch and Lomb BAUSCH497628
Distilled water
Dental acrylic powder Lang Dental 1220
Dental acrylic liquid Lang Dental 1404
Digital Lynx SX System Neuralynx Inc. 4SX-Z400
Cheeta Softwere Neuralynx Inc.
Alligator cables

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat. Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  2. Kipke, D. R. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J. Neurosci. 28, 11830-11838 (2008).
  3. Csicsvari, J. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J. Neurophysiol. 90, 1314-1323 (2003).
  4. Bartho, P. Characterization of neocortical principal cells and interneurons by network interactions and extracellular features. J. Neurophysiol. 92, 600-608 (2004).
  5. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain: in stereotaxic coordinates. 4th Edition, Academic Press. San Diego. (1998).
  6. Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, R53-R78 (1998).
  7. Harris, K. D., Henze, D. A., Csicsvari, J., Hirase, H., Buzsaki, G. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84, 401-414 (2000).
  8. Luczak, A., Narayanan, N. S. Spectral representation--analyzing single-unit activity in extracellularly recorded neuronal data without spike sorting. J. Neurosci. Methods. 144, 53-61 (2005).
  9. Pastalkova, E., Itskov, V., Amarasingham, A., Buzsaki, G. Internally generated cell assembly sequences in the rat hippocampus. Science. 321, 1322-1327 (2008).
  10. Fujisawa, S., Amarasingham, A., Harrison, M. T., Buzsaki, G. Behavior-dependent short-term assembly dynamics in the medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 11, 823-833 (2008).
  11. Harris, K. D. How do neurons work together? Lessons from auditory cortex. Hear. Res. 271, 37-53 (2011).
  12. Luczak, A., Bartho, P., Marguet, S. L., Buzsaki, G., Harris, K. D. Sequential structure of neocortical spontaneous activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 347-352 (2007).
  13. Robbe, D. Cannabinoids reveal importance of spike timing coordination in hippocampal function. Nat. Neurosci. 9, 1526-1533 (2006).
  14. Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64, 404-418 (2009).

Comments

4 Comments

  1. Nice movie!
    How do you use the fluorescent dye? Isn't it peeled off during insertion? Which dye anyways?
    And another one: Don't you observe dimpling upon insertion?
    How many units do you get on average per site?


    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 8, 2012 - 4:12 AM
  2. How do you use the fluorescent dye? Isn't it peeled off during insertion? Which dye anyways?
    After painting a probe, the dye quickly dries and sticks to the probe. We never observed any peeling during insertion. In fact, after several hours of the recordings, the probes have to be washed with alcohol and distilled water to take the remaining dye off the probe. The dye we use is called DiI (DiIC18(3), Invitrogen Co., Carlsbad, CA, Catalog Number: 617830). Note that in the article we made a spelling mistake; the name of the dye should be "DiI" instead of "Dye I". After the experiment, tissue is processed as for standard Nissl or DAPI staining, and slides are viewed using a fluorescent microscope.

    Don't you observe dimpling upon insertion?
    In order to avoid dimpling, the probes have to be inserted very slowly. If we see any signs of dimpling, we reduce the insertion rate (about 10 or ²0 &#²39;²9;­um every 5 minutes) and apply more PBS to the surface.

    How many units do you get on average per site?
    This depends on the configuration of the probe. Usually the tetrode configuration allows us to obtain more distinguishable units than electrodes with a linear configuration. With the tetrode configuration, usually we are able to obtain about 5-1² well isolated units per tetrode (L5 in sensorimotor cortex). However, for unknown reasons, we sometimes may not have any clusterable units on a tetrode. When recording in other cortical layers or in subcortical structures, the number of recorded units can be lower.

    Reply
    Posted by: Artur L.
    May 24, 2012 - 6:14 PM
  3. I would like to refer to the anesthetic method, thank you!
    By the way, Epinephrine (2-4 mg/kg diluted to 0.5 % solution)...What does it mean?
    Does it mean "make original solution as 2mg of Epinephrine powder per 1kg of PBS
    and further dilute it to 1/200 of original solution"?

    Reply
    Posted by: Mai I.
    March 4, 2016 - 9:10 AM
  4. For example, if you have 0.5 kg rat and use 2mg/kg dosage, and you have a bottle with HCl 2%, then "diluted to 0.5 % solution" would mean that you take 1mg (=1mL) from that bottle and add 3mL of saline (PBS) to dilute 2% to 0.5%. We later (after the paper) used only around 0.3 mL of PBS to reduce injected volume. You can find more details in technical sheet:
    http://www.bimedamtc.com/media/docs/1LID009P_Data_Sheet.pdf

    Reply
    Posted by: Artur L.
    March 6, 2016 - 5:44 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics